N0·2所示，和1492R (S'-GGTTACCTTGTTACGACT-S'MnSEQIDNOJm*;
[0057] (3)扩增体系：
[0058] 16S rDNA序列PCR扩增体系如表1所示：
[0059]表1.
[0061 ] 注:表1中的TemplateDNA为上述步骤(h)所得DNA制成DNA模板。
[0062]PCR反应条件如表2所示：
[0063]表2.
[0066] 注:表2中步骤2进行30个循环。
[0067] PCR扩增产物的电泳检测：
[0068] 电泳条件为1%的琼脂糖凝胶(含Goldview5μl/100ml)，lXTBE电泳缓冲液，90V 电压电泳1小时，PCR产物上样量为3yL，与lyLLoadingdye混匀后点样。在254nm紫外下观 察结果，以TaKaRa公司的DL1000DNAMarker为核酸标准分子量参照物，确定扩增片段长度。 扩增产物带应在标准物400-700bp的位置上。
[0069] PCR产物纯化和测序：由深圳华大基因科技有限公司进行。
[0070] 系统进化树的构建：
[0071] 将所测的16SrDNA序列与GenBank基因库中已测定的细菌的16SrDNA序列进行比 对，根据比对结果下载相关序列。通过MEGA6.0的邻接算法(Neighbor-joiningNJ)进行系 统分析并构建系统进化树，如图3所示。
[0072] 结果：
[0073](一）菌株形态特征
[0074]菌落形态特征：菌株菌落在NA平板上呈淡黄色，表面光滑，隆起，边缘整齐，圆形，NA平板上培养5天直径为3-4mm如图2中al所示。
[0075]菌体形态特征:革兰氏阴性染色阴性，无芽孢，菌体直杆状，大小为(0.32~0.64)μ11^(0.84~1.30)4111，如图2中131所示。
[0076](二)菌株16SrDNA序列及其系统发育学分析
[0077] 利用引物27F和1492R，从菌株基因组DNA中扩增出一条1300-1400bp大小的片段， 经测序并将测序结果通过GenBank中BLASTn比对。结果表明，菌株越南槐内生菌B22与Microbacteriu中的细菌有很高的碱基序列相似性，因此下载所有GenBank中 Microbacteriu的参考菌株序列，用于系统发育分析，以Agromyces中的Agromycesindicus (NR108908)和Agromycesmediolanus(NR117879)作为外群。在构建的系统进化树中，越南 槐内生菌B22与Microbacteriumsp.FSBSY9(KJ184984)聚在一起形成支持强度为100%的 末端分支。碱基相似性比较结果表明，越南槐内生菌B22与Microbacteriumsp.FSBSY9 (KJ184984)有15个碱基的差异，序列相似性为98.9%。综合形态学和分子生物学特征，将菌 株初步鉴定为Microbacteriumsp·。
[0078] 实施例2
[0079] 菌株代谢产物对三七根腐病菌的抑制作用
[0080] 一、菌株B22的发酵培养和菌株B22代谢产物的提取
[0081 ]将越南槐内生菌B22接种于含1000mlNB液体培养基（牛肉浸膏3g，酵母膏lg，蛋白 胨5g，蔗糖10g，pH7.0)的2升锥形瓶中，置于温度为28°C、转速为130r/min的摇床发酵培养 10天，所得发酵物经减压浓缩干燥后，加入发酵物2倍的甲醇并用超声波超声40min，超声进 行离心，取离心后所得上清液减压浓缩得到菌株发酵物的甲醇粗提物，即为越南槐内生细 菌B22代谢产物。
[0082]二、越南槐内生细菌B22代谢产物对三七根腐病菌的菌丝生长的抑制作用 [0083]用菌丝生长法测定菌株的B22代谢产物对三七根腐病菌菌丝生长的抑制活性。将 菌株的B22代谢产物和多菌灵粉剂（阳性对照)分别制成含2mg/mL，4mg/mL，8mg/mL浓度B22 代谢产物的含药平板。在无菌条件下，用打孔器将病原真菌制成6mm菌饼，把三七根腐病菌 菌饼接到各含药平板中央为处理，以不含药平板中央接的三七根腐病菌菌饼为阴性对照， 所有处理和对照重复三次，所有平板置于28°C培养。药物浓度按多菌灵粉剂的田间应用浓 度设置。待阴性对照长满培养皿时，分别测量对照菌落和处理菌落的生长直径，并根据以下 公式，计算抑制率：
[0084] 阴性对照生长量=阴性对照生长直径-菌饼直径 [0085] 处理生长量=处理生长直径-菌饼直径
[0087]三、越南槐内生细菌B22代谢产物对三七根腐病菌的最小抑菌浓度 [0088]用肉汤稀释法测定菌株的B22代谢产物对三七根腐病菌的最小抑菌浓度。将TOA培 养5天的三七根腐病菌菌饼接种于含0.2 %吐温80(v/v)的PDB液体培养基中，28°C，150r/ min摇床培养7天，然后将培养物转到三角瓶，并倒入含0.2 %吐温80的无菌双蒸水，用磁性 棒搅拌30min，将溶液用无菌纱布过滤，得到孢子溶液，并用血球计数板将孢子浓度调节到 每毫升1〇4个孢子备用。将菌株B22的代谢产物用1%DMS0溶解成80mg/mL的代谢产物处理浓 度，取5支无菌试管依次排列在试管架上，分别编号为1、2、3、4、5,每管分别加入lml含0.2% 吐温80的无菌双蒸水，然后将lml80mg/mL的菌株甲醇粗提物溶液加入编号为1的试管中并 依次在各管中进行两倍连续稀释。lml上述所得孢子溶液（104个/ml)分别加入各管中，从而 获得最终的B22代谢产物处理浓度:20mg/ml(编号1试管），10mg/ml(编号2试管），5mg/ml(编 号3试管），2.5mg/ml(编号4试管），1.25mg/ml(编号5试管）alml的1 %DMS0和lml的8mg/mL氟 硅唑乳油分别代替B22代谢产物执行上述处理过程而作为阴性对照和阳性对照，所有处理 和对照重复三次。最后，各管28°C，150r/min摇床培养5天。B22代谢产物的MIC值为完全抑制 三七根腐病菌可见生长的最小粗提物浓度。
[_9]结果：
[0090]菌株越南槐内生菌B22代谢产物对三七根腐病菌菌丝生长的百分抑制率如表3中 所示：
[0091] 表3.
