辨率;和(e)所需的统计学显著性。一般而言，划分产物的数量为至少约500、1000、10000或 20000、30000、50000或更多。
[0053] 在一些实施方式中，试剂如交联的产物（例如，经消化或剪切的交联的DNA、RNA或 DNA/RNA片段）、缓冲剂、酶(例如，用于逆转录、扩增、条码化和/或测序的聚合酶）、底物、核 巧酸、引物、盐等在划分之前混合在一起，然后划分样品。在一些情况中，试剂包括聚合酶并 且在将试剂混合在一起之后不久划分样品，使得基本上全部、或大部分的聚合酶活性出现 在划分之后。在其它情况中，在聚合酶缓慢或完全不进行的溫度下混合试剂，然后划分样 品，并且调节反应溫度W使聚合酶反应进行。例如，可在冰上、5°C、或0、1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20-25、25-30或30-35°(3或更高溫度下合并试剂。 一般而言，本领域技术人员会知晓如何选择溫度，在该溫度下，一种或多种聚合酶没有活 性。在一些情况中，采用溫度和时间的组合w避免划分之前的明显聚合。
[0054] 在一些情况中，可使用一种或多种热启动聚合酶，如热启动DNA-依赖性DNA聚合酶 或宿主启动RNA-依赖性DNA聚合酶来混合试剂。因此，交联的产物(例如，经消化或剪切的交 联的DNA、RNA或DNA/RNA片段）、缓冲剂、盐、核巧酸、标记物、酶等可混合然后划分。随后，可 通过加热划分产物混合物W激活运一种或多种宿主启动的聚合酶来引发聚合反应，包括多 轮聚合。
[0055] 另外，试剂可混合在一起，而没有一种或多种引发酶促反应（例如，聚合和/或扩 增)所必需的试剂。混合物然后可被划分到一组第一划分产物混合物中，然后可通过融合运 组第一划分产物混合物和提供必要试剂的一组第二划分产物混合物来提供一种或多种必 要试剂。替代地，可向第一划分产物混合粉中加入必要试剂，而不形成第二划分产物混合 物。例如，必要试剂可分散到第一划分产物混合物油包水液滴的组中。作为另一个示例，缺 失的试剂可加入含有所述第一划分产物混合物组的一组微通道中。
[0056] 在一些实施方式中，试剂可混合在一起W形成反应混合物或被划分。随后，可向划 分产物中加入一种或多种其它试剂。例如，可向划分产物中注射一种或多种试剂。在一些情 况中，可向划分产物和流体之间的界面施加电场W打破界面并使至少一部分的流体进入划 分产物。作为另一个示例，一种或多种试剂可通过微流体技术导向微米或纳米尺寸孔中的 划分产物中。用于向划分产物注射试剂的方法、组合物和装置包括但不限于W0/2010/ 0151776所述的那些。
[0057] 可通过融合划分、注射、微流体或其它手段加入的试剂包括但不限于反交联试剂、 逆转录试剂(例如，引物和/或RNA-依赖性DNA聚合酶）、扩增试剂、检测试剂、测序试剂、连接 试剂、条码化试剂或其组合。例如，可向划分产物中加入蛋白酶(例如，蛋白酶K)来反交联。 作为另一个示例，可向划分产物中加入DNA依赖性DNA聚合酶(和任选的一种或多种引物 扩增划分产物中的核酸。作为另一个示例，可向划分产物中加入条码、引物、连接酶、聚合酶 或其组合来使划分产物中的核酸条码化。在一些情况中，条码接合到，或另外整合到或关联 固体或凝胶支持物，并且带条码(和任选的其它条码化试剂，如引物、聚合酶、连接酶或其组 合）的固体或凝胶支持物通过融合、注射、微流体或其它手段加入到一个或多个划分产物 中。
[0058] 作为另一个示例，可向划分产物中加入用于对祀DNA进行测序的试剂。运类试剂可 包括但不限于核巧酸或核巧酸类似物（例如，可检测标记的核巧酸、终止核巧酸、可逆终止 核巧酸或其组合）、聚合酶、硫酸化酶、巧光素酶、腺巧Ξ憐酸双憐酸酶或其组合。作为另一 个示例，可向划分产物中加入检测试剂。运类试剂可包括但不限于插入染料、可检测的标记 的核酸探针和/或引物、分子信标、适体或其组合。作为另一个示例，可向划分产物中加入逆 转录试剂。运类试剂可包括逆转录酶和/或逆转录引物(例如，寡脱氧胸巧引物或序列特异 性引物）。可在多个点处向划分产物中加入试剂(例如，通过注射、输注等）。例如，可向条码 化的划分产物中加入交联的片段。随后，可向划分产物中加入条码化试剂。随后，可向划分 产物中加入逆转录试剂。
