化构象，其中降低了巧灭程度。因此，通过监 控报告染料的发射变化可W间接监控扩增产物的形成。此类探针及其使用方法还参见例如 Piatek，A.S.等，Nat.Biotechnol.16:359-63(1998);Tyagi，S.和Kramer，F.R.，化ture Biotechnology 14:303-308(1996);和Tyagi，S.等，Nat.Biotechnol.16:49-53(1998)。
[0089] 在一些实施方式中，能够检测单个信号或多个信号的检测器被用于分析各划分产 物中是否存在目标分子。例如，在一些实施方式中，使用单色或双色读取器(巧光检测器）。 阳性计数划分产物的分数可用于确定待检测DNA序列元件的绝对浓度或相对浓度。在一些 情况中，阳性计数划分产物的分数能够确定DNA(例如，DNA或cDNA)序列元件与一个或多个 其它DNA序列元件相互作用的相对或绝对频率。
[0090] -旦确定各样品划分产物的二态"是-否"结果，即可使用基于泊松统计的算法分 析各划分产物的数据W定量样品中的目标分子含量。定量目标分子的浓度或含量的统计学 方法描述于例如W0 2010/036352,其通过引用全文纳入本文。
[0091] f.反交联
[0092] 在一些实施方式中，交联的DNA、RNA或DNA/RNA片段(例如，经消化或剪切)发生反 交联。例如，交联的片段可反交联W允许通过核酸探针杂交来进行逆转录、扩增、测序和/或 检测。在一些情况中，在划分产物中进行反交联。在一些情况中，交联的核酸在检测前经消 化或剪切，划分，然后反交联。在其它情况中，交联的核酸在检测前经划分、消化或剪切，然 后反交联。在其它情况中，交联的核酸经划分和消化或剪切(例如，任意顺序），然后检测而 不进行反交联。
[0093] 可在划分之后进行反交联。本文所用的反交联、去交联等是指处理交联的核酸片 段或交联的核酸片段组W去除在交联期间加入的一种或多种，或基本全部，或全部DNA: DNA、DNA: RNA、RNA:蛋白质、DNA:蛋白质、或RNA: DNA:蛋白质交联。例如，交联的核酸可被划 分，然后反交联。在一些情况中，经划分的交联的核酸经条码化(例如，通过连接或聚合），然 后反交联。在一些情况中，经划分的交联的核酸经反交联，然后条码化(例如，通过连接或聚 合）。在一些情况中，经划分的交联的核酸经反交联，然后扩增。在一些情况中，经划分的交 联的核酸在经过W下的一个或多个或其组合之后反交联:逆转录、扩增、测序、聚合、连接、 条码化、探针杂交或划分产物合并。在一些情况中，经划分的交联的核酸在经过W下的一个 或多个或其组合之前反交联:逆转录、扩增、测序、聚合、连接、条码化、探针杂交或划分产物 合并。
[0094] 按照需要进行反交联。在一些情况中，可通过将交联的核酸片段与蛋白酶接触来 进行反交联。示例性的蛋白酶包括，但不限于，丝氨酸蛋白酶，如蛋白酶K，膜凝乳蛋白酶，膜 蛋白酶，弹性蛋白，枯草杆菌蛋白酶;苏氨酸蛋白酶;半脫氨酸蛋白酶，如脫冬酶，组织蛋白 酶，木瓜蛋白酶;天冬氨酸蛋白酶，如肾素，凝乳酶，组织蛋白酶D，胃蛋白酶;金属蛋白酶，如 氨基肤酶，二肤酷肤酶，血管紧张素转换酶，簇基肤酶;和谷氨酸肤酶。一些情况中，蛋白酶 是蛋白酶K。在一些情况中，交联的DNA片段与蛋白酶接触持续至少约5、10、15、20、25、30、 35、40、50、60、75、90、100、120或200分钟。
[0095] 在一些情况中，通过加热交联的核酸片段来进行反交联。在一些情况中，通过将含 有交联的核酸片段的划分产物加热至至少约55°C，至少约65°C，或至少约95°C持续至少约 5、10、15、20、30、60、90、100、120、180、200、240、300、360、400、500、600、720、800、900、1000、 1500、2000或4000秒或更长来反交联交联的核酸片段。在一些情况中，通过将交联的核酸片 段与蛋白酶接触并在蛋白酶有活性的溫度下解育含交联的核酸片段的划分产物来反交联 交联的核酸片段。例如，可用蛋白酶κ接触划分产物并在约20°C至约65°C下持续至少约5、 10、15、20、30、60、90、100、120、180、200、240、300、360、400、500、600、720、800、900、1000、 1500、2000或4000秒或更长。在一些情况中，通过下述过程反交联所述交联的核酸片段:将 交联的DNA片段与蛋白酶接触，在前述蛋白酶接触时间中的一个或多个下解育，然后通过在 前述加热时间或溫度中的一个或多个下加热来灭活蛋白酶。另外，或替代地，可使用蛋白酶 变性剂或抑制剂来控制蛋白酶活性。
