列。同时 在每一个引物末端加上RNA聚合酶结合序列，使多个的理想长度的DNA片段可同时在同一标 记反应中作为模板可以制备RNA探针。
[0030] 下表1比较了常规制备探针的方法与本发明所述的方法的异同。
[0031]
[0033]本发明所述的方法有利于筛选和制备高特异性探针，并可消除非编码序列及其它 非特异性序列的影响。多重DNA片段的设计对检测序列更有针对性，不仅排除了一些非编码 序列及其它非特异性序列，也能使探针的特异性大大提高。
[0034] 本发明所述的方法有利于区分同源性序列及RNA的不同剪切形式。本发明多重DNA 片段的设计可根据检测对象来确定加入或删除一些同源性序列，也可以只包含或不包含不 同剪切形式而达检测特异性目标序列的目的。
[0035] 此外，本发明中设计引物时，在反向引物5'端加上启动子序列或RNA聚合酶结合序 列，可确保每个片段都能转录成探针，针对目标序列设计多对引物，能够保证探针覆盖靶基 因所有特异的区域。
【附图说明】
[0036]图1是以CA19_9cRNA为模板设计、制备及标记RNA探针的原理不意图。首先根据目 的序列CA19-9cRNA序列设计引物，引物的5 '端加上T7启动子序列;再用PCR方法分别扩增出 目的DNA片段并纯化；以混合的PCR产物作为标记模板，进行RNA聚合酶反应，将带有生物素 标记的UTP掺入产物中，纯化后即得到RNA探针。
[0037] 图2是采用本发明所述方法制备的RNA探针在FISH中的实验结果。用生物素标记的 CA19-9cRNA探针检测人胰腺癌细胞SW1990的CA19-9mRNA表达水平。
【具体实施方式】
[0038] 实施例一：以CA19_9cDNA为模板制备RNA探针
[0039] 以CA19-9cDNA为模板制备RNA探针的过程参见图1。
[0040] -、PCR引物的设计：
[0041 ] (1)在GenBank(http: //www.ncbi · nlm.nih · gov/genbank/)中查找CA19_9mRNA序 列，用NCBI BLAST(http: //blast .ncbi .nlm.nih. gov/Blast · cgi)排除其它非特异性RNA序 列。
[0042] (2)筛选2个无内含子和重复序列特定序列区域，排除同源区域序列。
[0043] (3)所选的每个区域各设计至少一对引物，使扩增产物长度为200_500bp，并覆盖 CA19-9 全长。
[0044] 引物的设计：
[0045]
[0046] 上表所涉及的引物仅仅是举例，本领域技术人员可以根据本发明的原理设计出更 多的合适的引物。
[0047] (4)将T7启动子序列加在反向引物的5'端，以确保PCR产物与目的片段互补并包含 全部靶序列。
[0048] T7 启动子序列：5 ' -TAATACGACTCACTATAG-3'
[0049] T7启动子序列可以用同类型的SP6启动子序列、T3启动子序列或Trc启动子序列替 代。
[0050] 二、标记模板的制备:通过PCR从cDNA质粒模板(GeneCopoeia cDNA质粒库），扩增 带有T7启动子的目的片段。
[0051 ] 三、RNA探针的制备：
[0052] 配置lOXNTPs，其中，ATP、CTP和GTP的浓度均为10mM，UTP的浓度为3.5mM。在一个 RNase-free(无 RNA酶）的EP中，在RNase-free的环境中操作，加入以下成分：
[0053]
[0055] (1)混匀反应液，于37 °C下反应2_3h。
[0056] (2)加入lyL DNase I(DNA聚合酶I)和5yL DNase I buffer(DNA聚合酶I缓冲液）， 混匀后于37°C下15min，以除去模板DNA。
[0057] (3)加入2yL 0.5M EDTA(PH 8.0)(乙二胺四乙酸），65°C下反应lOmin以终止反应。
[0058] (4)取2-3yL的产物电泳检测，缓冲液用1 XM0PS(3-吗啉丙磺酸）。
[0059] (5)加入100yL DEPC(焦碳酸二乙酯）水，150yL苯酚和200yL氯仿至EP管中，震荡混 勾，lOOOOrpm 离心 10min。
[0060] (6)上清液转移至新的EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀静置10min后，12000rpm 离心10min，去上清。
[0061] (7) 75 %的酒精洗涤沉淀后，加 DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶解，测产物浓度并电泳检 测，保存于-20 °C。
[0062] 由此，得到以CA19_9cDNA片段为模板制备的RNA探针。
[0063]将上述方法得到的生物素标记的RNA探针用于检测人胰腺癌细胞SW1990(购自 ATCC)的 CA19-9mRNA 表达水平。
[0064]在荧光显微镜下观察，实验结果如图2所示。左图：用DAPI即4 '，6-二脒基-2-苯基 口引噪(4'，6-diamidino_2-phenylindole)染色，蓝色焚光显示细胞核。中图：用所述探针与 目的mRNA杂交，红色荧光显示人胰腺癌细胞SW1990的CA19-9mRNA分布及表达水平。右图为 左图与中图的合成图像，直观地显示细胞核与CA19-9mRNA的相对位置。
【主权项】
1. 一种以CA19-9 cDNA为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，包括以下步骤： A. 针对CA19-9 mRNA序列筛选多个靶序列，对于每个靶序列设计至少一对引物，所述引 物的PCR扩增产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列； B. 从CA19-9 cDNA质粒中，采用步骤A的所述引物，通过PCR扩增得到所述多重DNA片段， 纯化后混合，作为模板； C. 加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，纯化后得到RNA 探针。2. 根据权利要求1所述的以CA19-9 cDNA为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，所述 RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶，引物的5 '端加上T7启动子序列。3. 根据权利要求1所述的以CA19-9 cDNA为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，所述 RNA聚合酶是SP6 RNA聚合酶，引物的5 '端分别加上SP6启动子序列。4. 根据权利要求1所述的以CA19-9 cDNA为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，所述 RNA聚合酶是T3 RNA聚合酶，引物的5 '端分别加上T3启动子序列。5. 根据权利要求1所述的以CA19-9 cDNA为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，所述 RNA聚合酶是Trc RNA聚合酶，引物的5 '端分别加上Trc启动子序列。6. 根据权利要求1所述的以CA19-9 cDNA为模板制备RNA探针的方法，其特征在于:所述 步骤A中，所述筛选包括:筛选2-50个无内含子和重复序列的特定目标序列区域，根据需要 可选择同源区域序列，作为靶序列。7. -种快速检测胰腺癌相关的CA19-9表达的试剂盒，其特征在于:包括根据权利要求1 所述的方法所制备的RNA探针。
【专利摘要】本发明提供了一种以CA19-9？cDNA为模板制备RNA探针的方法。该方法包括以下步骤：针对CA19-9？mRNA序列筛选多个靶序列，对于每个靶序列设计至少一对引物，所述引物的PCR扩增产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列；从CA19-9？cDNA质粒中，采用上述引物，通过PCR扩增得到所述多重DNA片段，纯化后混合，作为模板；加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，纯化后得到RNA探针。本发明得到的cRNA探针能够全部覆盖所有靶序列，简化了探针制备步骤，大幅度缩短整个实验时间，探针特异性更高，稳定性更强，背景信号更低且灵敏度更高。在此基础上，本发明提供了一种快速检测胰腺癌相关的CA19-9表达的试剂盒。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/10, C12N15/11
【公开号】CN105567845
【申请号】CN201610083165
【发明人】徐学明, 鲁隼, 冯俊清
【申请人】广州复能基因有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年2月5日