i L 的公用 PlBlock 与 Su L Index N Block(每个 i打dex Block加入量为8/样本个数N，总量为8 U L)。
[0174] 9. 3,将Cot-IDNA按照每管IOu g迸行分装。在Cot-IDNA管上标记相应的样品编 号，将9. Ipooling后的样品DNA和9. 2配制好的接头block加入Cot--IDM管中。
[017引现在杂交源合物中含有W下化种成分：
[0176]
的17刊 9。4.盖婷管盖，用干锋的50监1注射器针在分装的EP管盖上戳---个孔，将上述样品 文库巧block的混合物置于SpeedVac中蒸干，温度设置为60 U。 的 17引 9. 5.蒋 heat block 调到 95°C，将分装好的 4. 5 [1 LExome Library 从--20°C冰箱中 拿出，放在冰上化冻。
[017引 9. 6.蒋样品致出，分别加入W下两种试剂；7, 5U L 2X SC Hybridiation缓裤液和 3 U L SC Hybridiatio打 Component; A0 l0180] 9。I'?将样晶農敎M匀I日'量于轟必机上全遮离IOs。游离后样話移至95 C n技ax block 中 IOmin，使[)NA 变性。 防181] 9,8.蒋样品取出，震荡混匀后室温条件下全遽离& 10秒。
[0182] 9. 9.将上述杂交纔合物转入分装好的4. 5 U L Exome L化rary中化2团L PCR营或 96孔PCR板，震荡混匀后置于离屯机上全速离也10秒。
[0183] 现在杂交混合物中含畜W下JL种成分；
的 184]
[0185]
[0186] 9。10.放在PCR仪上巧U杂交6地-巧h，P邸仪热盖应设置保持在57 U。
[0187] 10.液相芯片的洗冻和洗脫 的18引提前蒋水浴锅打'开并将温度-媽至47C，羯来加热洗洛ing缓掉液。
[0189] 10。1.健备洗綠液
[0190] 10. L 1，提前解冻所需缓冲液试韻，按照比例将互种缓裤液试剂（iOX SC洗涂缓 冲液I、1備SC洗冻缓冲液Ilaox SC洗涂缓冲液阳、2X Stringent洗涂缓冲液和Binding 缓冲液）稀释配聽成IX溶液。其中缓冲液I分两管，----'管47°C预燕，--管室温。
[0191]
[0192] 10, L 2. 47T：预热W现两种溶液；
[0193] IX Stringent洗涂缓冲液和IX SC洗冻缓冲液。 的194] 10. 2.准备链霉素磯珠 的195] 10. 2. I.从4飞:|冰箱中拿出链霉素磁珠，混匀后平衡30间in特用。 防19引 10. 2. 2.在1. 5旧1的四> 管中加入IOOiil磁珠后，蒋EP管置于磯力架上至液体澄 清，去餘上清。
[0197] 10. 2. 3.加入200ul Streptavidin 曰y円ahead Bindin邑 a円d W过sh Buffer,Vortex IOs混匀，蒋EP管置于磯力架上至液体澄清，去餘上清。 的19引 10. 2. 4.重复8, 6. 2. 3,总共洗懲两次。
[019引 10。2. 5.吸 IOOul 的別Teptavidin 日ynabead Bi打ding and Wash. Buffer 到 200ul 的EP管中，悬浮磯珠。 的200] 10. 2. 6.用磯力架结合感珠（将小管靠到磁力架__!二），直到液体澄清，去餘上清；此 磁珠用来结合捕获的MA。
[0201] 10. 3.捕获到的DNA结洽到链霉素磁珠上
[0202] 10, 3. 1.将杂交纔合物转到8。6. 2. 6准备好的磯珠中，吹打混匀10次。
[0泌;3] 10. 3. 2.将小管放在PCR仪__!二47°C購育45min巧CR绞热盖应设置保持在571：，每 隔15min拿出来在vortex 3s y.防磁珠沉淀）
