发酵液中厌氧菌的 各个条件，包括碘海醇的溶液密度和体积、离心时间、发酵液体积和稀释倍数等，提高了菌 体的回收率，可达76.5%-78%，本申请所达到的显著的效果对于本领域技术人员来讲是无 法预知的，更不是显而易见的，本申请的技术方案与现有技术相比是具备明显先进性的。
[0031] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0032] 本发明用分层离心的方法使发酵残余物与菌体分离，大大改善了传统荧光原位杂 交镜检的效果，菌体计数更加准确，并且本发明公开了优化的荧光原位杂交的试验条件，从 而使探针与相应菌体中的核酸杂交效果提高，荧光显微镜下观察有清晰明亮的图像。
【附图说明】
[0033]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0034]图1为激光共聚焦显微镜观察到的样品图片；
[0035] 其中，a中绿色代表古细菌;b中红色代表八叠球菌;c中蓝色代表细菌和八叠球菌； d中为白色为八叠球菌，绿色为其他的产甲烷菌，蓝色为细菌。
【具体实施方式】
[0036]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。
[0037] 实施方法 [0038]第1步试样分层固定
[0039] ①10mL消化试样与40mL 1 XPBS混合，N2/C02-80/20(v/v% )充气下，搅拌1分钟；
[0040]②2mL离心管加入lmL稀释的试样；
[0041] ③用针头和注射器，慢慢注入lmL碘海醇溶液至离心管底部；
[0042] ④离心分离（13000rpm，30min);
[0043] ⑤用干净的吸管收集1-3层的上清液至小烧杯(离心管从顶部至底部有4层:第1层 为上清层，第2层为微生物层，第3层为碘海醇溶液层，第4层渣层），加1 X PBS至约12mL，分注 至6个新的2mL离心管；
[0044] ⑥将所述用1 XPBS清洗2次，离心分离（13000rpm，4min)，最后合并成一管；
[0045] ⑦在通风橱添加1XPBS 0.3mL和0.9mL 4%的多聚甲醛；
[0046] ⑧4°C固定3-4小时；
[0047]⑨在通风橱用1 X PBS清洗3次；
[0048] ⑩添加 lmLl XPBS和lmL冰冷乙醇，-20°C保存。
[0049]第2步试样稀释超声波分散处理 [0050]①取保存的适量稀释；
[0051 ] ②在15mL试管中，用1000mg/L的Na5P3〇 1Q稀释试样，使Na5P3〇1Q的最终浓度达到 400mg/L；
[0052] ③超声波分散处理3min。
[0053] 第3步载玻片上污泥固定脱水
[0054] ① 5-10yL稀释试样滴至载玻片孔上，46°C干燥15min;
[0055] ②8yL琼脂糖溶液滴至载玻片上，通风柜干燥30min;
[0056] ③60%，80%，100% 乙醇（冰冷)脱水各30min;
[0057] ④46°C数分钟干燥。
[0058] 第4步杂交
[0059] 4.1杂交液的配制
[0060] 按照FA浓度配制杂交液(见表1)，一块载玻片准备lmL杂交液。
[0061 ] 表1. lmL不同FA浓度的杂交液配置(单位:μυ
[0062]
[0063] 4.2杂交环境的准备
[0064] ①杂交环境46°C;
[0065] ②纸卷成细长条，放入50mL试管；
[0066]③配制的杂交液750yL湿润纸条；
[0067]④46°C加热器静置数分钟，气-液平衡。
[0068] 4.3杂交(遮光操作）
[0069] ①取出冷藏库(-20°C) 12 · 5yL分注的探针(500yL试管），离心分离lmin;
[0070] 表2.不同菌群对应的杂交液中FA浓度
[0071]
[0072]所涉及的探针已被文献公开:②探针试管中添加100yL杂交液；
[0073]③载玻片的空白试样:滴加1 OyL杂交液；
[0074]④载玻片的测试试样:滴加 10yL(探针+杂交液）；
[0075]⑤载玻片放入46°C保温的50mL试管中，再一起放入46°C加热器；
[0076] ⑥46°C，2小时杂交反应。
[0077] 第5步清洗
[0078] 5.1清洗缓冲液的配制
[0079]每片载玻片，准备50mL清洗缓冲液，放入48°C水浴，具体配置比例见表3。
[0080] 表3. 50mL不同FA浓度的杂交液对应的清洗缓冲液的配置(单位:mL)
[0081]
[0082] 5.2清洗(遮光操作）
[0083]①从48°C水浴中取出清洗缓冲液试管；
[0084]②从46°C加热器中取出载玻片，用少量的清洗缓冲液(约1 OmL)清洗探针；
[0085]③载玻片放入清洗缓冲液试管，再放入48°C水浴；
[0086] ④水浴需遮光，48°C，20min清洗；
[0087]⑤载玻片20min清洗后，用冰冷的超纯水清洗载玻片；
[0088]⑥去水分，载玻片迅速干燥(吹风机）。
[0089]第6步显微镜观察
[0090] ①抗荧光猝灭封片剂(为本领域常规试剂)滴至载玻片孔与孔的间隙处；
[0091] ②盖上盖玻片(不能混入气泡）；
[0092]③盖玻片四角处用指甲油固定；