[0059] 在一些实施方式中，液滴包含乳液组合物，即不互溶的流体(如水和油）的混合物。 在一些实施方式中，液滴是水性液滴，其被不互溶的运载体流体(如油)包围。在一些实施方 式中，液滴是油性液滴，其被不互溶的运载体流体(如水性溶液)包围。在一些实施方式中， 本文所述液滴是相对稳定的并在两种或更多种液滴之间具有最小聚结。在一些实施方式 中，由样品生成的液滴中至少0.0001%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、 0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10% 与其他液滴聚结。运些乳液 还可具有有限的絮凝，一种分散相从薄片中悬浮液产生的过程。
[0060] 在一些实施方式中，使油相流过包含待检测DNA序列元件的水性样品，从而形成液 滴。在一些实施方式中，包含待检测的DNA序列元件的水性样品还包括缓冲的溶液和用于检 巧化NA序列元件的巧巾或更多种引物，或2个或更多个引物对。
[0061] 该油相可包含氣化基础油，其可通过与氣化表面活性剂(如全氣聚酸)联用而进一 步稳定。在一些实施方式中，该基础油包括W下一种或多种:H阳7500、FC-40、FC-43、FC-70 或另一种常见氣化油。在一些实施方式中，该油相包含阴离子含氣表面活性剂。在一些实施 方式中，该阴离子含氣表面活性剂是Ammonium K巧tox化iTtox-AS)、K巧tox F甜的锭盐或 K巧tox F細的吗嘟基衍生物。K巧tox-AS的浓度可W是约0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、 0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%或4.0%(讯/讯）。在一些实施方式中， K巧tox-AS的浓度是约1.8%。在一些实施方式中，Kirtox-AS的浓度是约1.62% Jirtox F細的吗嘟基衍生物的浓度可W是约0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、 0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%或4.0%(w/w)。在一些实施方式中，K巧toxF甜的吗嘟基 衍生物的浓度是约1.8%。在一些实施方式中，K巧tox FSH的吗嘟基衍生物的浓度是约 1.62%。
[0062] 在一些实施方式中，该油相还包含用于调节油性质（如蒸气压、粘性或表面张力） 的添加剂。非限制性示例包括全氣辛醇和1H，1H，2H，2H-全氣癸醇。在一些实施方式中，1H， 1H，2H，2H-全氣癸醇W约0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%、 0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.25%、1.50%、1.75%、2.0%、2.25%、 2.5%、2.75%或3.0%(w/w)的浓度添力日。在一些实施方式中，lH，lH，2H，2H-全氣癸醇W约 0.18%(w/w)的浓度添加。
[0063] 在一些实施方式中，该乳液配制为生成具有类液界面膜的高度单分散液滴，其可 通过加热转化为具有类固界面膜的微胶囊;运类微胶囊可作为生物反应器W通过一段时间 的解育保持其含量。转化为微胶囊可在一经加热后即发生。例如，运类转化可发生在大于约 40°、50°、60°、70°、80°、90°或95°C的溫度下。加热过程期间，流体或矿物油覆盖物可用于阻 止蒸发。过量的连续相油可在加热前去除或留在原位。运些微胶囊可在大范围的热和机械 处理下抗聚结和/或絮凝。
[0064] 在将液滴转化成微胶囊之后，运些微胶囊可储存于约-70°、-20°、0°、3°、4°、5°、 6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°或40°C下。在一些实施方式中，运些微胶囊可用于 储存或运输划分产物混合物。例如，可在一个位置处收集样品，划分到含有酶、缓冲剂和/或 引物或其它探针的液滴中，任选地可进行一个或多个聚合反应，然后可加热该划分产物W 进行微囊化，并且可储存或运输微胶囊用于进一步分析。
