一种对黄酮类化合物耐受性提高的大肠杆菌工程菌及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种对黄酮类化合物耐受性提高的大肠杆菌工程菌及其构建方法，属于遗传工程领域。本发明对可用于黄酮生产的大肠杆菌生产菌株进行改造，沉默其lamB基因获得，提高了E.coli对黄酮类化合物的耐受性，外源添加黄酮类化合物刺激E.coli生长，相较于原始菌，工程菌的最大比生长速率相较于原始菌提高了2.14倍。
【专利说明】一种对黄酮类化合物耐受性提高的大肠杆菌工程菌及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种对黄酮类化合物耐受性提高的大肠杆菌工程菌及其构建方法，特别是一种并通过分子手段沉默了 malK基因，从而提高了 E.coli对黄酮类化合物的耐受能力。
【背景技术】
[0002]黄酮类化合物(Flavonoids)是自然界种类最多的多酚类植物次级代谢产物，广泛存在于植物界中，目前已经发现的种类已超过8000多种。黄酮类化合物具有广泛的药学价值，具有较强的抑菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、清除自由基、免疫调节、抗癌、抗病毒、降血糖、抗辐射和降血脂等多种生物学作用。随着对黄酮类化合物生物活性研究的逐步深入，对其的开发利用也越来越多，对其的需求量也越来越大，近年来，黄酮类化合物的市场每年增长30%以上，在药品和营养化学品领域上具有广阔的应用前景。但天然黄酮类物质的获得受到时间和区域的限制，而且在植物中含量低，不利于迅速研究和临床检验，并且化学结构很复杂，用化学合成法很复杂，不利于大规模的生产。因此用微生物生产黄酮类化合物越来越受到人们的重视。
[0003]随着黄酮类化合物的应用范围越来越广，其需求量也在不断的增大，从植物中提取有各种各样的问题，因此，通过微生物发酵生产黄酮类化合物具有很大的应用前景。目前，黄酮类化合物生物合成的代谢途径已经非常清楚，黄酮类化合物的基本骨架是由3个丙二酰辅酶A(malonylCoA)和I个香豆酰辅酶A (coumaroylCoA)在查尔酮合成酶(CHS)的催化下合成的，然后其他种类的黄酮是在母核的基础上通过羟基、甲氧基取代或烷基化等化学反应生成的。大肠杆菌遗传背景清晰，分子操作技术完善，是生物技术生产平台的首选，因此很早就有人通过改造E.coli相关代谢途径生产黄酮类化合物。目前很多研究成功通过基因工程等技术手段实现了多种黄酮类化合物在E.coli中的合成，如柚皮素、槲皮素、白藜芦醇等。但是黄酮类化合物本身对E.coli生长具有一定的抑制作用，主要是通过以下几种机制:①破坏细胞壁及细胞膜的完整性，改变细胞膜渗透性，进而破坏细胞膜的功能，影响细菌的生长；②抑制核酸的合成，槲皮素，芳:黄素，五羟基黄酮等能够抑制E.coli的DNA旋转酶的活性进而抑制DNA的合成。芦丁能够促进E.coli的DNA裂解，导致SOS反应发生，从而抑制菌体的生长抑制能量代谢，通过抑制ATP合酶的活力进而抑制胞内ATP的含量，影响菌体的生长。因此利用E.coli生产黄酮类化合物必须要考虑黄酮类化合物对E.coli的毒性作用。
[0004]目前在国内未有关于增加E.coli对黄酮类化合物耐受性的相关蛋白的报道。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是是找出能提高E.coli对黄酮类化合物耐受性的相关蛋白并提供一种对黄酮类化合物高耐受性的E.coli工程菌。通过将可用于黄酮生产的大肠杆菌生产菌株中malK基因进行沉默获得。
[0006]所述工程菌含有沉默malK基因的质粒。
[0007]所述malK基因核苷酸序列及其上游序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]所述malK基因克隆于E.coli BL21(DE3)菌株，并构建重组质粒pRSF-PTasRNA-malK 并转入 E.coli BL21 (DE3)中。
[0009]所述黄酮类化合物为芦丁，柚皮素或白藜芦醇。
[0010]本发明的提 出的基础及前期试验:
[0011]I)在E.COli稳定期时添加黄酮类化合物刺激后收集菌体细胞，提取膜蛋白，通过蛋白质组学的技术手段，发现MalK蛋白的表达量有显著的提高。
