剂量毒素的攻 击，保护率达到100 %。
【附图说明】
[0042] 图I .Eco RI/Not I双酶切pMH3S-chimereic_L质粒图谱；
[0043] 图2.Eco RI/Not I双酶切pMH3S-chimereic_H质粒图谱；
[0044] 图3.四株单克隆抗体纯化后的还原电泳图谱；
[0045] 图4.四株单克隆抗体的抗原结合特异性比较图；
[0046] 图5.单株抗体在小鼠体内的保护活性示意图；
[0047]图6.不同浓度的混合抗体在小鼠体内的保护活性示意图。
【具体实施方式】
[0048] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
[0049] 实施例1:抗破伤风中和性单克隆抗体的制备
[0050] 1.鼠源单克隆抗体基因的克隆
[00511 1.1鼠源单抗的制备
[0052] 以重组破伤风TeNT-Hc蛋白（CN200910135972.0)为免疫原，采用常规单克隆抗体 制备方法获得的4株高亲和力、高特异性的鼠源性抗破伤风单抗TY1、TY5、TY8和TYll杂交瘤 细胞株，分泌的抗体分子亚型为IgGl，轻链为Kappa亚型。
[0053] 1.2单抗可变区基因的克隆
[0054]单抗由可变区和恒定区构成，因为鼠单抗的可变区基因变异大，而恒定区的基因 序列非常保守，因此采用5'-RACE方法进行克隆，其基本原理是在未知序列的5'端添加引物 序列，与3'端的保守序列进行PCR扩增。获得的鼠源单抗基因可用于构建表达载体，然后转 染哺乳动物细胞，获得稳定表达的细胞株，最终获得表达产物。
[0055]操作包括如下步骤：
[0056] A:总RNA的提取;B:RNA的去磷酸化;C:去帽子反应;D: 5 -RACE适配子连接;E:反转 录反应;F:外引物PCR反应;G:内引物反应;H:琼脂糖凝胶电泳；I:切胶回收特异性PCR产物 连接到T载体上进行DNA序列测定;J: BLAST检索分析序列的正确。具体参考说明书(TaKaRa， D315)。简单描述如下：
[0057] A:总RNA的提取:取处于对数生长期的5E11杂交瘤细胞(5 XlO6)，采用Trizol-步 法提取总RNA，取少量进行紫外分光光度计定量及1%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0058] B:RNA的去磷酸化:使用CIAP(TaKaRa，D315)，反应体系50μ1，包括总RNA 2μ1 (lyg/ 41)，冊厶86抑制剂1以1(40厘/厘1)，10\缓冲液541，(：1厶？0.641，（16厘/^1)，50°(3反应1小 时。
[0059] C:去帽子反应:CIAP处理过的RNA 7μ1，NRAse抑制剂ΙμL (40Μ/μ1)，10 X缓冲液1μ 1，TAP 叫1，（0.5厘/^1)，37°(3反应1小时。
[0060] D:5 -RACE适配子连接：连接体系40μ1，依次加入CIAP/TAP处理过的RNA5yl，5 RACE适配子（15yM)lyl，NRAse的水4yl;65°C反应5分钟后，冰上放置2分钟，然后依次加入 NRAse抑制剂ΙμL (40M/ML)，5 X 连接缓冲液8μ1，40% 的PEG 600020μ1，T4RNA连接酶ΙμL， 16°C反应1小时。
[00611 E:反转录反应:反应体系包括连接后的RNA为6μ1，随机引物0.5μ1，55 X缓冲液2μ 1，(1町？141，冊八86抑制剂0.2541(40厘/^1^)，]\^1^0.2541(200厘/^1)。混匀，30。(31011^11，50 °C60min，5°C5min。反应产物置于-20°C备用。
[0062] F:外引物 PCR 反应：反应体系为 Ex Taq 聚合酶（5M/yL)0.25yL;10XEx Taq Βμ ffer 5yL;dNTP Mixtyre(各2.5mM)4yL;模板cDNA 2·5μL;5/RACE外引物2μl，特异性外引物 2μ1，加灭菌蒸馏水至50yL，混勾，瞬时离心后，置PCR仪上反应。反应条件:94°C预变性3分 钟，接着 94°C30s，52°C30s，72°Clmin，35 个循环，最后 72°C 延伸 7min。
[0063] G:内引物反应:除模板为外引物反应液，引物使用内引物外，其余反应液体同外引 物PCR反应。
[0064] H:琼脂糖凝胶电泳:扩增产物H和L经琼脂糖凝胶（1 % )电泳后，切胶分离靶片段。 通过凝胶纯化试剂盒(BIO BASIC INC)回收纯化后，凝胶电泳鉴定。
[0065] I:切胶回收特异性PCR产物连接到T载体上进行DNA序列测定:将回收后的PCR产物 连入PMD18-T载体。连接反应体系为:pMD18-T载体lyl，PCR产物凝胶纯化重链(或轻链)3μ1， 去离子水UU，连接缓冲液5μ1，混匀后16°C过夜，转化大肠杆菌DH5a，筛选重组克隆，然后采 用通用测序引物测序。获得的质粒命名为pMD-mous e-VL和pMD-mous e - VH。
