上述工序 中使用具有标记的核巧酸来扩增基因组DM片段，所扩增的DNA片段被标记化。
[0104] 接下来，使具有标记的基因组DNA片段在规定的条件下与DNA微阵列接触，使固定 于DNA微阵列的探针与具有标记的基因组DNA片段杂交。此时，杂交时优选为高严格条件。通 过采取运样的高严格条件，能够更高精度地判定供试草替属植物中是否存在草替属植物炭 痘病抵抗性相关标志物。此外，严格条件通过反应溫度和盐浓度来调节。即，通过更高溫来 形成更高的严格条件，另外通过更低的盐浓度来形成更高的严格条件。例如，在使用50~75 碱基长的探针的情况下，作为杂交条件，可W通过40~44°C、0.2%SDS、6XSSC的条件来制 成更高的严格条件。
[01化]另外，探针与具有标记的基因组DNA片段的杂交可W基于标记来检测。即，在上述 的具有标记的基因组DNA片段与探针的杂交反应之后，洗净未反应的基因组DNA片段等，然 后观察与探针特异性地杂交的基因组DNA片段的标记。例如，在标记是巧光物质的情况下， 检测其巧光波长，在标记是色素分子的情况下，检测其色素波长。更具体地，可W使用在通 常的DNA微阵列分析中使用的巧光检测装置、图像分析仪等装置。
[0106] 如上，通过利用核酸扩增法的方法或者使用DNA微阵列的方法，能够判断供试草替 属植物是否具有上述的草替属植物炭痘病抵抗性相关标志物。其中，如上所述，如果存在草 替属植物炭痘病抵抗性相关标志物中的与炭痘病抵抗性优异运样的性状连锁的草替属植 物炭痘病抵抗性相关标志物，则能够判断是炭痘病抵抗性优异的系统?品种。另外，如上所 述，如果不存在草替属植物炭痘病抵抗性相关标志物中的、与炭痘病抵抗性降低的性状连 锁的草替属植物炭痘病抵抗性相关标志物，则能够判断是炭痘病抵抗性优异的系统.品 种。
[0107] 特别是在上述的方法中，不需要使供试草替属植物成长到能够实施实际的炭痘病 抵抗性试验的程度，可W使用例如后代系统的种子、使该种子发芽而得的幼苗。因此，通过 利用草替属植物炭痘病抵抗性相关标志物，能够大幅削减用于使供试草替属植物生长的农 场、其他用于生长的成本。另外，通过利用草替属植物炭痘病抵抗性相关标志物，不需要实 际感染炭痘菌的病原微生物（苹果炭痘病菌(Glomerella cingulate)和/或辣椒炭痘病菌 (Colletotrichum acutatum))，能够削减大规模专用溫室、专用农场、与外部的隔离设施等 设备等所花费的成本。
[0108] 特别在制作草替属植物的新品种时，优选在首先通过杂交制作数万种杂交种之 后，在实生筛选之前或代替实生筛选，进行利用草替属植物炭痘病抵抗性相关标志物的判 断。由此，能够大幅削减在实际农场中栽培优良的系统的数量，大幅抑制制作草替属植物的 新品种所花费的时间、成本。
[0109] 或者，在制作草替属植物的新品种时，还可W首先判定杂交中使用的亲本品种中 有无草替属植物炭痘病抵抗性相关标志物存在，筛选炭痘病抵抗性优异的亲本品种。通过 优先使用炭痘病抵抗性优异的亲本品种制作后代系统，能够期待炭痘病抵抗性优异的后代 系统高频率地出现。由此，能够大幅削减栽培优良的系统的数量，大幅抑制制作草替属植物 的新品种所花费的时间、成本。
[0110] 实施例
[0111] W下，通过实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术的范围不限于W下的实 施例。
[0112] 1.DNA微阵列用探针的制成 [011引 （1)材料
[0114]使用栽培草替品种：妄6。加(幸香)和草替中间母本农2号。
[011引（2)限制性酶处理
[0116] 从运些栽培草替品种通过CTAB法（Ξ甲基十六烷基漠化锭法，Cetyl化imethyl ammonium bromide法）分别提取基因组DNA。将提取的基因组DNA(180ng)用限制性酶PstI (肥B社、6un i t)在3 7°C处理1小时。然后，对Ps 11处理后的基因组DNA (150ng)添加限制性酶 BstNI(肥B社、5unit)，在60°C处理1小时。
[0117] (3)连接物连接
[011引对（2)中处理后的基因组DNA片段（120ng)加入PstI序列连接物（5 ' -CACGATGGATCCAGTGCA-3 '（序列号 11)、5 ' -CTGGATCCATCGTGCA-3 '（序列号 12))和T4DNA连接 酶(肥B社、SOOunit)，在16°C、4小时W上的条件下进行连接反应。由此，对在(2)中处理的基 因组DNA片段中的、两末端具有PstI识别序列的基因组DNA片段选择性地附加连接物。
[0119] (4)PCR 扩增
[0120] 对(3)中获得的具有连接物的基因组DNA片段（15ng)加入PstI序列连接物识别引 物（5 ' -GATGGATCCAGTGCAG-3 '（序列号13))和Taq聚合酶（夕力弓八斗才社Pr imeSTAR、 1.25unit)，通过PCR(将98°C10秒、55°C15秒、72°C1分钟作为1个循环进行30个循环后，在72 °C处理3分钟，然后在4°C保存)扩增基因组DNA片段。
[0121] (5)基因组序列获得
[0122] 对于(4)中PCR扩增而得的基因组DNA片段，使用GAIIQII皿ina社)确定碱基序列。
[0123] (6)探针设计和DNA微阵列的制成
[0124] 基于（5)的基因组序列信息设计50~75bp的探针。基于设计的探针的碱基序列信 息制作具有运些探针的DM微阵列。