[0012]2)提高qPCR技术验证该蛋白在这一生理过程中的mRNA水平。
[0013]3)通过ncbi查出该基因的核苷酸序列设计引物并克隆。
[0014]4)将基因与载体连接得到重组表达载体；
[0015]5)将得到的重组表达载体转化E.coli BL21 (DE3)后得到重组菌株；
[0016]6)重组菌株进行IPTG诱导后通过qPCR验证其mRNA水平是否下降即基因是否被
沉默；
[0017]7)通过在黄酮类化合物存在的环境下生长曲线的测定，验证该蛋白的过量表达是否提高了 E.coli对黄酮类化合物的耐受能力。
[0018]下面是本发明技术方案的具体描述:
[0019]MalK蛋白的发现
[0020]挑取E.coli BL21 (DE3)单菌落用LB培养基活化后，按I %接种量接种于25mLLB培养基，培养到稳定期(IOh)添加lg/L黄酮类化合物(芦丁，柚皮素，白藜芦醇)刺激3h后收集菌体细胞。按照FOCUS? Global Fractionation说明书提取膜蛋白，并用2_DClean-Up试剂盒除去蛋白样品中的离子，最后用非干扰性蛋白质浓度测定试剂盒测定样品中的浓度，最后按照450 μ L含有800ng的浓度水化上样，使用24cm的pH4_7的胶条进行IEF，然后平衡两次后用13.5%的SDS-PAGE进行第二向，结束后用R250进行染色12h，脱色后用ImageScanner III仪器对胶进行拍照，获得清楚图像后用TOQuest进行图谱分析，挖出差异较大的点进行脱色，酶解等步骤，然后利用MALD1-T0F/MS质谱对肽段样品进行蛋白质鉴定，通过检索Matrix Science数据库,确定蛋白种类。
[0021]qPCR
[0022]收集菌体的方法同上，利用天根公司的RNAprep Pure Cell/Bacteria试剂盒提取菌株细胞的总RNA,利用TaKaRa公司的PrimcScript'K ! RT reagent试剂盒将RNA反转录成cDNA 构建 cDNA 文库，利用 TaKaRa 公司的 SYBR Premix ExTaq 试剂盒和 LightCycler480IIReal Time PCR仪器进行qPCR反应，具体程序如下:95°C预变性30s ；95°C 5s — 55°C 20s，40次循环(PCR反应)；95°C 10s — 65°C Imin — 95°C 10s (溶解曲线分析)。为保证试验的重现性，每个样品3个平行，然后取平均值作为计算的基础。
[0023]质粒及重组菌的构建
[0024]将从ncbi上查到的malK的基因序列设计引物进行扩增，分别连接到克隆载体PMD19-T测序，获得正确的转化子后进行双酶切连接到本实验室构建的pRSF-PTasRNA质粒上，构建得到重组质粒pRSF-PTasRNA-malK，将构建好的重组表达载体转化E.coli JM109，菌落PCR验证阳性转化子，提取构建好的重组质粒转入E.coli BL2KDE3)菌中获得沉默了malK基因的重组菌株。
[0025]生长曲线验证
[0026]用M9 培养基(13.3g/L M9CA Broth, 0.2 % 葡萄糖，ImM 硫酸镁，0.5 μ g/mLthiamine-HCl)活化工程菌(加入I %的氯霉素)和原始菌，按照I %的接种量接种入分别含有lg/L芦丁，柚皮素或者白藜芦醇，IPTG(0，100，200，400禮)19培养基中，301: 200r/min培养，每隔Ih测0D_，直至菌株生长到稳定期。获得菌株的生长曲线图，然后根据公式μ = dx/x*dt算出菌株的比生长速率图，然后得出最大比生长速率μ_。
[0027]本发明提供的工程菌耐黄酮类化合物能力提高，外源添加黄酮类化合物刺激Ε.coli生长，相较于原始菌，工程菌的最大比生长速率相较于原始菌提高了 2.14倍。
【具体实施方式】
[0028]实施例1MalK的发现