[0096]在一些情况中，可使用高盐缓冲液来反交联核酸。在一些情况中，与加热和/或蛋 白酶处理联合的高盐缓冲液可反交联核酸。示例性的高盐缓冲液包括，但不限于500mM至1M NaCl。可W任意组合同时或依次应用蛋白酶消化、加热和高盐缓冲液W得到反交联的核酸。 [00 97] g.连接
[0098] 在一些实施方式中，连接交联的核酸产物或其片段。例如，可连接交联的核酸产物 或其片段W添加衔接子多核巧酸。在一些情况中，衔接子多核巧酸可用于进行检测（例如， 扩增和/或测序)或条码化交联的核酸产物或其片段。在一些情况中，在划分产物中进行连 接。在一些情况中，在划分前进行连接。在一些情况中，在合并划分产物后进行连接。在一些 情况中，在逆转录后进行连接。在一些情况中，不进行连接。例如，可使用划分在下游的处理 和/或检测期间在不需要连接的情况下保持交联的核酸产物、扩增子、逆转录子或其片段在 物理上相邻。作为另一个示例，交联的核酸可经划分，然后条码化(例如，通过连接或聚合）， 并且合并划分产物。然后可使用条码来在下游处理和/或检测期间保持核酸产物、逆转录子 或其片段或扩增子的虚拟划分和/或虚拟交联。因此，检测划分产物中2个或更多个核酸序 列元件的存在可包括检测虚拟划分产物中运类核酸元件或其片段或扩增子。在一些情况 中，可在合并划分产物之前或之后，或在连接或条码化之前或之后反交联经划分的交联的 核酸。
[0099] 适用于本文所述的方法的连接方法是本领域已知的。在一些情况中，用连接酶进 行连接，该连接酶对于将2个双链DNA分子连接到一起而言是特异性的。在一些情况中，连接 需要或受到在DNA连接反应物上存在互补单链粘性末端的促进。在一些情况中，用一种或多 种W下的连接酶进行连接:T4 DNA连接酶、Tfi DNA连接酶、DNA连接酶I、DNA连接酶II、DNA 连接酶III、DNA连接酶IV或小足迹DNA连接酶。
[0100] 在一些情况中，进行连接W在反交联之前物理上连接交联的DNA片段。在一些情况 中，进行连接W整合含条码的衔接子寡核巧酸、测序引物结合位点、扩增引物结合位点和/ 或可检测标记物。在一些情况中，进行连接W制备5C或化-C文库。
[0101] 在一些情况中，可憐酸化衔接子W促进连接。可用于憐酸化多核巧酸的激酶包括， 但不限于T7多核巧酸激酶和T4多核巧酸激酶(PNK)。
[0102] 在其它实施方式中，用例如大肠杆菌DNA聚合酶I进行的切口翻译代替衔接子的连 接和憐酸化。在切口翻译中，通过来自衔接子的游离3/-OH基团或通过DNA酶I处理产生的 "切口 "在DNA内产生游离的3/-径基。DNA聚合酶I然后催化核巧酸向切口的3/-径基端的添 加(标记或未标记的）。同时，运种酶的5/-到-3/外切核酸酶活性从切口的5/-憐酷基末端消 除核巧酸单元。具有游离的y-OH基团的新核巧酸在3/方向上整合到最初切除的核巧酸的 位置上。
[0103] h.条码化
[0104] 在一些实施方式中，经划分的交联的核酸片段或其扩增子或逆转录子经条码化。 划分产物条码化使得即使在已经物理合并划分产物之后保持虚拟划分。因此，检测划分产 物中2个或更多个核酸序列元件的存在可包括检测虚拟划分产物中运类核酸元件或其片段 或扩增子。例如，检测到2个或更多个具有相同条码的核酸序列元件的存在可表示运2个或 更多个核酸序列元件位于虚拟划分产物中，并因此在细胞或完整核中相近。
