一种工业化高产快速生产黄杆菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种工业化高产快速生产黄杆菌的方法。
【背景技术】
[0002]微生物能以有机污染物为唯一碳源和能源或者与其他有机物质进行共代谢而降解有机污染物。利用微生物降解作用发展的微生物修复技术是农田土壤污染修复中常见的一种修复技术，这种生物修复技术已在农药或石油污染土壤中得到应用。在中国，已构建了农药高效降解菌筛选技术、微生物修复剂制备技术和农药残留微生物降解田间应用技术；并且已经分离到能将多环芳烃(PAHs)作为唯一碳源的微生物，如假单胞菌属、黄杆菌等。特别是黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)是一种优良的改善农田土壤及环境修复微生物制剂，但是常规的发酵方法仅限于实验室阶段，在工业生产中无法获得细胞数量多，活性好的黄杆菌。
[0003]因此，急需一种工业化高产快速生产黄杆菌的方法，该方法简单，发酵周期短，能在较短时间内获得细胞总数达100-200亿/ml的黄杆菌。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种工业化高产快速生产黄杆菌的方法，工艺方法简单，能够在较短时间内获得出罐液细胞总数大，活细胞率高的菌液。
[0005]为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案:
[0006]—种工业化高产快速生产黄杆菌的方法，包括如下步骤:
[0007](1)菌种培养:将黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)菌株接种至含糖量2?6%的培养液中，然后在温度为28?37°C条件下培养至细胞数为20?60亿/ml，得种子培养液；
[0008](2)发酵罐种子培养:将步骤(1)所得种子培养液接种至培养液含糖量为2?6%的发酵罐中，按通气量为6?14m3/h通入无菌空气，在温度为28?37°C条件下培养至细胞数为40?80亿/ml，得发酵罐种子培养液；
[0009](3)将步骤(2)所得发酵罐种子培养液接种至培养液含糖量为4?10%的发酵罐中，先按通气量为16?28m3/h通入无菌空气，在温度为28?37°C条件下发酵6?8小时后，按通气量为28?50m3/h通入无菌空气，继续发酵至细胞数为100-200亿/ml，得黄杆菌菌液。
[0010]优选的，所述步骤(1)为将黄杆菌按8?12%接种量接种至含糖量3?6%的培养液中，然后在温度为30?35°C、pH为7-7.5条件下培养至细胞数为20?80亿/ml，得种子培养液;更优选的，所述pH为7.0。
[0011 ]优选的，步骤(2)中，所述种子培养液按体积比为1:40接种至种子发酵罐中。
[0012]本发明中，所述培养液含有氮源、磷源、硫酸镁和碳酸钙，各组分质量百分比如下:氮源5-8 %，磷源 0.1-0.2%,硫酸镁 0.1-0.2%,碳酸钙 0.1-0.5%。
[0013]优选的，所述氮源为牛肉汤，蛋白胨，玉米汁，硫酸铵，碳酸氢铵，氨水，尿素，硝酸钾，硝酸钠，硝酸铵，磷酸铵，磷酸氢铵或磷酸氢二铵中的一种或几种;所述磷源为磷酸，磷酸铵，磷酸氢铵，磷酸氢二铵，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾中的一种或几种。
[0014]更优选的，所述牛肉汤的制备方法如下:将牛肉用蒸汽水煮沸30min，然后过滤得牛肉汤;所述玉米液由以下方法制备:将玉米浆干粉用蒸汽水煮沸，过滤得玉米浆液。
[0015]最优选的，所述培养液的加入方式为氮源，碳源，磷源，硫酸镁，碳酸钙随种子发酵罐培养液加入。
[0016]本发明的有益效果在于:本发明公开的一种工业化快速发酵生产黄杆菌的方法，发酵周期短，成本低，并且出灌的黄杆菌细胞总数达100-200亿/ml，明显优于现有发酵方法。
【具体实施方式】
[0017]下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0018]本发明中黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)来源于中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，公开网址为:http: //www.accc.0rg.cn/search/accc/show, asp? jzbc =03071;保藏编号为 ACCC03071。
[0019]实施例1
[0020]—种工业化高产快速生产黄杆菌的方法，包括如下步骤:
[0021 ] (1)菌种培养:将黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)按8%接种量接种至含糖量6%的培养液中，然后在温度为35°C、初始pH为7.0条件下培养至细胞数为40亿/ml，得种子培养液；
[0022](2)发酵罐种子培养:将步骤(1)所得种子培养液按体积比为1:40接种至含糖量为2%的培养液中，按通气量为8m3/h通入无菌空气，在温度为35°C条件下培养至细胞数为50亿/ml，得发酵罐种子培养液；
[0023](3)将步骤(2)所得发酵罐种子培养液接种含糖量为5%培养液的发酵罐中，先按通气量为24m3/h通入无菌空气，在温度为35°C条件下发酵7小时后，按通气量为32m3/h通入无菌空气，继续发酵至细胞数在100?200亿/ml则发酵完毕，出罐。
[0024]出灌后检测出罐液，涂平板确定活细胞数;结果显示，使用本发明的方法发酵黄杆菌出罐数为120亿/ml。
[0025]本实施例中，黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)由中国农业科学院农业资源与农业区划研究所提供，并由本公司保存。上述培养液还包括有氮源5%，磷源0.1%，硫酸镁0.1%，碳酸钙0.1%。氮源选自牛肉汤，蛋白胨，玉米汁，硫酸铵，碳酸氢铵，尿素，硝酸钾，硝酸钠，硝酸铵中的至少一种;磷源选自磷酸，磷酸铵，磷酸氢铵，磷酸氢二铵，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾中的一种或几种。其中牛肉汤的制备方法如下将牛肉切碎用蒸汽水煮沸30min，然后过滤得牛肉汤;所述玉米液由以下方法制备:将玉米浆干粉用蒸汽水煮沸，过滤得玉米浆液。
[0026]实施例2
[0027]—种工业化高产快速生产黄杆菌的方法，包括如下步骤:
[0028](1)菌种培养:将黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)按10%接种量接种至含糖量3%的培养液中，然后在温度为30°C、初始pH为7.0条件下培养至细胞数为45亿/ml，得种子培养液；
[0029](2)发酵罐种子培养:将步骤(1)所得种子培养液按体积比为1:40接种至含糖量为4%的培养液中，按通气量为10m3/h通入无菌空气，在温度为35°C条件下培养至细胞数为60亿/ml，得发酵罐种子培养液；
[0030](3)将步骤(2)所得发酵罐种子培养液接种含糖量为6%培养液的发酵罐中，先按通气量为26m3/h通入无菌空气，在温度为35°C条件下发酵8小时后，按通气量为40m3/h通入无菌空气，继续发酵至细胞数在100?200亿/ml则发酵完毕。出罐出灌后检测出罐液，涂平板确定活细胞数;结果显示，使用本发明的方法发酵黄杆菌出罐数为150亿/ml。
[0031 ] 本实施例中，黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)由中国农业科学院农业资源与农业区划研究所提供，并由本公司保存。上述培养液还包括有氮源6%，磷源0.15%，硫酸镁
0.1%，碳酸钙0.2%。氮源选自牛肉汤，蛋白胨，玉米汁，硫酸铵，碳酸氢铵，尿素，硝酸钾，硝酸钠，硝酸铵中的至少一种;磷源选自磷酸，磷酸铵，