/mL，优选300U/mL。
[0048]根据本发明的【具体实施方式】，所述从新鲜脐带离体组织中分离和提取间充质干细胞的方法包括以下步骤:
[0049](1)样本的采集与运输:无菌采集自然分娩或剖宫产的健康新生儿脐带样本，放入脐带保存运输液中，冰上运输；
[0050](2)样本的清洗和消毒:将新鲜脐带样本放入50ml无菌离心管中，75%酒精冲洗
2-3遍，再用无菌生理盐水冲洗3-5次；
[0051](3)脐带组织的预处理:用眼科剪将脐带剪成2-3cm长短左右小段，用镊子除去血管中淤血，每段用眼科剪纵向剖开，用止血钳剔除两条动脉和一条静脉，钝性分离外层羊膜组织置于50ml离心管，加2-5倍体积PBS缓冲液，轻微摇晃清洗；
[0052](4)红细胞裂解液处理:将外层羊膜组织重新分别转移至洁净无菌的100mm培养皿，剪成1-3_3大小组织块；将肉糜状脐带组织块重新转移至离心管，分别重新加入1.5-2倍组织块体积的红细胞裂解液；室温处理2分钟，离心收集组织块；PBS缓冲液清洗2-3次。
[0053](5)原代培养:将外层羊膜组织的组织块均匀铺在100mm培养皿，覆盖70%皿底面积，每皿加10ml间充质干细胞无血清培养基，放入C02浓度为5%的37°C恒温培养箱进行培养，培养至3-5天时将平皿从培养箱中移出，半量更换新鲜培养基，继续培养；在7-10天，待组织块下均匀爬出细胞，去掉组织块全量换液继续培养；此后每3天进行一次换液；
[0054](6)取步骤(5)中培养上清，检测以下项目:甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、人类免疫缺陷病毒、支原体、衣原体、内毒素；
[0055](7)细胞传代:待平皿内贴壁细胞汇合率达30-70%左右时，胰酶消化，离心去上清收集细胞，再接种于细胞培养瓶继续进行传代培养，直至汇合率达80-90 %，收集细胞备用、冻存或继续进行传代培养；
[0056](8)针对步骤(7)所得的脐带间充质干细胞，检测以下项目:分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染、增殖特性。
[0057]上述方法中，所述样本为新鲜脐带组织。
[0058]上述方法中，所述间充质干细胞培养基为无血清培养基，包含0.1体积份的β -巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸、10体积份的血清替代物、89体积份的a-MEM/DMEM-F 12和终浓度为10ng/ml的b-FGF。
[0059]所述红细胞裂解液为包含5-10g/L的NH4C1和0.lmmol/L Na2_EDTA的水溶液，pH为7.2-7.4，过0.22 μ m微滤膜，平衡至室温使用。
[0060]并且步骤(7)中，所述胰酶浓度为0.125%，消化时间为1-2分钟，消化过程中轻拍培养皿或培养瓶侧壁。
[0061]另一方面，本发明还提供通过上述方法获得的间充质干细胞。
[0062]优选地，所述间充质干细胞具有以下特征:
[0063](1)粘附于塑料培养器皿成梭形旋涡状生长；
[0064](2)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105 和 HLA-ABC 的阳性比例大于 99.0% ;CD45、CD34和HLA-DR的阳性比例小于1.0% ;
[0065](3)体外可诱导分化为成骨细胞和成脂细胞；
[0066](4)活细胞检测比率达99 %以上；
[0067](5)呈典型的“S型”生长曲线特性；
[0068](6)表达多能性基因，所述多能性基因为选自SSEA-4、0CT_4、NAN0G和S0X-2中的一种或多种。
[0069]又一方面，本发明提供所述红细胞裂解液和/或所述间充质干细胞无血清培养基在制备用于分离培养间充质干细胞的试剂中的用途。
[0070]再一方面，本发明提供一种用于分离培养间充质干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括本文所述的红细胞裂解液和/或所述间充质干细胞无血清培养基。
[0071]细胞活力状态是间充质干细胞最重要的质控指标。然而，在脐带间充质干细胞的分离提取过程中，红细胞的干扰是影响脐带间充质干细胞质量和数量的重要因素，大量红细胞的存在使得间充质干细胞的生长空间受限，同时影响干细胞的活力状态，对脐带间充质干细胞分离提取与开发利用造成了很大的影响。
[0072]本发明将红细胞裂解液用到脐带间充质干细胞的提取方法上，可以明显改善在脐带间充质干细胞原代培养中的红细胞干扰。具体地，在原代培养过程中，采用红细胞裂解液进行处理，避免了红细胞对间充质干细胞的移出、贴壁及增殖的干扰，确保了间充质干细胞分离成功率，提高了细胞纯度，在保证脐带间充质干细胞的临床级数量要求的同时，更保证了细胞的活力状态，为后续传代培养、冻存复苏乃至临床应用提供了大量而富有活性的间充质干细胞，有利于干细胞的未来临床转化应用。