[0204] 10。4结合了捕获MA的链霉素磁珠釣洗涂
[02Q引 10. 4, 1,解育45因in后，将产物转至1. 5旧1的EP管中，再将EP管置于磯力架上舜 液体澄清，去除上清。 防20引 10.4.2.加入IOOuI 47°C的IX洗懲缓冲液Lvortex IOs源匀，再将EP管置于磯 力架上至液体澄清，去除上清。
[0207] 10. 4.义从磁力架上取下EP管，加入200ul 47'C的IX Stringent洗緣缓冲液，吹 打混匀！〇次，47CfP?育日min,再将邸管置于磁力架上至液体澄清，去除上清。再重复此步 骤--次，即共用 IX StriRgent Wash Buffer 洗两次。
[0208] 10. 4. 4.加入 200ul 常温的 IX 洗緣缓沖液 I (Wash Buffer I )，于 vortex 上混 匀2min，再蒋邸管置于磁力架上至液体澄清，去議上清。 的209] 10, 4. 5.加入200l!]_常温的IX洗涂缓冲液II，于vortex上混匀1间心再蒋EP管 置于磁力架上至液体澄清，去餘±清。
[0210] 10. 4。6。加入200ul常温的巧洗涂缓冲液化于乂〇的6又1:纔匀3〇3，再将助)管置 于磯力架上至液体澄清，去除上清。
[0211] 10. 4. 7.加入14(M Ul traPureWateH不用将DNA从磁珠上洗脱下來，可茲直接迸 行PC扔。
[0212] 1L 液相 captured 样品 LM-E3邸
[0213] 11. 1.从-20 'C 冰箱中取出 PIalinumR Pfx DNA 聚合酶、MgS04 巧OraMK dNTPmix(lOmM)、P邸 Primer FlowcellF(IOuM) .,PCR Primer Flc咽cell R(IOuM),蒋其置十 冰上化冻并充分混匀。
[0214]
[0215] 11. 2.按i：表配制PCR反应体系，置于PCR仪中按下列程序反应 的216] 94 V 2 min 94 TJ 15 s 锦 C 30 s I5cycles 巧 松 30 s ^ 72 。口 5 min
[0217] 4 V m
[021引 11，3. PCR产物纯化
[0219] 11. 3. L 将 Axgencourt AMPure beads 置于室温下平衡 30曲in。
[0220] 11. 3. 2.将P閒产物转入1. 5ml的EP管中，再将EP管置于磁力架上至澄清，再将 上清转至对应管号的EP管中，弃链霉素磁珠。上清中加入1。2倍的磁珠（120ul)，vortex 混匀。室温下静置IOmin，使磁珠与DNA充分结合。 的22-1] U. 3. 3.将EP管置于磁力架上至液体澄清，去除上清。
[0222] 11.3.4.加入SOOui 70%的乙醇（现配现用:)，颠倒-!-下，去餘芒醇。重复化步驟。
[0223] IL 3。5,将磁珠置于4(化干燥至磁珠平裂。
[0224] IL 3. 6.加入32ul邸，VOKex混匀谨温静置5旧in,使DNA从磁珠上完全洗脱下 来。 的22引 11. 3. 7.将EP管置于磁力架上至澄清，吸30ul的上清转入相应管号的EP管中。
[0226] 1L 3. 8.最后使羯化no化OP检测洗脱样品管、阳性对照管及阴性对照管PCR产物 浓度，洗脱样品的浓度大于阴性对照的才能送QC检测。蒋洗脱样品管补邸稀禪至20ng/ Ii L，稀释后吸取5 y. L送蹤检测富集度，Non--Captured Pre LM-PCR产物吸取2 y. L补水稀 释至20ng/U U送QC检测富集度。若2100检测有引物污染，文库取回用1. 2倍磁珠纯健。
