明所用的阿须贝培养基的配方为:KH2P04 0.2g/L，MgS04 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaC03 5.0g，甘露醇 10.0g，CaS04 0.lg, pH 7.0，琼脂 20g，蒸馏水 1000mL。
[0032]将筛选出来细菌进行格兰氏染色，然后在显微镜(OLYMPUS BX51)下观测细菌形态并拍照。
[0033]然后用移液枪将培养基中的纯化菌落50 μ L接种到斜面阿须贝固体培养基上，放在培养箱里(30°C )培养三天，然后用乙炔还原法测定固氮酶活性。预实验结果表明加入20%的C2H2时，样品所表现的固氮活性最高，所以本实验中C2H2量占培养容器体积的20%。为了使实验能够和今后同类实验比较，将样品在光照培养箱中培养以保证精确的环境条件。为了使结果更加接近真实值，培养条件模拟研究区夏季的环境条件。培养时间为24h，前16h有光照，同时温度为25°C，后8小时无光照，同时温度为15°C。培养完毕后从锥形瓶中抽取50yL样气，注人已走稳基线的气相色谱仪(日立163型气象色谱仪)中测定乙稀生成量。用乙稀生成量(nmol C2H4/m 2h 描述该固氮菌株的固氮活性，为83.73n mol/μ L.h0
[0034]将表现出然后用16S rDNA序列识别的方法对分离出的具有固氮活性的细菌进行鉴定，过程如下:用苯酚和氯仿提取细菌DNA，用异丙醇溶解，于4°C保存。然后以
1.0 μ 1 (lOpmol/ μ 1) 27f 和 1.0 μ 1 (lOpmol/ μ 1) 1496r 作为引物，1.5 μ 1 细菌 DNA 为模板，加入 0.3 μ L (2.5mmol/L each) dNTPs 和 18.7 μ 1 ddH20，配成 25 μ 1 反应体系。将此进行PCR反应，30个循环，变性、退火和延伸温度分别是94°C、52°C和72 °C，该反应在ABI — 2720仪器上完成。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，样品于-20°C保存。将PCR产物送至华大基因公司测序，将所测序列与NCBI数据库中已报导的模式细菌序列进行相似性比较，本文认为序列相似度大于98%的菌株与模式细菌同种。
[0035]实施例2
[0036]将自生固氮菌MBC4接种于一级斜面培养基中，在30°C培养4天，获得一级菌株；将一级菌株接种于二级液体培养基中，在30°C条件下震荡培养3天，获得二级菌株；将二级菌株接种于三级固体培养基中，在30°C条件下培养在2天后获得三级菌株；将三级菌株与草炭接触混匀后获得菌剂；使得菌剂中自生固氮菌MBC4的含量为2.9X 10scfu/g，菌剂的pH值为7.0。
[0037]其中，所述一级斜面培养基的配方为:KH2P040.2g/L，MgS04 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaC03 5.0g，甘露醇 10.0g，CaS04 0.lg, pH 7.0，琼脂 20g，蒸馏水 lOOOmL ；
[0038]二级液体培养基的配方为:ΚΗ2Ρ04 0.2g/L，MgS04 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaC03
5.0g，甘露醇 10.0g，CaS04 0.lg, pH 7.0，蒸馏水 lOOOmL ；
[0039]三级固体培养基的配方为:甘露醇10.0g，酵母粉1.0g，MgS04.7H20 0.2g，K2HP04
0.5g，NaCl 0.lg, CaCl2 0.05g，Rh 微量元素液 4.0mL, H20 1000mL，琼脂 20g，pH 6.8-7.0。
[0040]所述Rh 微量元素液:H3B03 5.0g，Na3Mo04 5.0g，H20 1000mL。
[0041]实施例3
[0042]将实施例2中制备的菌剂与砂土按照质量比1:10混匀后获得混合物，再将该混合物洒在毛乌素沙地南缘土壤表层，菌剂的用量为用量约为500g菌剂/亩。
[0043]将该菌剂接种在毛乌素沙地南缘无固氮活性的裸沙表面一年之后，其表层可以检测到固氮活性，为1001.60n mol C2H2m 2h、并且土壤有效氮也由3.16mg kg 1增加到了29.lmg kg:0
[0044]毛乌素沙地自然环境条件十分恶劣，主要灾害天气有干旱、紫外线过强、大风、沙暴、干热风、霜冻、冰雹等，不利于动植物和微生物的生存和繁育。毛乌素沙地属于典型中温带大陆性气候，其气候控制因子主要为西北环流，尤其是长时间控制的北方大陆气团，因此昼夜温差较大，且平均气温较低，约为6-7°C;该地区气候干旱，平均降水量大约为280mm，年潜在蒸发量为2100-2500mm，无霜期为128d，绝对无霜期为100d ;风沙灾害严重，主风向为西北风，年平均风速约为2.8m s \最大风速可达15-18m s \当年11月至次年4月多出现大风天，大风日数是45.8d，最多可达52d，年平均沙暴日数为20.6d ;土壤盐碱程度很高，pH为8.7-9.2 ;紫外线非常强烈，尤其夏季紫外线强度高达到200-533 μ W/cm2，辐射指数在8级左右。该菌株的发现和其菌剂的接种效果说明了对于干旱、温差大、风沙、盐碱灾害和强紫外线辐射具有优良的耐受能力，可以有效地增加土壤的氮素输入能力，增加了土壤有效氮含量。尤其，在紫外线辐射强度为70-130 μ W/cm2时，辐射时间从15s到30min不等，杀菌率通常可达99%以上。上述普通灭菌条件的紫外线强度和照射时均明显低于毛乌素沙地南缘夏季野外的紫外线强度和时间，说明了该菌株以及菌剂比之一般的绝大多数细菌具有特殊的高紫外线抗性。