[0073]此外，本发明将红细胞裂解液的使用与无血清培养体系相结合，确保脐带间充质干细胞的提取成功率和细胞纯度，从而为目前脐带间充质干细胞存储、后续临床应用工作提供稳定服务。该培养基无血清组分，且组成明晰，避免了在培养细胞培养过程中因血清批次差异导致细胞生长过程不稳定的情况，也排除了传播异种病原体危险的可能。
[0074]并且，本发明的方法操作简单易行，缩短了原代培养时间。
[0075]经流式细胞仪测定，经活力检测、分化能力鉴定以及多能性基因分析，通过本发明方法获得的间充质干细胞活率高，纯度高，分化能力强，建立的细胞库可直接用于科学研究和临床辅助治疗。
【附图说明】
[0076]以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中:
[0077]图1是在培养基组成筛选过程中的细胞图，其中图1A为低浓度血清替代物培养基接种48小时后细胞形态，图1B为高浓度血清替代物培养基接种24小时后细胞形态，图1C为低浓度bFGF培养基接种24小时后细胞形态，图1D为高浓度bFGF培养基培养细胞在传代后细胞形态。
[0078]图2为所培养的脐带间充质干细胞细胞形态，其中图2A为原代细胞组织块中的细胞刚爬出形态，图2B为传代后培养的成纤维状细胞形态，图2C为不使用红细胞裂解液进行间充质干细胞分离，细胞刚爬出时的细胞形态。
[0079]图3 (3A至31)为获得的脐带间充质干细胞经流式细胞仪分析细胞表面分子的结果，显示所述脐带间充质干细胞表达⑶29、⑶44、⑶73、⑶90、⑶105、HLA-ABC，阳性比例大于99.0% ;不表达CD45、CD34、HLA-DR，阳性比例小于1.0%。
[0080]图4为V1-Cell细胞活力分析仪对获得的脐带间充质干细胞的细胞活力、生长特性分析，其中图4A为所述脐带间充质干细胞的实时活力分析，图4B为所述脐带间充质干细胞的生长曲线，图4C为所述脐带间充质干细胞的直径分布图。结果表明上述脐带间充质干细胞的活性在99.7 %以上，细胞直径分布在9-15 μ m，成梭形旋涡状生长的脐带间充质干细胞消化后具有完整圆度，并且具有潜伏期、对数增长期、平台期的增殖特性。
[0081]图5为获得的脐带间充质干细胞向成骨细胞的定向诱导分化，其中图5A为茜素红与成骨过程的钙结节发生显色反应产生的深红色化合物，图5B为所述脐带间充质干细胞成骨胞标志基因0ΡΝ在分化前后的差异表达，其中Μ泳道为核酸分子量标准，1、4泳道为内参基因β -Actin，2、3泳道为成骨标志基因0ΡΝ在诱导分化前后变化。
[0082]图6为获得的间充质干细胞向成脂细胞的定向诱导分化，其中图6A为油红0对成脂细胞的脂肪泡特异性着色，图6B为所述脐带间充质干细胞成脂胞标志基因PPAR- γ在分化前后的差异表达，其中Μ泳道为核酸分子量标准，2、4泳道为内参基因β -Actin, 1、3泳道为成脂标志基因PPAR-γ在诱导分化前后变化。
[0083]图7为获得的脐带间充质干细胞多能性基因在转录水平的RT-PCR分析，其中Μ为核酸分子量标准，1为内参基因β -Actin, 2为NAN0G，3为0CT-4，4为S0X-2，5为SSEA-4。
【具体实施方式】
[0084]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0085]未注明具体条件的，按照本发明所属领域的常规条件或仪器试剂供应商的建议条件进行；为注明商购来源的，为可以市售购得的常规产品。
[0086]实施例1间充质干细胞无血清培养基组成的筛选
[0087](一)血清替代物的含量筛选
[0088]受试培养基:0.1体积份的β -巯基乙醇，10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF, Peprotech公司)，1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140,Gibco公司)，1、2、5、8、
10、12、15或20体积份的Knockout FBS血清替代物(10828-028，Gibco公司)，89体积份的 a-MEM0
[0089]在生物安全柜内，取分离于自然分娩新生儿脐带华通式胶组织的第3代的hUC-MSC，以2X 104个细胞八1112密度接种于了75细胞培养瓶，加12_15ml常规市售培养基培养细胞。培养并观察细胞已完全贴壁后，更换15mL受试培养基。观察细胞生长情况。
[0090]结果:在培养基中分别含1、2、5体积份血清替代物的三个浓度组中，细胞增殖缓慢，在接种24小时后观察细胞，hUC-MSC部分细胞聚集，细胞扁平，折光率差，汇合度达20%左右，接种48小时后观察细胞，hUC-MSC细胞明亮，达60%左右汇合后，基本停止增殖(见图1A);在培养基中分别含8、10、12体积份血清替代物的三个浓度组中，细胞生长状态良好，在接种24小时后观察细胞，hUC-MSC呈梭形旋涡状聚集，伸展度高，细胞明亮，汇合度达40-60%，接种48小时后观察细胞，hUC-MSC细胞明亮，达90%以上汇合；在培养