甲藻突变株M1，M6，M7在C27N7.5液体培养基中(葡萄糖27g，酵母浸粉7.5g，海盐25g，加水至1L)培养，摇床设置参数为转速180rpm，温度25°C。
[0063]步骤为:接种时取OD49Q1?为0.8的新鲜细胞5mL加入20mL培养基中，每组做3个平行样，用UV-1750分光光度计测定波长为490nm下的吸光值，每12h测量一次，绘制柱状图。
[0064]可以观察到在液体培养基C27N7.5中，突变株的生长速率比野生株要快，这一结果表明Rubisco基因的缺失加快了隐甲藻细胞的生长速率。
[0065]实施例1
[0066]—种隐甲藻突变体的构建方法，包括下述步骤:
[0067](I)隐甲藻ATCC 30556光合作用相关基因Rubisco的克隆:
[0068]取隐甲藻ATCC30556cDNA溶液 10ng，5 XPhus1n HF buffer 4yL，10μΜ的dNTP
0.4μ?，10μΜ Rubisco基因上游引物 1μ?、10μΜ Rubisco基因下游引物lyL，Phus1n酶0.2yL，无菌水12.4yL，在PCR管中混匀;将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为:98°C30s;98 °C I Os，55 °C 30 s，72 °C 30s，共30个循环，4 °C 5min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻Rubisco基因片段，连入pTZ57R/T载体(Thermo FisherScientific)并测序;
[0069](2)同源双交换片段的构建:
[0070]①Rubisco基因上游片段的扩增:
[0071]取隐甲藻ATCC30556基因组溶液 10ng，5 XPhus1n HF buffer 4yL，ΙΟμΜ的dNTP
0.4μ?，10μΜ仙1^8(30基因上游片段的上游引物]^1^、1(^1 Rubisco基因上游片段的下游引物IyL，Phus 1n酶0.2yL，无菌水12.4yL，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为:981€308;98°(:108，551€308，721€308，共30个循环，41€5111丨11，将？0?产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻Rubisco基因的上游片段；
[0072]②Rubisco基因下游片段的扩增:
[0073]取隐甲藻ATCC30556基因组溶液 10ng，5 XPhus1n HF buffer 4yL，10μΜ的dNTP
0.4μ?，10μΜ仙1^8(30基因下游片段的上游引物]^1^、1(^1 Rubisco基因下游片段的下游引物IyL，Phus 1n酶0.2yL，无菌水12.4yL，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为:981€308;98°(:108，551€308，721€308，共30个循环，41€5111丨11，将？0?产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻Rubisco基因的下游片段；
[0074]③潮霉素抗性基因(hpt)的扩增:
[0075]取pCAMBIA1301植物表达载体溶液 10ng，5 XPhus1n HF buffer 4yL，ΙΟμΜ的dNTP0.4yL，I ΟμΜ 上游引物 I yL、I ΟμΜ 下游 I yL，Phu s i on酶0.2yL，无菌水 12.4yL，在 PCR 管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为:98°C30s;98°C10s，55°C30s，72°C40s，共30个循环，4 °C 5min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得潮霉素抗性基因片段；
[0076]④目的片段的扩增:
[0077]以上游片段、潮霉素B抗性片段(hpt片段)、下游片段为模板进行融合PCR，步骤为:各取上游片段、下游片段、hpt片段各1ng为模板，5 XPhus1n HF buffer 4yL，10μΜ的dNTP
0.4口1^，？11118；[011酶0.241^，无菌水10.441^，以1(^1 Rubisco 基因上游片段的上游引物 lyL、10μM Rubisco基因下游片段的下游引物IyL，在PCR管中混匀。将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为:981€308;98°(:108，601€608，721€308，共30个循环，41€5111丨11，将？0?产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得目的片段(上游片段、潮霉素B抗性片段、下游片段融合PCR产物)；
[0078](3)目的片段的转化:
[0079]无菌条件下，接种隐甲藻菌液于液体C9N2培养基中，取隐甲藻悬浮培养48h的细胞10mL，4°C，3500rpm离心5min，弃上清。加入ImL 25mM DTT溶液，30°C水浴 15min。离心5min，弃上清。1mL IM山梨糖醇(sorbitol)清洗细胞三次，ImL山梨糖醇重悬细胞备用。在无菌条件下去200yL隐甲藻感受态细胞至于2mm电极杯中，加入IyL鲑鱼精DNA和2yg目的片段混匀，冰浴5min。电击转化条件为2.0kV，电阻200Ω，电容25yF，电击之后冰浴5min。加入2mL新鲜C9N2培养基25°C，180rpm震荡复苏48h。取50yL细胞悬浮液骏图涂布在含有40mg/L潮霉素B的C9N2固体平板上，倒置培养2周。将平板上长出的单克隆细胞挑出，重新在潮霉素B的抗性平板上划线，进行转化子的复筛。待长出单克隆细胞，转接液体培养。
[0080](4)突变体的生长鉴定:
[0081 ]所得的隐甲藻突变株Ml，M6，M7在C27N7.5的液体培养基中(葡萄糖27g，酵母浸粉7.5g，海盐25g，加水至1L)培养，摇床设置参数为转速180rpm，温度25°C。
[0082]步骤为:接种时取OD49Q1?为0.8的新鲜细胞5mL加入20mL培养基中，每组做3个平行样，用UV-1750分光光度计测定波长为490nm下的吸光值，每12h测量一次，绘制柱状图(图
