粒转入至需要DAP才能生长的Apir大肠杆菌内以便进行后续突变株的构建。
[0013]将转入有重组自杀质粒的Apir大肠杆菌与鼠伤寒沙门氏菌进行自然混合培养，使自杀性质粒从大肠杆菌中转移到鼠伤寒沙门氏菌内，由于重组自杀质粒带有特殊的复制子，不能在沙门氏菌内进行独立的自我复制存活，但可与鼠伤寒沙门氏菌基因组中的同源区域进行交叉互配，最终使得整个自杀质粒得以整合进基因组当中，经过不含DAP但含有氯霉素抗性的固体培养基筛选，得到第一次同源重组后的阳性克隆菌;在液体LB培养基中(不带Cm+抗性)继续培养阳性克隆菌，使其自发的发生第二次同源重组，用含有10%的蔗糖且不含氯化钠的固体培养基筛选，得到对氯霉素敏感而对蔗糖有抗性的克隆；
运用同源重组的方法我们构建得到缺失有rfbK和cpsG基因的鼠伤寒沙门氏菌突变株，以及缺失有rfbM和cpsB基因的鼠伤寒沙门氏菌突变株。
[0014]本发明还提供了减毒鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typimurium S116在疫苗上的应用。
[0015]本发明的有益效果:
1)所得减毒菌株缺失了rf bK和cpsG基因，具有明显的减毒效果；
2)本发明所得菌株，可以在体外培养阶段时加入甘露糖，使得沙门氏菌可在体外正常合成完整的LPS和CA，保持与野生株相当的抵抗宿主胃肠道内恶劣生存环境的能力以及正常的入侵肠上皮细胞和浅层及深层淋巴组织的定殖能力；沙门氏菌定殖宿主机体后，由于宿主体内甘露糖的缺乏，沙门氏菌LPS中的0抗原和CA合成受阻，细菌得以缓慢而有效的减毒，进而产生长久而持续的免疫应答能力；在缺乏甘露糖的条件下，细菌外膜LPS不再连有完整的0抗原，这便使得原本不易被宿主机体免疫系统所识别的具有免疫原性的保守性外膜蛋白得以更多更充分的暴露，进而产生更好的免疫保护效果。
【附图说明】
[0016]图1为本发明相关PCR鉴定电泳图，其中，A是本发明中SlOOArfbK突变株的PCR鉴定电泳结果，Μ代表Markerlll，1代表突变株2代表野生株;B是本发明中S100 Δ cpsG突变株的PCR鉴定电泳结果，Μ代表Markerlll，1代表突变株2代表野生株;C是本发明中S100 Δ rfbKΔ cpsG突变株的PCR鉴定电泳结果，Μ代表MarkerllI，1和3代表突变株，2和4代表野生株；
[0017]图2为本发明S100Δ rfbK、S100 Δ cpsG和S100 Δ rfbK Δ cpsG突变株的LPS表型及LPS回补表型和western结果图；其中，A是本发明中S100 Δ rfbK、S100 Δ cpsG和S100 Δ rfbKΔ cpsG突变株的LPS表型及LPS回补表型，图中1:S100，2:S100 ArfbK，3:S100A CpSG，4:S100ΔrfbKΔcpsG;5:S100ΔrfbK(pl5a-rfbK)；6:S100ΔrfbK(pl5a-cpsG)；7:S100ΔrfbKΔ cpsG(pl5a-rfbK) ;8:S100ArfbKAcpsG(pl5a_cpsG);B是本发明中与 A 图相对应的western图，图中l:S100，2:S100ArfbK，3:S100ACpSG，4:S100ArfbKACpSG;5:S100ArfbK(pl5a-rfbK)；6:S100ΔrfbK(pl5a-cpsG)；7:S100ΔrfbKΔCpsG(pl5a-rfbK)；8:S100ΔrfbKΔcpsG(pl5a_cpsG)。
图3为本发明相关PCR鉴定电泳图，其中，A是本发明中S100 Δ rfbM突变株的PCR鉴定电泳结果，Μ代表Markerlll，1代表突变株2代表野生株;B是本发明中S100 Δ cpsB突变株的PCR鉴定电泳结果，M代表Markerlll，1代表突变株2代表野生株;C是本发明中S100 Δ rfbM ΔcpsB突变株的PCR鉴定电泳结果，Μ代表MarkerllI，1和3代表突变株，2和4代表野生株；
图4为本发明中S100 Δ rfbM、S100 Δ cpsB和S100 Δ rfbM Δ cpsB突变株LPS表型及LPS回补表型和western结果图；其中，六是本发明中S100 Δ rfbM、S100 Δ cpsB和S100 Δ rfbM Δ cpsB突变株的LPS表型及LPS回补表型，图中l:S100，2:S100ΔCpSB，3:S100ΔrfbM，4:S100 ΔrfbM Δ cpsB;5: S100 Δ rfbMΔ cpsB(pl5a_cpsB) ;13是本发明中与A图相对应的western图，图中1:S100，2:S100 ArfbM，3:S100 ΔcpsB,4:S100 ΔrfbMΔ cpsB；5:S100ΔrfbMA cpsB(pl5a_cpsB)。
【具体实施方式】
[0018]下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述
【发明内容】
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0019]实施例1
1、ΔrfbK引物设计
根据NCBI Genbank公布的鼠伤寒沙门氏菌UK-1全基因组序列(序列号:CP002614)，设计两对引物分别扩增rfbK基因的上、下游同源臂，扩增片段大小分别为462 bp,340 bp，上述引物均由北京华大基因公司合成，引物序列如下:
DrfbK-lF: 5’ ACAGACGCTTTACTGGTGGC 3’