[0227] 12.文库质控检测 的22引 使用AgUent 2…她ioanalyzer检测Captured LM-PCR产物产量，使用QPCR检测 No打-Captured巧及Captured LM-PCR产物的富集度，使用QP邸检测Captured LM-.PCR产物 浓度。
[02巧]13, HiSe站500上机测序 的巧0] 根据化seq2日00测序平台的操作规程，蒋经过文库质控检测合格的Captured LM--PCR产物迸行上机测序。
[0231] H、生物信息分析
[0232] 下机数据生物信息分析流程麵下：
[023幻 1、下机数据获得
[0234] 从测序仪获敦原始数据（FASTQ数据）。然后，初步评估数据质量，查看测序的质 量是否满足耍求。结果见图3-7。图3墨示了揺入片段的大小和分布情况，如图所示，插入 片段大小平均17抓P(栋耀差-37/+14);其中如果插入片段的大小比较离散，浓度比较低， 应从实验的角度分析问题，比如日NA是否降解，D齡打斷是否有问题，PCR扩增是否成功等 等。图4显示了测序数据的质量分布情况，國5显示了阜个碱基的平均测序错误率，計图4 和图5,测序为阳90,双向测序。从图4和图5可或查看样本测序的整体质量，異中，如图4 所示的由绿色到红色的渐变过程，颜色越深的区域，代表质量分布越集中。一般来说，一条 reads的测序演量一般是前半段的错误率比絞低，后半段相对较高，总的ErrorRate不島于 1%比较婷；如图5所示，样本单个碱基平均测序错误率为2. Ol和2. 23。图6显示了样本 reads的GC(AT)含量分布情况。理论上讲AGCT釣含量应各占巧％，由于PCR扩增的偏好 '註，可能会有些小的差异，如图6所示，本实施例测序获得的样本reads的GC(AT)含量分布 情况较理想。另辨由于样本的DM降解等多种问题，也两能使得GC含量比较弥散、GC含量 与AT含量相羞较大，如國7。即图7显示了较羞的rea.ds的GC(AT)含量分布情况。
[0235] 2、过滤
[0236] 对原始FASTQ数据（包括詞文件和adapter信息文件）进行质量控制，去除常 规所说的低质量值数据。其中，例如一条read的平均质量低于10,被污染的adapter的 reaxis，均耍被过滤。
[0237] 3、获得用于计算CNV和cal 1 SNP、I ND化的BAM文件
[023引该步驟的主耍旨的是获得样本的bam文粹。首先，通过BWA的aln、sampe获得初 始的bam文件。其次，利用picard和GATK处理前面的barn文件。 防巧引 （1)序列比捉设置的参数如下；ain-L--i-k 2--1 31--1 4-i 10 ;输入文件为过滤所 得的数据。
[0240] 城合并巧末端测序的数据：sampe (参数采用默认值，-a 500)，并利用Picard的 sort工具对其迸行排序。 的241](巧标记重复
[02巧重复是P邸扩增带来的，标记重复是为了避免call SNP和IND化带来的假甜性， 假阴性。 的243] (4)综合处理序列文件 防244] GATK2. 0 W上版本蒋不再支持无头文件的变异检测，需耍羯可使用Picard中 A加 OrReplaceReadGroups T具迸行加头化ead)处理。
[0245] 下面两步的旨的就是将比对到indel附近的reads迸行局語重新比对，将比对的 错误率降到最低。一般來说，绝大部分需要迸行重新比对的基因纽区域，燕是因为插入/缺 失的存在，因为在indei附近的比捉会出现大量的碱基错配，这些碱基的错配很容易被误 认为滞P。还有，在比对过程中，比超算法对于每一条read的处理都是独立的，不可能同时 把多条reads与参考基因组比对来排错。因此，即使有一些reads能够正确的化对到indel, 但那些恰恰比对到indel开始或者结柬位置的read也会有很高的比对