情况中，位于不同染色体的DNA序列元件可能由于染色体的 四级结构而彼此相近。在一些情况中，核酸序列元件就一级序列而言彼此远离，因为一个或 多个元件是染色体DNA序列元件而一个或多个其它元件是RNA(或cDNA)序列元件。如此，核 酸序列元件可W是，或可W在不同的核酸分子内。在运类情况中，2个或更多个核酸序列元 件可由于它们形成复合物而彼此相近。例如，非编码RNA可与基因组中的一个或多个DNA序 列元件结合。
[0030] "DNA序列元件"是指双链或单链DNA序列。在一些实施方式中，划分产物中检测到2 个或更多个DNA序列元件(例如，多核巧酸)表明运2个DNA序列元件在获得运些DNA序列元件 的一个或多个细胞中相近存在。在一些情况中，DNA序列元件是cDNA序列。例如，DNA序列元 件可W是通过RNA的逆转录生成的cDNA序列。
[0031 ]术语"标记物"和"可检测标记物"可互换地指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫 化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，可用的标记物包括巧光染料、发光剂、放射 性同位素（如32P、化）、高电子密度试剂、酶、生物素、地高辛或半抗原W及可被检测的蛋白 质、核酸或其他实体，例如通过将放射性标记物整合至与目标分子特异性反应的抗体、肤或 寡核巧酸中。可W采用本领域已知的用于使抗体偶联所述标记物的任何方法，例如，使用如 下文献中所述的方法:Hermanson，《生物结合技术》(Biocon化gate Techniques) 1996，圣迭 戈的学术出版社有限公司（Academic Press,Inc.)。
[0032] "连接"至标记物的分子(例如本文所述经标记探针)是共价(通过接头或化学键） 或非共价(通过离子、范德华力、静电或氨键)地结合标记物的分子，从而可通过检测与该分 子结合的标记物来检测是否存在该分子。
[0033] 发明详述
[0034] I.引言
[0035] 本文所述的是用于检测核酸序列元件之间的染色体或染色质相互作用的方法、组 合物和试剂盒。例如，描述了用于检测在完整核中相近的染色体DNA序列元件的方法、组合 物和试剂盒。运类方法、组合物和试剂盒可例如，用于检测基因组的生理和病理变化、分析 表观遗传基因调控、检测远端增强子元件在基因表达中的作用、鉴定参与DNA重组的DNA元 件、并检测干细胞或多潜能所需的染色体或染色质结构要求。在一些情况中，本发明的方 法、组合物和试剂盒可提供对2个或更多个核酸序列元件在细胞或细胞群中相邻的概率的 绝对或相对定量。
[0036] II.方法
[0037] 本文所述的是一种检测在细胞或完整核中相近的染色体DNA序列元件的方法，包 括:a)交联细胞或完整核中的染色体DNA，从而形成交联的DNA产物，其中在细胞中相近的染 色体DNA序列交联;b)得到交联的DNA产物;C)用内切核酸酶消化交联的DNA产物W形成含多 种交联的DNA消化片段的混合物;d)划分交联的DNA消化片段W产生多个划分产物;并且e) 检测单个划分产物中相对于基因组的一级序列在远端的2个或更多个DNA序列元件的存在， 其中在单个划分产物中检测到2个或更多个DNA序列元件表明所述2个或更多个DNA序列在 核中相近。
[0038] 本文还描述了一种检测细胞或完整核中与一个或多个染色体DNA序列元件相近的 核酸序列元件的方法，该方法包括:a)交联细胞或完整核中的染色体DNA，从而形成交联的 核酸产物，其中在细胞中相近的一个或多个染色体DNA序列元件和一个或多个RNA序列元件 交联;b)得到交联的DNA产物;C)用内切核酸酶消化交联的DNA产物W形成含有多个交联的 DNA消化片段的混合物;d)划分交联的DNA消化片段W产生多个划分产物;和e)检测单个划 分产物中就基因组的一级序列而言彼此远离的2个或更多个核酸序列元件的存在，其中在 单个划分产物中检测到2个或更多个核酸序列元件表明运2个或更多个核酸序列元件在核 中相近。
[0039] a.交联