[0125] 2.使用了 DM微阵列的信号数据的获得
[0126] (1)材料
[0127] 使用栽培草替品种：妄6。加(幸香）、草替中间母本农2号和它们的杂交后代133 个系统。
[012引（2)限制性酶处理
[0129] 从运些栽培草替品种和杂交后代通过CTAB法分别提取基因组DNA。将提取的基因 组DNA(180ng)用限制性酶PstI (肥B社、6unit)在37°C处理1小时。然后，对PstI处理后的基 因组DNA( 150ng)添加限制性酶BstNI (肥B社、5unit)，在60°C处理1小时。
[0130] (3)连接物连接
[0131] 对（2 )中处理的基因组D NA片段（1 2 0 η g )加入P S 11序列连接物（5 ' -CACGATGGATCCAGTGCA-3 '（序列号 11)、5 ' -CTGGATCCATCGTGCA-3 '（序列号 12))和T4DNA连接 酶(肥B社、SOOunit)，在16°C、4小时W上的条件下进行连接反应。由此，对(2)中处理的基因 组DNA片段中的、两末端具有PstI识别序列额基因组DNA片段选择性地附加连接物。
[0132] (4)PCR 扩增
[0133] 对(3)中获得的具有连接物的基因组DNA片段（15ng)加入PstI序列连接物识别引 物（5 ' -GATGGATCCAGTGCAG-3 '（序列号13))和Taq聚合酶（夕力弓八斗才社Pr imeSTAR、 1.25unit)，通过PCR(将98°C10秒、55°C15秒、72°C1分钟作为1个循环进行30个循环后，在72 °C处理3分钟，然后在4°C保存)扩增基因组DNA片段。
[0134] (5)标记化
[0135] 将上述的（4)中获得的PCR扩增片段用柱（Qiagen社）纯化后，按照NimbleGen Arrays User's Guide使用NimbleGen One-Color DNA Labeling制备标记化样品。
[0136] (6)杂交?信号检测
[0137] 使用（5)的标记化样品，按照NimbleGen Array User'S Guide,使用上述1.中制作 的DM微阵列进行杂交，检测基于标记的信号。
[013引3.草替属植物炭痘病抵抗性的9化鉴定和标志物开发
[0139] (1)遗传图谱数据制成
[0140] 从妄6。加(幸香）、草替中间母本农2号、杂交后代133个系统的信号数据获得能 够成为妄6。加(幸香)型的1，502个标志物和草替中间母本农2号型的2，162个标志物的基 因型数据。W基因型数据为基础，使用遗传图谱制成软件AntMap(Iwata H，Ninomiya S (2006)AntMap:constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm.&reed Sci 56:371-378)，通过遗传距离计算式Kosambi计算出 染色体中的标志物的位置信息，获得标志物的遗传图谱数据。
[0141] (2)草替炭痘病检验试验数据的获得
[0142] ^妄6。加(幸香）、草替中间母本农2号、杂交后代103个系统的走茎繁殖后的克 隆株作为检验株。对于各检验株区5株X3重复栽培。除去下位叶使得到接种2天前具备 展开叶为3~4片的叶数。
[0143] 然后，将独立行政法人农业.食品产业技术综合研究机构的野菜茶业研究所所保 持的草替炭痘病菌株(苹果炭痘病菌(Glomerella cingulate))在PS液体培养基（1000ml含 马铃馨泥20g、薦糖2%)中振荡培养(120rpm)5天。将培养液用纱布过滤后，W将分生抱子调 整为ΙΟ5个/mL的浓度的液体作为接种源(分生抱子混悬液）。从2012年9月19日、气溫开始降 低的下午3点开始，将调制的接种源（分生抱子混悬液）用电池式肩背动力喷雾器不添加延 展剂等进行喷雾，直至植物体全体润湿的程度。
[0144] 然后，在用冷纱进行了内衬遮光的玻璃室内使其发病。从接种当日到第二天的中 午将玻璃室紧闭，保持高湿度。然后，使天窗?侧窗为自动开闭（25°C)，对溫度进行动向管 理。关于草替炭痘病患病株的调查，在10月19日对于各品种.系统作为调萎或枯死的株的 比例进行调查。调查结果示于图3。
[0145] (3)量的性状（如anti1:ative trait loci:QTL)的分析
[0146] W上述（1)中得到的遗传图谱数据和上述(2)中得到的草替炭痘病检验试验数据 (调萎?枯死株率）为基础，使用遗传分析软件QTL CartographeHWang S.，C. J.Basten, and Z.-B.Zeng(2010).Windows QTL Cartographer 2.5.Department of Statistics , North Carolina State University,Raleigh,NC)，通过复合区间作图（Composite interval mapping,CIM)法进行QTL分析。LOD的阔值使用2.5。其结果如图4所示，在草替中 间母本农2号的第23连锁群的标志物IA204069到IA201502的区间内确认了 L0D值18.3的提 示关于草替的炭痘病抵抗性的基因的存在的峰。所得的峰可W如表2所示那样确定，提示在 该峰的位置存在具有提高炭痘病抵抗性的功能的原因基因（群）。
[0147] 表2 [014 引
[0149] *:炭痘病调萎?枯死株率（％)
[0150] 此外，在表2中效果（％)的栏显示炭痘病调