DrfbK-lR: 5’ CCTCTGACCTTAACTACGTTCATTAGTCC 3’
DrfbK-2F: 5’ ACGTAGTTAAGGTCAGAGGGTGAGGATTA 3’
DrfbK-2R: 5’ AACGCTATCAGAGCCAAATC 3’
2、rfbK基因的上、下游同源臂的扩增以及融合
挑取鼠伤寒沙门氏菌S100单菌落于5 mL LB液体培养基中过夜培养(37°C，180rpm)，用天根生化科技有限公司的细菌基因组抽提试剂盒，按照说明书的操作步骤进行基因组抽提。
[0020]PCR扩增反应在20 yL的体系中进行，反应体系如下:模板DNA 0.4 yL，2XprimeSTAR Max(宝生物有限公司)10 yL，上游引物0.4 yL，下游引物0.4 yL，ddH20 8.8 μ
L0
[0021 ] 扩增条件为:98°C变性2 min后进入循环，循环参数为98°C 10 sec,55°C 15 sec,72°C 20 secJO个循环后，72°C延伸5min。扩增的PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增两个片段大小分别为462 bp和340 bp，与预期大小相符。
[0022]上、下游同源臂的融合:用天根生化科技有限公司的DNA纯化回收试剂盒，将上下游同源臂的产物混合后进行PCR液回收，以上述回收产物为模板，利用引物DrfbK-lF和DrfbK-2R在与之前相同体系以及扩增条件下进行扩增，得到大小为800bp左右的融合片段。
[0023]3、pYA4278_rfbK自杀质粒的构建
将融合片段进行加A(A碱基)处理。利用天根生化科技有限公司的plus A反应试剂盒，反应体系为:模板15 yL，plus A buffer 4 yL，Taq酶1 yL;反应条件为:72°C 30min。
自杀质粒PYA4278酶切片段的准备:过夜培养含pYA4278质粒的宿主菌，取4 ml菌液，利用天根生化科技有限公司的质粒提取试剂盒进行质粒提取，最后用50 ul的ddH20进行洗脱，在加6 ul的NEB CutSmart 10X buffer和1 ul的Ahd I酶进行酶切，回收载体PYA4278。
[0024]将加A处理的融合片段与经酶切后的pYA4278质粒用T4 DNA ligase连接，16°C水浴过夜，转化进Apir大肠杆菌感受态细胞，待其长出后进行PCR鉴定，获得阳性重组自杀质粒pYA4278-rfbK。将质粒抽提后送往上海英俊生物技术有限公司进行测序，证实构建的自杀质粒是正确的。
[0025]4、S100 Δ rfbK突变株的构建与鉴定
将构建好的重组自杀质粒pYA4278-rfbK转化至Apir大肠杆菌菌株中(该菌株缺失了asd基因，需要DAP才能够生长，用于后续接合转移的筛选)，将携带有自杀质粒pYA4278-rfbK的Apir大肠杆菌与鼠伤寒沙门氏菌S100进行接合转移，在氯霉素抗性的LB平板上筛选阳性菌落，将阳性菌落在不含氯霉素抗性的LB液体培养基中培养增殖，最后稀释涂10%的蔗糖板，在10%蔗糖平板上筛选耐蔗糖菌落，并挑取单菌落进行PCR鉴定。
[0026]PCR鉴定:以待检菌落为模板，用引物DrfbK-lF/DrfbK_2R进行PCR扩增。菌株缺失rfbK后，引物DrfbK-lF/DrfbK-2R扩增产物大小即为上下游同源臂融合的大小(802 bp)。若未缺失成功则PCR产物条带大小为2273 bp。结果，缺失株PCR鉴定条带大小与理论相符，表明rfbK基因缺失株构建成功。将突变株命名为S100八忖131(，如图1八。
[0027]实施例2
1、ΔcpsG引物设计
根据NCBI Genbank公布的鼠伤寒沙门氏菌UK-1全基因组序列(序列号为:CP002614)，设计两对引物分别扩增cpsG基因的上、下游同源臂，扩增片段大小分别为369 bp、393bp，上述引物均由北京华大基因公司合成，引物序列如下:
DcpsG-lF: 5’ ACATGCACCGCGAGGTTTAC 3’
DcpsG-lR: 5’ TCTGACGTTATTACCGGGCATAATTGCAGGCG 3’
DcpsG-2F: 5’ GCCCGGTAATAACGTCAGATCTCCCCTTACCG 3’
DcpsG-2R: 5’ GCCAGGTGGCGAGGCGGTTG 3’
2、cpsG基因的上、下游同源臂的扩增以及融合
挑取鼠伤寒沙门氏菌S100单菌落于5 mL LB液体培养基中过夜培养(37°C，180rpm)，用天根生化科技有限公司的细菌基因组抽提试剂盒，按照说明书的操作步骤进行基因组抽提。
[0028]PCR扩增反应在20 yL的体系中进行，反应体系如下:模板DNA 0.4 yL，2XprimeSTAR Max(宝生物有限公司)10 yL，上游引物0.4 yL，下游引物0.4 yL，ddH20 8.8 μ
L0
[0029]扩增条件为:98°C变性2 min后进入循环，循环参数为98°C 10 sec,55°C 15 sec,72°C 20 secJO个循环后，72°C延伸5min。扩增的PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增两个片段大小分别为369 bp和393 bp，与预期大小相符。
[0030]上、下游同源臂的融合:用天根生化科技有限公司的DNA纯化回收试剂盒，将上下游同源臂的产物混合后进行PCR液回收，以上述回收产物为模板，利用引物DcpsG-lF和DcpsG-2R在与之前相同体系以及扩增条件下进行扩增，得到大小为750bp左右的融合片段