[0029]用接种针在Ε.coli BL21(DE3)平板上挑取单菌落接种于25mL LB培养基，活化12h。按照I %的接种量分别接种于4瓶25mL LB培养基，置于37°C摇床(200rpm)培养至稳定期后，其中三瓶分别添加25 μ L用DMSO溶解的浓度为0.lg/L的芦丁，柚皮素和白藜芦醇(终浓度为lg/L)，另外一瓶添加25 μ L DMSO作为对照，培养3h后8000rpm低温离心收集菌体，用去离子水洗3次后按照FOCUS? Global Fractionation说明书提取膜蛋白，并用2-D Clean-Up试剂盒 除去蛋白样品中的离子,最后用非干扰性蛋白质浓度测定试剂盒测定样品中的浓度，最后按照450 μ L含有800ng的浓度水化上样，使用24cm的pH4_7的胶条进行IEF，然后平衡两次后用13.5%的SDS-PAGE进行第二向，结束后用R250进行染色12h，脱色后用ImageScanner III仪器对胶进行拍照，获得清楚图像后用TOQuest进行图谱分析，其中一个胶点在有芦丁，柚皮素和白藜芦醇的样品中相较于对照组均有2倍以上的下调，将此点挖出进行脱色，脱水，酶解等步骤，然后利用MALD1-T0F/MS质谱对肽段样品进行蛋白质鉴定，通过检索MatrixScience数据库得出此点是E.coli属的MalK蛋白。
[0030]实施例2耐黄酮类化合物工程菌的构建
[0031]将从ncbi上查到的malK的基因前140bp和上游的40bp设计引物进行扩增，分别连接到克隆载体PMD19-T测序，获得正确的转化子后进行双酶切连接到质粒pRSF-PTasRNA上，构建得到重组质粒pRSF-PTasRNA-malK，将构建好的表达载体转化到E.coli JM109,涂布到含有氯霉素的LB培养基上(酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，固体培养基加20g/L琼脂，121°C灭菌15min)，挑取转化后平板上的转化子进行PCR验证，得到正确的单菌落进行发酵提取质粒，将质粒转入E.coli BL21(DE3)感受态，涂布到含有氯霉素的LB培养基上，挑取转化后平板上的转化子进行PCR验证，得到正确的单菌落即为重组菌株，也即获得高耐受黄酮类化合物的E.coli BL2KDE3)工程菌。
[0032]实施例3高耐受黄酮类化合物E.coli BL21 (DE3)工程菌生长曲线测定
[0033]挑取工程菌和含有空质粒pRSF-PTasRNA的E.coli BL21 (DE3)单菌落接种到含有I %卡那霉素的M9培养基(13.3g/L M9CA Broth, 0.2 %葡萄糖，ImM硫酸镁，0.5 μ g/mL thiamine-HCl)中活化IOh后，按I %接种量接入含有I %卡那霉素，lg/L黄酮类化合物(芦丁，柚皮素，白藜芦醇)，以及不同浓度的IPTG(0，100, 200, 400 μ Μ)的Μ9培养基中，30°C 200rpm培养，每隔Ih测一次OD6tltl直至菌株生长到稳定期。根据公式μ = dx/x*dt算出菌株的比生长速率图，然后得出最大比生长速率μ_，发现在有lg/L芦丁的环境中工程菌的^ max为0.42，而原始菌株的为0.23，生长速率提升了 1.83倍；在lg/L的柚皮素环境中工程菌的μ max为0.40，而原始菌株的为0.22，生长速率提升了 1.82倍；在lg/L的白藜芦醇环境中工程菌的umax为0.30，而原始菌株的为0.14，生长速率提升了 2.14倍。
[0034]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1.一种对黄酮类化合物耐受性提高的大肠杆菌工程菌，其特征在对可用于黄酮生产的大肠杆菌生产菌株进行改造，沉默其malK基因。
2.权利要求1所述的工程菌，其特征在于所述malK基因核苷酸序列及其上游序列如SEQ ID N0.1 所示。
3.权利要求1所述的工程菌，其特征在于所述黄酮类化合物为芦丁，柚皮素或白藜芦醇。
4.权利要求1所述的工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤: 1)根据所查E.coli BL2 1(DE3)中malK基因的前140bp和上游的30bp序列设计引物进行克隆； 2)将基因与载体连接得到重组表达载体； 3)将得到的重组表达载体转化E.coli后得到重组菌株。
5.权利要求1所述工程菌在黄酮类化合物生产中的应用。
【文档编号】C12P17/06GK103923860SQ201410169130
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月24日 优先权日:2014年4月24日
【发明者】陈坚, 周景文, 王奎, 李江华, 堵国成 申请人:江南大学