[0093]④指甲油干后，镜检(如不能马上镜检，载玻片放入盒子，4°C保存）。
[0094] 实施结果
[0095]通过上述实施方法对采集到的样品进行检测，检测结果如图1所示，其中，a中亮点 代表古细菌;b中亮点代表八叠球菌;c中亮点代表细菌和八叠球菌;d中亮点为八叠球菌、细 菌以及其他的产甲烷菌。由结果附图可知，本发明的方法大大改善了传统荧光原位杂交镜 检的效果，菌体计数更加准确，并且由于探针与相应菌体中的核酸杂交效果提高，荧光显微 镜下观察有清晰明亮的图像。这些优势都是传统方法不可比拟的。
[0096] 尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的 描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的 多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
【主权项】
1. 一种基于FISH的厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的检测方法，其特征在于，所述检测 方法具体为:在分离去除发酵液中发酵残余物获得分离产物后再对分离产物进行荧光原位 杂交。2. 根据权利要求1所述的基于FISH的厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的检测方法，其特 征在于，所述分离具体采用离心的方式。3. 根据权利要求2所述的基于FISH的厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的检测方法，其特 征在于，所述离心是在向所述发酵液中加入碘海醇溶液后进行的。4. 根据权利要求1或2所述的基于FISH的厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的检测方法，其 特征在于，所述分离后需对分离产物进行清洗。5. 根据权利要求4所述的基于FISH的厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的检测方法，其特 征在于，所述清洗后还需对分离产物进行固定获得固定试样； 其中，所述固定具体指，向所述清洗后的分离产物中加入多聚甲醛溶液、固定，即可;获 得的固定试样还需用Na5P3〇1Q溶液稀释、超声分散。6. 根据权利要求1所述的基于FISH的厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的检测方法，其特 征在于，所述荧光原位杂交前需将分离产物脱水固定； 其中，所述脱水固定的具体操作为:将所述分离产物滴至载玻片孔、干燥;然后再向载 玻片孔中加入琼脂糖溶液、再干燥;最后将载玻片浸入乙醇中脱水、干燥。7. 根据权利要求1所述的基于FISH的厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的检测方法，其特 征在于，所述荧光原位杂交中采用探针及其标记、对检测微生物见下表：8. 根据权利要求1所述的基于FISH的厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的检测方法，其特 征在于，所述荧光原位杂交中采用杂交液的FA浓度为5-50% (v/v); 每lmL所述杂交液中还包含180yL 5MNaCl溶液、20yL 1M Tris/HCl、10yL 1%SDS，余量 为水。9. 根据权利要求1所述的基于FISH的厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的检测方法，其特 征在于，所述焚光原位杂交的条件为46°C、2h。10. 根据权利要求1所述的基于FISH的厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的检测方法，其特 征在于，所述检测方法还包括在所述荧光原位杂交后对载玻片清洗、干燥后镜检的步骤。
【专利摘要】本发明公开一种基于FISH的厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的检测方法：在分离去除发酵液中发酵残余物后再对分离产物进行荧光原位杂交。本发明利用分层离心方法使菌体、发酵残余物按照自身不同密度分散在碘海醇溶液的不同位置，效果明显，从而解决发酵残余物对杂交效果的影响；本发明还系统优化针对厌氧消化液中产甲烷菌的荧光原位杂交技术各项条件，使杂交的准确性和灵敏性大大提高，对今后FISH技术在厌氧发酵过程中产甲烷菌的检测具有重要意义。通过上述改进，本发明最终解决了FISH技术检测菌体时常常出现的杂质过多，镜检背景昏暗，计数不准确以及试验条件不明引起的杂交效果不理想等问题。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN105441546
【申请号】CN201510963136
【发明人】刘荣厚, 李坤, 刘蓓蕾
【申请人】上海交通大学
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月18日