以CA19-9 cDNA片段为模板制备RNA探针的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于核酸诊断领域，具体涉及一种以CA19-9cDNA片段为模板制备RNA探针 的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 焚光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization，FISH)是一种重要的 非放射性原位杂交技术，荧光染料标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA或RNA分子杂 交，如果被检测的染色体靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性， 由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而探针可以直接与染色体进行 杂交从而将特定的基因在染色体上定位。通过在荧光显微镜下观察荧光信号，以确定与特 异探针杂交后结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位，对待 测DNA进行定性、定量或相对定位分析。
[0003] 荧光原位杂交技术(FISH)具有很多优点，无需放射性同位素标记，安全性较高； FISH的实验周期短，探针稳定性强;通过多次免疫化学反应，使其杂交信号放大，提高灵敏 度，检测的灵敏度接近同位素探针杂交;FI SH的分辨率高达3-20Mb; FI SH可以用不同修饰核 苷酸分子标记不同的探针，即可以制备成多色探针。
[0004] FISH技术已经在基因定位、基因作图、基因扩增和缺失的检测、产前诊断、哺乳动 物染色体进化研究等领域得到了广泛应用，特别是在肿瘤诊断方面，FISH技术被广泛用于 乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤等实体瘤的早期诊断、疗效检测、个体化治疗和预后判断等几 个方面。cRNA探针比cDNA探针有更多的优势:避免了双链cDNA探针在杂交反应中两条链之 间易复性的可能性，提高了杂交反应的敏感性;cRNA与RNA之间形成的杂交体比cDNA-RNA杂 交体更稳定;且cRNA-RNA之间形成的杂交体不受RNA酶的影响，因此杂交反应后可用RNA酶 处理，以除去未结合的探针，可降低本底信号的影响。
[0005] 制备特异性强、灵敏度高和稳定性强的肿瘤检测探针，生产易保存和运输的相关 试剂及试剂盒，对肿瘤早期诊断和治疗至关重要。研发出用于诊断和治疗多种肿瘤的高品 质探针及相关试剂盒，不仅能提高人民的健康水平，而且具有很大的经济效益、社会效益及 广阔的市场前景。
[0006] CA19_9(carbohydrate antigen 19-9)是一种粘蛋白质的糖类蛋白肿瘤标志物， 为细胞膜上的糖脂质，因由鼠单克隆抗体119NS199-9识别而命名。CA19-9是一种分子量为 5000KD的低聚糖类肿瘤相关抗原，由内胚层细胞分化而来的，正常人血清中含量甚微，而在 多种上皮类恶性肿瘤血清中均可见增高。
[0007] 在血清中CA19-9以唾液粘蛋白形式存在，分布于正常胎儿胰腺、胆囊、肝、肠和正 常成年人胰腺、胆管上皮等处。正常情况下CA19-9的合成量极微，但当上述组织出现异常 时，尤其是恶性肿瘤时，其合成量可以显著增加，造成血清中的CA19-9增加。CA19-9是迄今 报道的对胰腺癌敏感性最高的标志物，胰腺癌的CA19-9最高水平是正常均值的683倍，故其 是胰腺癌较好的标志物。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种以CA19-9CDNA为模板制备RNA探针的方法。
[0009] 本发明所述的以CA19-9cDNA为模板制备RNA探针的方法，包括以下步骤:A.针对 CA19-9mRNA序列筛选多个靶序列，对于每个靶序列设计至少一对引物，所述引物的PCR扩增 产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列;B.从CA19-9cDNA质粒中，采用步 骤A的所述引物，通过PCR扩增得到所述多重DNA片段，纯化后混合，作为模板;C.加入RNA聚 合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，纯化后得到RNA探针。