[0065] 运些微胶囊划分产物可含有一种或多种探针（如本文所述经标记探针)并可抗聚 结，特别是在高溫下。因此，运些胶囊可在非常高的密度(例如每单位体积的划分产物数)下 解育。在一些实施方式中，可每毫升解育超过100000、500000、1000000、1500000、2000000、 2500000、5000000或10000000个划分产物。在一些实施方式中，样品-探针解育发生在单个 孔中，例如微量滴定板的孔，此时各划分产物之间不具有内部混合。运些微胶囊还可含有解 育所需的其他组分。
[0066] 在一些实施方式中，将样品划分成至少500个划分产物、至少1000个划分产物、至 少2000个划分产物、至少3000个划分产物、至少4000个划分产物、至少5000个划分产物、至 少6000个划分产物、至少7000个划分产物、至少8000个划分产物、至少10000个划分产物、至 少15000个划分产物、至少20000个划分产物、至少30000个划分产物、至少40000个划分产 物、至少50000个划分产物、至少60000个划分产物、至少70000个划分产物、至少80000个划 分产物、至少90000个划分产物、至少100000个划分产物、至少200000个划分产物、至少 300000个划分产物、至少400000个划分产物、至少500000个划分产物、至少600000个划分产 物、至少700000个划分产物、至少800000个划分产物、至少900000个划分产物、至少1000000 个划分产物、至少2000000个划分产物、至少3000000个划分产物、至少4000000个划分产物、 至少5000000个划分产物、至少10000000个划分产物、至少20000000个划分产物、至少 30000000个划分产物、至少40000000个划分产物、至少50000000个划分产物、至少60000000 个划分产物、至少70000000个划分产物、至少80000000个划分产物、至少90000000个划分产 物、至少100000000个划分产物、至少150000000个划分产物或至少200000000个划分产物。
[0067] 在一些实施方式中，该样品被划分到足够数量的划分产物中，使得全部、基本全部 或至少大部分划分产物含有不超过5个交联的DNA分子(例如约0.5、1、2、3、4或5个交联的 DNA、RNA、或DNA/RNA分子）。在一些实施方式中，该样品被划分到足够数量的划分产物中，使 得全部、基本全部或至少大部分划分产物含有不超过1个交联的DNA分子(例如约0.5、0.05、 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75或1个交联的0臟、3酷、或0臟/1?酷分子）。在一些实施方式中，各 划分产物中存在平均不超过5、4、3、2、1、0.75、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或0.05个交联的0魁、 RNA或DNA/RNA分子。在一些实施方式中，各划分产物中存在平均约0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、 0.5、0.75、1、2、3、4或5个交联的DNA、RNA或DNA/RNA分子。在一些实施方式中，在含有交联的 DNA、RNA或DNA/RNA分子的划分产物群中，划分产物中交联的DNA分子的模数为约1或0。
[0068] 在一些实施方式中，划分产物含有过量的检测试剂。例如，在一些实施方式中，划 分产物含有平均超过约1(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、15、20、40、50、100、150、200、250、 300、350、400、500、750、1000或更多）种引物、引物对、或用于检测祀0魁序列元件的探针分 子。在一些实施方式中，划分产物中存在用于检测多种祀DNA序列元件的多种检测试剂。例 如，可在一个或多个划分产物中检测1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的祀0魁序列元 件。
[0069] 在一些实施方式中，生成的液滴在形状和/或尺寸方面基本均匀。例如，在一些实 施方式中，运些液滴在平均直径方面基本均匀。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径 为约0.001