[0105] 本文使用的"条码"是一种短核巧酸序列（例如，长至少约4、6、8、10、12、14或16个 核巧酸），其独特限定核酸分子、一组核酸分子(例如，一组来自特定划分产物的DNA分子）、 或特定划分产物中生成的聚合产物、或一组产物。例如，经划分的杂交的核酸(例如，DNA)片 段可与引物或一组引物杂交。各划分产物中的引物可含有不同的条码序列。然后可进行来 自杂交引物的模板导向的聚合，由此将独特条码整合到各划分产物的聚合产物中。划分产 物然后可合并，并任选扩增，而没有失去划分产物含有哪种交联的核酸片段或其聚合产物 的踪迹。因此，可对包含各条码的聚合产物或交联的核酸片段的存在或缺失进行计数（例 如，通过测序、杂交等)而不需要保持物理上的划分产物。
[0106] 条码序列的长度决定能区分多少独特性样品。例如，4个核巧酸的条码能区分不多 于44即256个样品；6个核巧酸的条码能区分不多于4096个不同样品；而8个核巧酸的条码能 标引不多于65,536个不同样品。此外，条码可接合双链分子的两条链，通过针对第一和第二 链合成的条码化引物，或者通过连接。在2条链上使用巧巾不同的条码增加了可区分的独立 事件的数量。替代地，相同条码可接合双链分子的两条链。使用相同条码可在两条链上产生 相同的条码。双重条码化可提供对混杂下游分析的后续检测误差如测序或扩增误差的检测 并且允许检测两条链中的任一条而不影响定量。本领域熟知条码技术的应用，参见例如 Katsuyuki Shiroguchi等，Digital RNA sequencing minimizes sequence-dependent bias and amplification noise with optimized single-molecule barcodes(数字式 RNA测序用优化的单分子条码降低序列依赖性偏置和扩增噪音），PNAS(2012)和Smith, AM 等，Nucleic Acids Research 化11 11,(2010)。
[0107] 在一些情况中，交联的核酸片段可经划分使得各片段含有约1个或更少的交联的 核酸片段，反交联，条码化反交联的产物，并且然后合并划分产物(例如，打破乳液）。作为另 一个示例，交联的核酸片段可经划分使得各划分产物含有约1个或更少的交联的核酸片段， 条码化交联的核酸片段，反交联，并且然后合并划分产物(例如，打破乳液）。作为另一个示 例，交联的核酸片段可经划分，条码化交联的核酸片段，合并划分产物(例如，打破乳液），并 且反交联条码化和交联的核酸片段。在一些情况中，条码化的片段允许后续检测步骤W鉴 定同一划分产物中存在那些核酸序列元件。在一些情况中，交联的核酸片段划分到含条码 的划分产物中（例如，条码连接到或整合到固体或凝胶支持物上）。在一些情况中，交联的核 酸片段经划分，随后加入(例如，通过融合、注射、微流体或其它手段)条码(例如，条码连接 到或整合到固体或凝胶支持物上）。
[0108] 在一些实施方式中，用产生含单链粘性末端的片段的内切核酸酶消化交联的DNA 产物。在一些情况中，片段可划分到划分产物中，使得划分产物含交联的DNA消化片段和与 一个或多个双链条码衔接子寡核巧酸连接或接合的固体或凝胶支持物(例如，珠如琼脂糖 珠）。在一些情况中，所述一个或多个双链条码衔接子寡核巧酸含有与由交联的DNA产物内 切核酸酶消化生成的粘性末端相容的单链粘性末端。在一些情况中，一个或多个双链条码 衔接子寡核巧酸含有用于例如PCR或测序的一个或多个引物位点。在一些情况中，运一个或 多个双链条码衔接子寡核巧酸含有限制性位点，使得通过划分产物中的消化生成相容的粘 性末端。在一些情况中，交联的DNA产物和双链条码衔接子寡核巧酸的消化产物都通过划分 产物中的消化生成。含有相容粘性末端的双链条码衔接子寡核巧酸可连接到交联的DNA消 化片段，形成条码化和交联的DNA消化片段。然后可合并划分产物并且条码化和交联的DNA 消化片段经反交联，然后经过前述的检测步骤中的一个或多个。替代地，可在消化之前但在 划分之后、双链条码衔接子寡核巧酸连接之前和/或合并划分产物之前进行反交联。在另一 个替代中，交联的DNA产物没有经反交联。
[0109] 在一个替代性实施方式中，交联的