0 U/mg。
[0021] 上文及下文所讲述的' R村等方法'是指在《Biosci. Biotechnol. Biochem. (生物科学，生物技术与生物化学），65(7)，1596-1600，2001》中所提到的酶分析方法 (Enzyme assay),是指酒精水解酶活性的测定方法，具体内容如下： 从乙醇200 μ mol, NAD+ 1 μ mol及氨基甲烷-盐酸缓冲液（pH7. 5) 200 μ mol中抽出 的酶添加后，最终将体积调整为1. 〇 ml。基质用水来代替成为对照区。在lcm光学距离 的试管内进行30°C的恒溫反应。反应在NAD+添加的瞬间开始，自动温度调节的恒温控制 的试管架（thermostatically controlled cuvette holder)和连续图记录仪（continuous chart recoder)用装置好的分光光度计（（日立150-20型双光束光谱仪）Hitachi 150-20 double beam spectrophotometer)以340nm吸光度测定初期变化的酶活性。酶活性单位单 元（unit)是指反应1分钟中形成的每1 μ mol的NADH催化的量。酶活性以每lmg蛋白质 的单元含量（单元（unit)/mg)定义。蛋白质以BSA(结晶牛血清清蛋白）作为标准物质用 Lowry等方法进行检测。
[0022] 本发明相关的桑黄提炼的菌丝体具有33 U/mg以上的酒精水解酶活性，优点是 可经济的制造药酒. 具有这种酒精水解酶活性的蘑菇菌类菌丝体可通过一系列的工程进行培养，从蘑菇菌 类子实体中分离后，在固体培养基中培养后再在液体培养基内培养。
[0023] 实验培养时，在液体培养基内培养的过程中，液体培养基中添加了 1至2%的乙醇， 才能理想地生产出具有酒精耐性的蘑菇菌类菌丝体。
[0024] 此时，液体培养基中乙醇浓度超过4%时，在培养过程中存在灭绝的隐患。
[0025] 具体的振荡栽培过程中，将平皿培养后的平皿最边缘的蘑菇菌类菌丝体按一定规 格切成4至5个琼脂碎片，然后放置于添加了 1至2%乙醇的液体培养基的三角烧瓶中 进行接种，并在25至26 °C以50至150rpm速度进行24至30个小时的振荡栽培。
[0026] 如此振荡栽培完成后，回收蘑菇菌类菌丝体用作为酒精发酵源。为了生产大量的 酒精饮料或者酒类，需经过大量的培养后工程。
[0027] 大量培养可通过以下三个工程实现：振荡栽培后蘑菇菌类菌丝体的前容器工程， 前容器工程后蘑菇菌类菌丝体的本培养工程及本培养工程后的蘑菇菌类菌丝体养物的筛 分（sieving)工程。
[0028] 本发明最理想实验例子中，蘑菇菌类菌丝体的酒精水解酶活性引进酒类生产时， 为了最大化生产，相较于菌丝体增殖阶段的平皿培养工程，酒精水解酶激活的振荡栽培工 程以后更需要集中最大化的激活酒精水解酶。考虑到这一点，平皿培养工程和振荡栽培工 程以后的工程的培养基构成可设定为不同条件。具体内容请查看下面， (1)蘑菇菌类菌丝体的平皿培养工程取一定大小的蘑菇菌类子实体碎片放置平皿培 养基上，在25至26°C中进行48至72个小时的静止培养（stationary culture)。
[0029] 在平皿培养工程中菌丝体可增殖，在增殖这一方面，在培养基构成中添加碳源中 的葡萄糖可更利于增殖。
[0030] 考虑到蘑菇菌类菌丝体增殖及工程的便利性，平皿培养的培养基中包含了 1至2% 的酵母抽出水，2至3%的蛋白胨（peptone), 2至3%葡萄糖（dextrose), 1.5至2.0% 的琼脂，pH大概为6. 5至7.0。
[0031] 诱导增殖的平皿培养工程中的静止培养时间48个小时至72个小时内就可充分地 诱导蘑菇菌类菌丝体增殖。
[0032] (2)平皿培养后的蘑菇菌类菌丝体的振荡栽培工程 如上文所述,将平皿培养后的平皿最边缘的蘑菇菌类菌丝体按一定规格切成4至5个 琼脂碎片，放置于三角烧瓶的液体培养基中进行接种，并在25至26°C以50至150rpm速 度进行24至30个小时的振荡栽培培养。其中琼脂碎片的数量根据液体培养培养基的规模 不同而不同，不应被限制。
[0033] 振荡栽培时，以不满50 rpm的旋转数进行旋转的话，成长的菌丝体在培养物内无 法均匀地分布而且相互凝结。因此菌丝体成长所需的氧气供给在培养物内无法被充分地支 持，导致无法得到高品质的液体培养物。相反，振荡栽培旋转数超过150rpm时，氧气供给虽 然充分，因过度的旋转力可能导致菌丝体成长下降并切断菌丝体，从而达不到理想实验效 果。最理想的振荡栽培时旋转数为60至lOOrpm。