[0040] 如本文所述，DNA可在细胞或完整核中交联W形成交联的DNA产物。在一些情况中， DNA在一个或多个细胞中交联。在其它情况中，获得或提供一个或多个完整核，并且DNA在其 中交联。获得或提供完整核的方法和组合物是本领域已知的。参见例如，Wi化ie等，Methods Mol Biol. 2008; 463:23-41W及Blobel和化tter，Science，1966; 154:3757:1662-1665。
[0041] DNA可W在细胞或完整核中交联。在一些情况中，采用可逆交联剂和方法。在其它 情况中，采用导致可逆交联的交联剂或方法。示例性的交联剂包括，但不限于，甲醒、多聚甲 醒、福尔马林、其它类似醒类和其它多功能(例如，双功能或Ξ功能)交联剂，其可将蛋白质-蛋白质、DNA-DNA、RNA-RNA、RNA-DNA、蛋白质-RNA、蛋白质-DNA或蛋白质-RNA-DNA分子共价 交联在一起。在一些情况中，用交联剂进行交联，该交联剂将蛋白质伯氨基(例如，与DNA结 合的蛋白质)与在相邻蛋白质或DNA分子中发现的其它氮原子可逆交联。
[0042] 可W合适的浓度应用交联剂。例如，交联剂可与一个或多个细胞或完整核接触持 续约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、35、40、45、50、60、80、90分钟或更长。与一个或多个细胞或完整核接触的交联剂 的浓度可 W是约 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.9、1.0、1.2、1.5、2、3、4、或约5%。在一 些情况中，可在合适的一段时间之后巧灭交联W抑制或停止交联反应。合适的巧灭试剂包 括含有一种或多种胺，例如一种或多种伯胺的试剂。合适的巧灭剂还包括，例如，甲基胺、乙 醇胺、Tris、二甲基胺、甲基乙醇胺、；甲基胺、氮丙晚、赃晚、苯胺、甘氨酸、天冬氨酸、精氨 酸和谷氨酸。
[0043] 在一些情况中，选择交联条件和交联剂使得仅相对紧密的相互作用发生交联。例 如，可选择可在约1、2、3、4、或5 A 至约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、或25胃复的距离上桥连的交联剂。作为另一个示例，可选择可在约2应和/或低于 约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或251的距离上 桥连的交联剂。作为另一个示例，可选择可在约，或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或巧A的距离上桥连的交联剂。
[0044] 在一些情况中，所述交联将与染色体DNA或染色质结合蛋白质结合的RNA分子交 联。因此，交联的DNA产物可含有DNA、RNA、蛋白质或其组合。可如本文所述检测或定量交联 的RNA分子。例如，交联的RNA分子可被逆转录并且可检测所得的cDNA产物。在一些情况中， 所述交联将RNA和DNA交联。在运类情况中，交联的DNA产物可含有RNA和DNA。可如本文所述 检测或定量RNA和DNA分子。例如，RNA分子可被逆转录并且可检测所得的cDNA产物W及染色 体DNA、或扩增子或其片段。
[0045] b.消化
[0046] 可从一个或多个细胞或完整核获得或提供交联的染色体DNA产物，然后消化。替代 地，可消化在一个或多个细胞或完整核中的交联的DNA产物，并且然后可获得交联且经消化 的DNA片段。消化交联的DNA的方法和组合物是本领域已知的。在一些情况中，通过用内切核 酸酶接触交联的DNA产物来进行消化。在一些情况中，采用非特异性核酸酶如切割任意DNA 序列的内切核酸酶，或具有2个、3个或4个碱基对识别序列的内切核酸酶。例如，可用微球菌 核酸酶或DNA酶I来消化交联的DNA产物。替代地，可用切割较大识别序列，如5、6、7、8或更多 个碱基对识别序列的内切核酸酶消化交联的DNA产物。