[0066] 测序后，对获得的基因序列用Vector NTI软件进行分析，结果如下：
[0067] 鼠源单抗TYl轻链可变区核苷酸编码序列全长为336个碱基，序列如SEQ ID NO: 1 所示，多肽序列112个氨基酸，序列如SEQ ID NO: 2所示。可变区包括4个框架区（Fragment region，FR)和3个CDR(Complementary determinant region，CDR)，其中SEQ ID N0:1 的 1-78位(SEQ ID N0:2的1-26位为相应的氨基酸序列）碱基编码FR1，79-111位碱基（27-37位） 编码CDRl; 112-162位碱基(38-54位)编码FR2,163-171 位碱基(55-57位)编码CDR2; 172-279 位碱基(58-93位)编码FR3，280-306位碱基(94-102位)编碱基码CDR3; 307-336位碱基（103-112位)编码FR4。重链可变区核苷酸编码序列全长为345个碱基，序列如SEQ ID N0:3所示， 多肽序列115个氨基酸，序列如SEQ ID NO: 4所示。其中1-75位（1-25位)碱基编码FRl，76-99 位碱基（26-33位)编码CDRl; 100-150位碱基（34-50位)编码FR2，151-174位碱基（51 -58位） 编码 CDR2; 175-288位碱基（59-96位）编码 FR3,289-312位碱基（97-104)编码 CDR3; 313-345 位碱基（105-115)编码FR4。
[0068] 鼠源单抗TY5轻链可变区核苷酸编码序列全长为336个碱基，序列如SEQ ID N0:5 所示，多肽序列112个氨基酸序列，如SEQ ID NO: 6所示。可变区包括4个框架区（Fragment region，FR)和3个CDR(Complementary determinant region，CDR)，其中 1-78位（1-26位）喊 基编码FRl，79-111 位碱基（27-37位)编码CDRl; 112-162位碱基（38-54位)编码FR2,163-171 位碱基(55-57位)编码CDR2; 172-279位碱基(58-93位)编码FR3，280-306位碱基(94-102位） 编码CDR3; 307-336位碱基（103-112位)编码FR4。重链可变区核苷酸编码序列全长为345个 碱基，序列如SEQ ID N0:7所示，多肽序列115个氨基酸，序列如SEQ ID N0:8所示。其中1-75 位（1-25位)碱基编码FRl，76-99位碱基(26-33位)编码CDRl; 100-150位碱基(34-50位)编码 FR2，151 -174 位碱基（51 -58 位）编码 CDR2; 175-288位碱基（59-96位）编码 FR3，289-312位碱 基(97-104位)编码 CDR3; 313-345位碱基（105-115 位)编码 FR4。
[0069] 鼠源单抗TY8轻链可变区核苷酸编码序列全长为336个碱基，序列如SEQ ID N0:9 所示，多肽序列112个氨基酸，序列如SEQ ID NO: 10所示。可变区包括4个框架区（Fragment region，FR)和3个CDR(Complementary determinant region，CDR)，其中 1-78位（1-26位）喊 基编码FRl，79-111 位碱基（27-37位)编码CDRl; 112-162位碱基（38-54位)编码FR2,163-171 位碱基(55-57位)编码CDR2; 172-279位碱基(58-93位)编码FR3，280-306位碱基(94-102位） 编码⑶R3; 307-336位碱基（103-112位)编码FR4。重链可变区核苷酸编码序列全长为357个 碱基，序列如SEQ ID NO: 11所示，多肽序列119个氨基酸，序列如SEQ ID NO: 12所示。其中1-75位（1 -25位)碱基编码FRl，76-99位碱基(26-33位)编码CDRl; 100-150位碱基(34-50位)编 码 FR2,151-174 位碱基（51-58 位）编码 CDR2; 175-288位碱基（59-96 位)编码 FR3,289-324位 碱基(97_1〇8位)编码CDR3; 325_357位碱基（1〇9_119位)编码FR4。
[0070] 鼠源单抗TYll轻链可变区核苷酸编码序列全长为321个碱基，序列如SEQ ID NO: 13所示，多肽序列107个氨基酸，序列如SEQ ID NO: 14所示。可变区包括4个框架区 (Fragment region，FR)和3个CDR(Complementary determinant region，CDR)，其中 1_78位 (1-26位）碱基编码FRl，79-96位碱基（27-32位）编码CDRl; 97-147位碱基（33-49位）编码 FR2，148-156位碱基（50-52 位)编码 CDR2; 157-264位碱基（53-88位)编码 FR3，265-291 位碱 基(89-97位)编码CDR3;