[0034] 为了增大水解酶的活性和提高诱导酒精发酵之前的持久力，酒精液体培养基的营 养源不应使用单糖类的葡萄糖，而应使用蔗糖。同时增进酒精耐性的最好办法是使用含有 乙醇的培养基。
[0035] 这时乙醇在全体培养基中含量为1至2%，能更好地使培养过程中的菌丝体不会灭 绝。
[0036] 具体振荡栽培培养基的构成：蔗糖2至3%，酵母抽出水0. 5至1%，MgC12 0. 1至 0· 2%，乙醇1至2%，pH大概为6. 5至7. 0。
[0037] 在菌体酒精水解酶活性中，液体培养基中包含了 MgC12,实验效果最理想。
[0038] 振荡栽培时间增长的话，菌丝体的量会增加。但前容器培养时，活性会降低，导致 菌丝体生产需要很长时间。因此，理想的振荡栽培时间为24至30个小时。更理想地时间 为24至26个小时。
[0039] (3)振荡栽培后的蘑菇菌类菌丝体的前容器工程 振荡栽培的菌丝体无菌环境下细小撕破后，作为接种源在10至20L容量的培养器中进 行前容器培养。前容器培养通过菌丝体稳定化后激活增殖。
[0040] 前容器培养工程中，将培养基装入发酵桶，其体积是发酵桶容量的70至80%。这里 的培养基体积的〇. 1至〇. 2%可接种上文（2)所讲述的振荡栽培液。
[0041] 前容器工程的培养基和振荡栽培工程的培养基构成条件一致的话，可理想地维持 菌体的生长和大量培养的酒精生产能力。
[0042] 并且振荡栽培接种源过少移植的话，成长速度会降低，培养时间也会延长，从而导 致生产非经济。
[0043] 培养中，适当地供给空气有利于维持菌体的生长和大量培养的酒精生产能力。因 此最好将空气供给速度调节为0. 05至0. 1L/分钟。
[0044] 前容器培养在25至26°C中进行24至26个小时有利于增进菌体的活性。
[0045] (4)前容器培养的蘑菇菌类菌丝体的本培养工程 以上述方法用前容器培养后的接种源进行大量的培养。为了大量培养，需使用2000至 3000L的容器，放入50至60%的容器体积的培养基，同时添加前容器培养液。
[0046] 前容器培养菌丝体不经过集菌过程，进行无菌的本培养。将其直接移植到发酵桶 中，可有效的防止杂菌污染 前容器培养的接种源过少接种的话可能导致菌丝体成长缓慢甚至可能失败。相反，接 种源过多的话反而使生产非经济。考虑到这一点，在本培养中前容器培养液的量为培养基 体积的〇· 4至0· 6%时效果最佳。
[0047] 本培养的培养温度在25至26°C左右时供给空气的话，培养的效果可达到期望效 果。此时考虑培养规模和培养基的量以及菌体的成长和激活，空气供给速度为40至50L/ 分钟时可达到期望效果。
[0048] 本培养时间为24至30个小时最佳。超过30个小时进行大量培养话，可导致菌丝 体的酒精水解酶活性急剧减小，从而无法达到期待效果。
[0049] (5)本培养后的蘑菇菌类菌丝体培养物的筛分（sieving)工程 通过一系列过程进行大量培养的蘑菇菌类中的菌丝体，不进行回收工程而仅仅通过筛 分过滤的话，远心分离可能会集菌污染。
[0050] 筛分时使用200至300目（mesh)的过滤筛进行。过滤筛的目数在上文范围中以 内的话可有效的回收菌丝体。
[0051] (6)菌丝体破碎工程 筛分过滤后的菌丝体用流水清洗2至3回，用水干净切除培养基成分后，进行破碎工 程。破碎工程可使用超声波破碎机或使用粉碎机进行。
[0052] 破碎方法例子：利用超声波破碎机在超声波强度为Am 30至50%，En 0.6至0.8KJ 情况时进行1至2秒破碎后，休息1至2秒，总处理时间为5至10分钟。
[0053] 利用破碎机的进行破碎具有以下三个优点：最大防止破碎后的菌丝体的细胞损 伤、进行大量生产和有利于工程的容易性。具体的方法是：通过500至lOOOrpm/min旋转的 粉碎机破碎2至3分钟后休息3至5分钟，总处理时间为20至32分钟。总处理时间内连 续性破碎的话产生的热量会影响菌丝体的活性。因此间歇性破碎的办法更利于达到期望效 果。利用相同的经过上述工程得到的蘑菇菌类菌丝体的量与筛分后的蘑菇菌类菌丝体的量 时，可生产出更高的浓度酒精。而且此酒精发酵源在同一情况下生产同一浓度的酒精所需 的发酵时间