[0045]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1.一种自生固氮菌(Pseudomonasoryzihabitans)MBC4，其保藏号为 CGMCC N0.10820，保藏日期为2015年5月19日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。2.含有权利要求1所述自生固氮菌MBC4的菌剂。3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中还含有菌体吸附材料，所述菌体吸附材料选自草炭、珍珠岩、蛭石粉和微粉碳酸钙中的至少一种。4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述菌体吸附材料为草炭。5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，在所述菌剂中，自生固氮菌MBC4的含量为2.1 X 108-2.9 X 108cfu/g,优选为 2.9 X 108cfu/go6.根据权利要求2-5中任意一项所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的pH值为6.8_7.2 ο7.权利要求2-6中任意一项所述的菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 将所述自生固氮菌MBC4接种于一级斜面培养基中，在28-30°C培养3_5天，获得一级菌株；将所述一级菌株接种于二级液体培养基中，在28-30°C条件下震荡培养2-3天，获得二级菌株；将所述二级菌株接种于三级固体培养基中，在28-30°C条件下培养在1-2天后获得三级菌株；将所述三级菌株与菌体吸附材料按照菌剂中自生固氮菌MBC4的含量为2.1 X 108-2.9X 108cfu/g的配比混匀后获得菌剂； 其中，所述一级斜面培养基的配方为:KH2P04 0.2g/L，MgS04 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaC035.0g，甘露醇 10.0g，CaS04 0.lg，pH 7.0，琼脂 20g，蒸馏水 lOOOmL ； 二级液体培养基的配方为:KH2P04 0.2g/L，MgS04 0.2g/L，NaCl0.2g，CaC03 5.0g，甘露醇 10.0g，CaS04 0.lg, pH 7.0，蒸馏水 lOOOmL ； 三级固体培养基的配方为:甘露醇10.0g，酵母粉l.0g，MgS04.7H20 0.2g，K2HP040.5g，NaCl 0.lg, CaCl2 0.05g，Rh 微量元素液 4.0mL，琼脂 20g，H20 1000mL，pH 6.8-7.0。8.权利要求1所述的自生固氮菌MBC4或权利要求2-6中任意一项所述的自生固氮菌剂在土壤改良中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括将所述菌剂和砂土按质量比1:9-11混合均匀后施用于土壤表面。10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述菌剂的用量为420-560g菌剂/亩。
【专利摘要】本发明公开了一种自生固氮菌(Pseudomonas？oryzihabitans)MBC4，其保藏号为CGMCC？No.10820，保藏日期为2015年5月19日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该菌株在干旱、大温差、盐碱灾害和强烈的紫外线辐射下依然能够生存繁殖并具有固氮活性。其制成的菌剂能够施用于干旱、大温差、盐碱灾害和高紫外线辐射的生态系统，并且能够增加这些生态系统的氮素积累，可以起到改良土壤环境的作用，提高微生物和植物的生理活性，增加净初级生产力。CGMCC No. 1082020150519
【IPC分类】C09K17/00, C12N1/20, C12R1/38, C09K105/00
【公开号】CN105400715
【申请号】CN201510857725
【发明人】张宇清, 邵晨曦, 秦树高, 冯薇, 吴斌
【申请人】北京林业大学
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年11月30日