Do
[0083]从图1中可以观察到在液体培养基C27N7.5中，突变株的生长速率比野生株要快，这一结果表明Rubisco基因的缺失加快了隐甲藻细胞的生长速率。
[0084]所述液体C9N2培养基:葡萄糖9g，酵母浸粉2g，海盐25g，加水至1L。
[0085]所述固体C9N2培养基:葡萄糖9g，酵母浸粉2g，海盐25g，琼脂粉15g加水至1L。
[0086]所述C27N7.5液体培养基:葡萄糖27g，酵母浸粉7.5g，海盐25g，加水至1L。
[0087]实施例2
[0088]本实施例与实施例1基本相同，只是使用的菌株为隐甲藻ATCC30772。
【主权项】
1.一种高生长速率的隐甲藻突变株的构建方法，其特征是包含如下步骤: 1)隐甲藻光合作用相关基因核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶Rubisco的克隆: 采用隐甲藻的Rubisc0序列(EB086308.1)设计上游引物和下游引物，以隐甲藻的cDNA为模板进行PCR，纯化目的片段，连入pTZ57R/T载体(Thermo Fisher Scientific)并测序； 2)用于同源双交换整合的基因片段的构建: ①隐甲藻Rubisco基因上游片段的扩增: 以隐甲藻基因组为模板，Rubisco基因上游片段的上游引物、下游引物进行PCRd^PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻Rubisco基因的上游片段； ②隐甲藻Rubisco基因下游片段的扩增: 以隐甲藻基因组为模板，Rubisco基因下游片段的上游引物、下游引物进行PCRd^PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻Rubisco基因的上游片段； ③潮霉素抗性基因片段的扩增: 以PCAMBIA1301植物表达载体为模板，hpt上下游引物进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得潮霉素抗性基因片段； ④用于同源双交换删除Rubisco基因的DNA片段的构建: 以隐甲藻Rubisco基因上游片段、隐甲藻Rubisco基因下游片段、以及含有hpt基因的DNA片段模板，进行融合PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得目的片段。 3)Rubisc0基因的的删除和突变株的构建: ①隐甲藻感受态细胞的制备: 取隐甲藻悬浮培养48h的细胞10mL，4°C，3500rpm离心5min，弃上清，加入ImL 25mM DTT溶液，30°C水浴15min，离心5min，弃上清，1mL IM山梨糖醇(sorbitol)清洗细胞三次，ImL山梨糖醇重悬细胞备用； ②隐甲藻感受态细胞的转化: 在无菌条件下取200yL隐甲藻感受态细胞置于2mm电极杯中，加入IyL鲑鱼精DNA和2yg目的片段混匀，冰浴5min，电击转化条件为2.0kV，电阻200 Ω，电容25yF，电击之后冰浴5min，加入2mL新鲜液体C9N2培养基，25°C，180rpm震荡复苏48h，取50yL细胞悬浮液均匀图涂布在含有40mg/L潮霉素B的固体C9N2培养基平板上，倒置培养2周，将平板上长出的单克隆细胞挑出，重新在潮霉素B的抗性平板上划线，进行转化子的复筛，待长出单克隆细胞，转接液体培养，并进行突变体鉴定； 4)删除突变体的分子生物学鉴定: 分别提取野生型和突变株隐甲藻细胞的基因组，以hpt基因上下游引物进行PCRJ^PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳； 5)删除突变体的生长特性分析: 所得的隐甲藻突变株M1，M6，M7在C27N7.5的液体培养基中培养，摇床设置参数为转速180印111，温度25°(:; 步骤为:接种时取0D49Q?为0.8的新鲜细胞5mL加入20mL培养基中，每组做三个平行样，用UV-1750分光光度计测定波长为490nm下的吸光值，每12h测量一次，绘制柱状图；可以观察到在液体培养基C27N7.5中，突变株的生长速率比野生株要快。2.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤2中④所述获得目的片段是指上游片段、潮霉素B抗性片段、下游片段的一个完整融合PCR产物。3.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤2中②所述新鲜液体C9N2培养基是由葡萄糖9g、酵母浸粉2g、海盐25g，加水至IL而成。4.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤2中②所述含有40mg/L潮霉素B的固体C9N2培养基是由葡萄糖9g、酵母浸粉2g、海盐25g、琼脂粉15g，加水至IL而成。5.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤5中所述C27N7.5液体培养基是由葡萄糖278、酵母浸粉7.58、海盐258，加水至11^而成。6.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述的菌种为隐甲藻属。
【专利摘要】本发明公开一种高生长速率的隐甲藻突变株的构建方法，具有高生长速率的微藻隐甲藻ATCC？30556基因删除突变株的方法。其特征是包含如下步骤：(1)隐甲藻光合作用相关基因核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶Rubisco基因的克隆；(2)用于同源双交换整合的基因片段的构建；(3)Rubisco基因的删除和突变株的构建；(4)隐甲藻Rubisco基因删除突变体生长特性的比较分析。利用本发明的方法定点敲除隐甲藻的Rubisco基因，能够获得异养培养条件下具有高生长速率的隐甲藻突变株，为二十二碳六烯酸(DHA)高效发酵菌种的优化筛选提供了一种新方法。
【IPC分类】C12N15/79
【公开号】CN105602982
【申请号】CN201610076812
【发明人】刘璐, 刁进进, 陈磊, 张卫文
【申请人】昆明藻能生物科技有限公司
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年2月3日