萎.枯死株率。因此，在效果（％)的数 值为负的情况下，意味着该QTL与炭痘病抵抗性提高的性状连锁。
[0151] 并且，如图4所示，显示了位于该峰的附近的标志物与具有提高炭痘病抵抗性的功 能的原因基因（群)连锁而遗传，因而能够作为草替属植物炭痘病抵抗性相关作为标志物使 用。即，弄清楚了图4所示的10种标志物能够作为草替属植物炭痘病抗性相关标志物使用。
[0152] 另外，本实施例中制成的探针的碱基序列和信号值的阔值示于表3。
[0153] 表3
[0154]
[0155] 利用表3所示的探针，对于妄6。加(幸香)和草替中间母本农2号、W及后代系统 检测标志物IA204069至IA201502的信号，将结果分别示于图5~14(此外，在图5~14中，中 母2号*意味着草替中间母本农2号）。另外，将检测结果归纳显示于表4。
[0156] 表4
[0157]
[015引如表4和图5~14所示，明确了草替中间母本农2号的第23连锁群的标志物 IA204069至IA201502的区域与草替属植物中的炭痘病调萎?枯死株率（％)显示高的相关 性。
[0159] 4.基于PCR的标志物的开发
[0160] 另外，在本实施例中，设计从草替中间母本农2号的第23连锁群的标志物IA204069 至IA201502的区域中通过PCR扩增标志物IA202631和IA200826的引物。
[0161] (1)引物制作
[0162] 使用序列组装软件ATGC ver.6,从标志物IA202631和IA200826的序列信息制作识 别各个序列的引物。即，对于IA202631，设计CGGTTAACCCCTCCTAGAAAATC(IA202631F_2A:序 列号24)和TGCAGCTGTGAGGTTGTCTTTAT( IA202631R_111A:序列号25)，对于IA200826设计 CTGCAGAAAAGGGAGAAGAAGTTC (IA200826F_1 A:序列号 26)和 GCCAGATGAAATAGAAGATTAGCACC (IA200826R_259A:序列号27)。
[0163] 另外，同样地使用序列组装软件ATGC ver.6,从标志物IA202531和IA200064的序 列信息制作识别各个序列的引物。即，对于IA202531，设计GCTACTCATAGTAGGTCGATTGGAAG: 序列号 28和CTGCAGTTTACATGCAGCAGA:序列号 29,对于 IA200064设计 AAGTTCAACATTATCAAGGAAAATGAA:序列号 30 和 AATTGATAACTATTAACAGCAGTCAGG:序列号 31。
[0164] (2)PCR 扩增
[01化]对草替品种妄6。加(幸香）、草替中间母本农2号和杂交后代12个系统的基因组 DNA (15ng)，加入所述引物对和Taq聚合酶（夕力弓八^才社、Pr imeSTAR、0.5uni t)，通过PCR (将98°C10秒、55°C5秒、72°C1分钟进行30个循环后，在72°C处理3分钟，然后在4°C保存)进 行扩增。PCR扩增而得的DNA片段通过电泳（2.0%琼脂糖凝胶、TAEUOOv 30分钟）确认。将 PCR扩增标志物IA200826行而得的结果示于图15,将PCR扩增标志物IA202631而得的结果示 于图16。如图15和图16所示，与表4所示的信号数据一致，显示任一引物对均能够扩增目的 条带图案。
[0166] 另外，将PCR扩增标志物IA202531而得的结果示于图20。如图20所示，对于标志物 IA202531与表4所示的信号数据一致，显示能够通过如上所述设计的引物对扩增目的条带 图案。
[0167] 此外，对于标志物IA200064，W草替品种妄6。加(幸香）、草替中间母本农2号的 基因组DNA作为模板进行PCR，然后通过桑格尔法对PCR扩增而得的DNA片段进行测序。其结 果从妄6。加(幸香)基因组获得了序列号32所示的序列信息，从中间母本农2号基因组获 得了序列号32所示的序列信息和序列号4所示的序列信息。判明了序列号32和序列号4中的 第257位是SNP(在序列号32中为A、在序列号4中为T)。在序列号32中，从第257位的A开始的6 碱基(ATGCAT)与限制性酶化i I的识别序列(ATGCAT) -致。
[0168] 然后，将标志物IA200064与上述其他标志物同样地进行PCR扩增，对PCR扩增而得 的DNA片段加入化i I(肥B社、2unit)，在37°C处理1小时。限制性酶处理后的DNA片段通过电 泳(2.0 %琼脂糖凝胶、TAE、lOOv 30分钟)确认。将对标志物IA200064进行PCR扩增、限制性 酶处理后的结果示于图21。在具有限制性酶识别部位的妄6。加（幸香）中，在247碱基和 261碱基附近出现条带，另一方面，在中间母本农2号中，除了247碱基和261碱基附近的条带 之外，在500碱基附近出现条带。如图21所示，500碱基附近的条带与表4所示的信号数据一 致，显示能够通过如上所述设计的引物对扩增目的条带图案。
[0169] 5.炭痘病抵抗性系统的筛选
[0170] (1)基因型数据和炭痘病调萎?枯死株率
[0171] 将草替品种妄6。加(幸香）、草替中间母本农2号和杂交后代133个系统的筛选标 志物IA200826的基因型数据与炭痘病调萎?枯死株率进行比较(图17)。对草替炭痘病的抵 抗性优异的系统大多具有筛选标志物IA200826(平均10.6%)。另一方面，显示对草替炭痘 病的患病性的系统大多不具有筛选标志物IA200826(平均49.8%)。了检验的结果为显著性 水平1%，确认两平均值有显著性差异。
[0172] (2)未知系统的筛选
[0173] I.基因组DNA的提取
[0174] 重新对于草替品种妄6。加(幸香）、草替中间母本农2号的杂交后代2个系统(A和 B)，通过CTAB法提取基因组DNA。
[01巧]II.利用筛选标志物的检验