[0092]
[0093]注:表3中阳性对照多菌灵粉剂含50%多菌灵;表中*表示数据通过单因素方差分 析的LSD比较后，菌株B22代谢产物和阳性对照多菌灵粉剂在相同浓度下，在PQ.Q5水平上具 显著性差异。
[0094]菌株越南槐内生菌B22的代谢产物对三七根腐病菌菌丝生长的抑制结果表明，菌 株越南槐内生菌B22的代谢产物对三七根腐病菌的菌丝生长均具有非常好的抑制效果，从 表3可以看出越南槐内生菌B22的代谢产物对三七根腐病菌F.solani菌丝生长的百分抑制 率为63.71-93.84%。与阳性对照多菌灵粉剂比较，菌株越南槐内生菌B22的代谢产物，对三 七根腐病菌F.solani菌丝生长的抑制效果略低于对照。
[0095]菌株B22的代谢产物对三七根腐病菌生长的最小抑菌浓度如表4所示：
[0096]表4.
[0098]注:表中阳性对照氟硅唑为纯化合物，纯度为99.99%。
[0099]菌株越南槐内生菌B22的代谢产物对三七根腐病菌生长的最小抑菌浓度测试结果 表明，菌株越南槐内生菌B22的代谢产物对三七根腐病菌均具有较强的抑制作用，从表4可 以看出越南槐内生菌B22的代谢产物对三七根腐病菌F. solani的最小抑菌浓度为10mg/ml， 是阳性对照的11倍。
[0100]从表3和表4可知，菌株越南槐内生菌B22的代谢产物中含有很强的抑真菌或杀真 菌的成分，因此，在三七根腐病菌的生态防治上，菌株越南槐内生菌B22具有突出的潜力。
[0101] 前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述 并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变 和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应 用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及 各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
[0102]
【主权项】
1. 一种越南槐内生细菌B22,其特征在于：越南槐内生菌B22的分类命名为微杆菌 (Microbacteriumsp.)B22,保藏号：CGMCCNo. 11463。2. -种如权利要求1所述越南槐内生细菌B22的代谢产物的制备方法，其特征在于:将 越南槐内生细菌B22接种于NB液体培养基中，置于温度为28°C、转速为130r/min条件下发酵 培养10天，所得发酵物经减压浓缩干燥后，加入发酵物2倍的甲醇并超声40min，然后离心， 取上清液减压浓缩得到菌株发酵物的甲醇粗提物，即为越南槐内生细菌B22代谢产物。3. 根据权利要求2所述代谢产物的制备方法，其特征在于:所述越南槐内生细菌B22接 种于含l〇〇〇mlNB液体培养基。4. 根据权利要求2所述代谢产物的制备方法，其特征在于:所述的NB液体培养基含牛肉 浸膏3g，酵母膏lg，蛋白胨5g，鹿糖10g，培养基pH值为7.0。5. -种如权利要求2制备所得越南槐内生细菌B22的代谢产物在防治三七根腐病中的 应用。
【专利摘要】本发明公开了一种越南槐内生细菌B22，越南槐内生菌B22的分类命名为微杆菌(Microbacterium？sp.)B22，菌株的16S？rDNA基因序列表如SEQ？ID？NO.1所述，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2015年09月29日，保藏号：CGMCC？No.11463。本发明首次从药用植物越南槐的根中分离筛选到一株越南槐内生细菌(Microbacterium？sp.)B22，该菌对三七根腐病菌具有很强的抑制作用，为三七真菌病害的生物防治领域带来广阔的应用前景。CGMCC No. 1146320150929
【IPC分类】A01N63/02, C12N1/20, A01P3/00, C12R1/01, C12P1/04
【公开号】CN105462890
【申请号】CN201510979038
【发明人】黄荣韶, 蓝芳, 姚裕群, 李良波
【申请人】广西大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月23日