示例性内切核酸酶包括但不限于Alu I、Apo I、Ase I、BamH I、BfuC I、Bgl II、BsaJ I、BstKT I、BstY I、化g I、Cla I、Cv化1-1、 Dpn I、Dpn II、Eco47 III'EcoR I'EcoR V、EcoP15I、Fai I、Hae III'Hind III'Hpa II、 HpyCH4 III、Kpn I、Mbo I、Mnl I、Mse I、Msp I、Nco I、Nde I、Mie I、Not I、Pst I、Rsa I、 Sac I、Sac II、Sal I、Sau3A I、Sfi I、Sma I、Taq I、Tsp509 I、Xba I、Xho I或Xma I。作为 另一种替代，可通过物理手段剪切交联的DM产物，如通过超声波或通过挤出通过小孔。
[0047] C.纯化
[0048] 在消化或物理剪切之前或之后，可从一个或多个细胞或完整核中纯化交联的DNA产 物。在一些情况中，从非交联的DNA、非交联的RNA、蛋白质、细胞碎片、细胞膜、交联剂4卒灭的 交联剂或巧灭剂中的一个或多个中纯化交联的DNA产物。在一些实施方式中，一个或多个细胞 或完整核可与含洗涂剂的溶液接触W得到交联的DNA产物，或交联的DNA产物的片段。在一些 情况中，洗涂剂包括但不限于，阴离子洗涂剂、阳离子洗涂剂、非离子洗涂剂和两性离子洗涂 剂或其组合。运类组合包括:一种或多种阳离子洗涂剂与一种或多种阴离子洗涂剂;一种或多 种阳离子洗涂剂与一种或多种非离子洗涂剂;一种或多种阳离子洗涂剂与一种或多种两性离 子洗涂剂;一种或多种阴离子洗涂剂与一种或多种非离子洗涂剂;一种或多种阴离子洗涂剂 与一种或多种两性离子洗涂剂;和一种或多种非离子洗涂剂与一种或多种两性离子洗涂剂。 在一些情况中，一种或多种阴离子洗涂剂与一种或多种非离子洗涂剂组合。阴离子洗涂剂的 非限制性示例包括烷基硫酸盐(例如，十二烷基硫酸钢)、烷基横酸盐(例如，辛烧横酸）、胆盐、 多库醋钢盐和N-月桂基肌氨酸。阳离子洗涂剂的非限制性示例包括苯扎氯锭、十六烷基氯化 苯基偶氮二氨基化晚、十二烷基Ξ甲基氯化锭、吉拉尔特试剂和Hyamine? 1622。非离子洗 涂剂的非限制性示例包括Tweei峨-20、Tweer晒-80、Triton彩X-100、Triton饭X-114、 聚乙二醇、IGEPAL、Nonidet?-P40、Piuronic? F-68、Poloxamer 407、皂巧和恥巧itol?。两 性洗涂剂的非限制性示例包括CHAPS、L-a-溶血憐脂酷胆碱、孤MAB和米替福新。
[0049] 交联的DNA产物可被进一步纯化，或替代地在消化或物理剪切之前，在消化或物理 剪切之后，或在消化或物理剪切之前和之后。纯化交联的DNA产物的方法还包括柱纯化，例 如，用阴离子交换树脂，将产物与功能化W结合核酸的珠(例如，磁珠)解育等。
[0050] d.划分
[0051] 在消化或物理剪切之后，从消化或剪切产生的交联的DNA产物的片段可被划分到 多个划分产物中。划分产物可包括多种类型的划分产物中的任一种，包括固体划分产物(如 孔或管）和流体划分产物（如油相内的水性液滴）。在一些实施方式中，运些划分产物是液 滴。在一些实施方式中，运些划分产物是微通道。划分样品的方法和组合物描述于，例如，公 开的专利申请W0 2010/036352、US 2010/0173394、US 2011/0092373和US 2011/0092376， 其全部内容各自通过引用纳入本文。
[0052] 交联的DNA划分产物产物的片段可被划分到任意数量的划分产物中。一般地，选择 划分产物的数量W确保少数、明显少数、很少、基本没有或没有划分产物含有多个交联的片 段。因此，单个划分产物中存在多个DNA序列元件表明运2个或多个DNA序列元件存在于同一 交联的片段中。类似地，单个划分产物中一个或多个RNA和一个或多个DNA序列元件的存在 表明运些序列元件存在于相同的交联的片段中。划分产物确保充分划分所需的划分产物数 量取决于多个因素，包括但不限于：（a)待查询的基因组大小；（b)消化/剪切的方法；（C)生 成的交联的片段(例如，交联的DNA片段）的数量和大小；（d)染色体构象捕获分析所需的分