[0176] 对草替品种妄6。加(幸香）、草替中间母本农2号和杂交后代2个系统(A和B)的基 因组DNA( 15ng)，加入上述4.中设计的IA202631 引物对（IA202631F_2A和IA202631R_111A) 或者IA200826引物对（IA200826F_1A和IA200826R_259A)和Taq聚合酶（夕力弓八^才社、 ?'山日5了43、0.51111^)，通过?0?(将98°(310秒、55°05秒、72°(31分钟进行30个循环后，在72。0 处理3分钟，然后在4°C保存)进行扩增。PCR扩增而得的DNA片段通过电泳（2.0%琼脂糖凝 胶、TAE、100v 30分钟)确认。其结果示于图18。如图18所示，杂交后代A系统不保持IA202631 和IA200826的任一标志物。另一方面，杂交后代B系统保持IA202631和IA200826两种标志 物。
[0177] III.与炭痘病检验试验数据的比较
[0178] 炭痘病检验试验的结果是，杂交后代A系统和杂交后代B系统的炭痘病调萎?枯死 株率分别为80.0%和13.3 % dT检验的结果显著性水平为1 %，系统A和系统B的炭痘病调 萎?枯死株率有显著性差异。保持IA202631和IA200826标志物的杂交后代B系统的炭痘病 调萎?枯死株率低，草替炭痘病的抵抗性优异。另一方面，不保持IA202631和IA200826的任 一标志物的杂交后代A系统的炭痘病调萎?枯死株率高，草替炭痘病的抵抗性差。由W上的 结果弄清楚了，通过利用运些标志物，能够辨别炭痘病抵抗性优异的系统、炭痘病抵抗性差 的系统。
[01巧]IV.标志物间区域的PCR扩增
[0180] 对草替品种妄6。加(幸香）、草替中间母本农2号的基因组DNA(15ng)加入引物对 (IA200826F_1A和IA202631R_111A)和Taq聚合酶（夕力弓八斗才社、PrimeSTAR、0.5unit)， 通过PCR(将98°C10秒、55°C5秒、72°C2分钟进行25个循环后，在72°C处理3分钟，然后在4°C 保存)进行扩增。PCR扩增而得的DM片段通过电泳(2.0%琼脂糖凝胶、TAE、100v 30分钟）确 认。其结果示于图19。如图19所示，在草替中间母本农2号中确认了 1.4kbp的PCR扩增而得的 DNA片段。即，能够从草替中间母本农2号的第23连锁群的标志物IA204069至IA201502的区 域中通过PCR而扩增包含标志物IA202631和IA200826的区域。
[0181] 由该结果弄清楚了，从草替中间母本农2号的第23连锁群的标志物IA204069至 IA201502的区域中W-对引物对扩增多种标志物，能够辨别草替属植物炭痘病。
[0182] 本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请均直接作为参考纳入本说明书 中。
【主权项】
1. 草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物，包含草莓属植物的染色体中的由序列号1所 示的碱基序列和序列号10所示的碱基序列所夹的连续的核酸区域。2. 根据权利要求1所述的草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物，其特征在于，所述核酸 区域包含选自由序列号1~10组成的群组中的任一碱基序列或该碱基序列的一部分。3. 根据权利要求1所述的草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物，其特征在于，所述核酸 区域位于草莓属植物的染色体中的由序列号4所示的碱基序列和序列号8所示的碱基序列 所夹入的区域。4. 炭疽病抵抗性提高了的草莓属植物系统的制造方法，包括以下工序， 提取工序:提取至少一方亲本是草莓属植物的后代植物的染色体和/或该亲本草莓属 植物的染色体，和 测定工序:测定上述权利要求1~3的任一项所述的草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志 物在上述所得的染色体中存在还是不存在。5. 根据权利要求4所述的草莓属植物系统的制造方法，其特征在于，在所述测定工序 中，使用特异性地扩增所述草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物的引物，通过核酸扩增反 应，来测定该草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物存在还是不存在。6. 根据权利要求4所述的草莓属植物系统的制造方法，其特征在于，在所述测定工序 中，使用具备与所述草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物对应的探针的 DNA芯片。7. 根据权利要求4所述的草莓属植物系统的制造方法，其特征在于，所述后代植物是种 子或幼苗，由该种子或幼苗提取染色体。
【专利摘要】对于草莓属植物开发多种DNA标志物，通过使用这些多种DNA标志物来高精度地判定炭疽病抵抗性。草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物，包含草莓属植物的染色体中的由序列号1所示的碱基序列和序列号10所示的碱基序列所夹的连续的核酸区域。
【IPC分类】A01H5/00, C12Q1/68, C12N15/09
【公开号】CN105531369
【申请号】CN201480047115
【发明人】榎宏征, 西村哲, 水藤百江, 布目司, 野口裕司
【申请人】丰田自动车株式会社
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2014年9月5日
【公告号】EP3045533A1, US20160201145, WO2015034040A1