[0010]根据本发明所述的以CA19-9cDNA为模板制备RNA探针的方法的进一步特征，所述 RNA聚合酶是Trc RNA聚合酶，引物的5 '端分别加上Trc启动子序列。
[0011] T7 启动子序列：5 ' -TAATACGACTCACTATAG-3'
[0012] SP6启动子序列：5 ' -CATACGATTTAGGTGACACTATA-3'
[0013] T3启动子序列:5 ' -AATTAACCCTCACTAAAG-3'
[0014] Trc启动子序列：5 ' -TGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAAT-3'
[0015] 上述四种RNA聚合酶与相应启动子的组合为同类型的设计，可以替换使用。
[0016]根据本发明所述的以CA19-9cDNA为模板制备RNA探针的方法的进一步特征，所述 步骤A中，所述筛选包括:筛选2-50个无内含子和重复序列的特定目标序列区域，根据需要 可选择同源区域序列，作为靶序列。
[0017] 本发明进一步提供了一种快速检测胰腺癌相关的CA19-9表达的试剂盒
[0018] 本发明所述的试剂盒包括根据本发明所述的方法所制备的RNA探针。
[0019] 本发明所述的方法只用一步反应即可制备200-500nt理想长度的CA19-9CRNA探 针，并且可直接用于下一步的杂交试验，可以提高试验效率，节约检测时间。探针制备过程 不需要碱裂解等步骤，可得到的探针长度均一性好，从而增强了探针特异性，降低了背景信 号干扰，并节约大量实验时间。
[0020] 本发明所述的方法有利于筛选和制备高特异性CA19-9探针，并可消除非编码RNA 等非特异性信号的影响。
[0021] 本发明所述的方法制备的CA19-9探针，其用途是生产在受试者样本中区分胰腺癌 样本和正常样本的试剂盒。
[0022] 本发明还提供了用于在受试者样本中区分胰腺癌样本和正常样本的试剂盒。
[0023] 本发明所述的用于在受试者样本中区分胰腺癌样本和正常样本的试剂盒，包括： (a)适合于检测胰腺癌的检测试剂；以及(b)适合于测定由所述检测试剂检测的胰腺癌的定 量的设备。
[0024]本发明首次用多重DNA片段作为模板，针对CA19_9cDNA序列设计多对引物，并在反 向引物5'端加上启动子或RNA聚合酶结合序列，以使最终得到的RNA探针能够全部覆盖所有 靶序列。本发明探针制备方法简化了探针制备步骤，大幅度缩短整个实验时间，更重要的 是，探针特异性和稳定性更强，降低背景信号，灵敏度更高。在此基础上，本发明提供了多种 肿瘤初诊快速检测方面的新用途和相关的普遍适用的试剂盒。
[0025]传统的探针标记方法直接以cDNA作为标记模板。制备检测mRNA的探针时，一般是 应用全长cDNA克隆质粒或PCR产物作为模板，利用RNA聚合酶或DNA聚合酶制备RNA或DNA探 针。但是，大部分基因 cDNA在lOOObp以上，如直接进行杂交反应会因探针长度太长而不利于 进入细胞和杂交，且会产生非特异性背景信号。制备的RNA或DNA探针一般需碱裂解或DNA酶 处理，使探针裂解成lOOObp以下的片段。然而，RNA碱裂解或DNA酶处理过程和程度不易控 制，因此探针质量难以保证。
[0026] 本发明所述的方法的优势在于:采用包含所述目的序列的多条DNA片段通过一步 反应即可制备100-500nt理想长度的RNA探针，并且可直接用于下一步的杂交试验。探针制 备过程不需要碱裂解等步骤，就可得到长度均一性好的探针，为杂交试验理想长度的片段， 因此增强探针特异性，降低背景信号干扰，并节约大量实验时间，提高了试验效率。
[0027] 现有的RNA探针标记的方法都很难有效地将标记好的探针长度控制在这范围内。 因此，现有技术必须借助碱裂解(RNA探针)去降解标记好的探针以达到上述理想长度。
[0028] PCR反应可以精确地控制产物的长度，但用PCR直接标记探针的效率不高，而且很 多用于PCR反应的酶都不能有效地将标记的dUTP掺入到产物中去。PCR反应也不能用于标记 RNA探针。
[0029] 本发明是利用PCR反应可以精确控制产物长度的特点，用其制备多个的理想长度 的DNA片段作为模板去标记探针，这样在DNA模板水平就有效地控制了标记的探针长度，制 备的RNA探针不用RNA碱裂解或DNA酶处理过程而直接用于杂交反应。此外，用多个的理想长 度的DNA片段作为模板，还能根据检测目的的需要而有效地覆盖特定的目标基因序