剂期间感染皿V，结果是无法从体内排出皿V而造成持续 感染的情况；W及健康者感染了近年称为基因型A的西方型、亚洲/非洲型等的外来种类的 皿V的情况等。像运样，一旦感染皿V，8~9成则成为无症状携带者，1~2成则转变成慢性肝 炎。其中的一部分进一步转变成肝硬化、肝癌。因此，将由皿V的慢性化转变成肝硬化、肝癌 的组称作本发明的"B型肝炎的病症发展"。所谓"肝硬化"，是指由于肝炎病毒感染所造成损 伤的肝脏在进行修复时所产生的纤维在肝脏中扩散的状态，其是导致下述症状的原因：由 于肝脏变硬而产生腹水、食道静脉瘤、或者由于肝脏机能下降而产生肝性脑病、黄痘。"肝 癌"是指由肝炎病毒感染引发的肝细胞癌。
[0042] 与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因可通过如下方式进行捜索:从慢 性B型肝炎患者、肝硬化或肝癌患者、或者健康人中采集生物样品，由所述生物样品制备基 因组DNA，并通过直接测序法等对基因序列进行分析。W运样的方式所得到的新的等位基因 是从慢性B型肝炎患者或肝硬化或肝癌患者中找到的。因此，所述新的等位基因与B型肝炎 慢性化和/或病症发展的相关性较高，有望作为本发明的等位基因的候选基因。为确认如上 述选出的等位基因和B型肝炎慢性化和/或病症发展的相关性，能够通过统计检验的方式进 行。例如，分别计算B型肝炎慢性化的组和健康人组中的该候选等位基因的出现率，对该候 选等位基因与B型肝炎慢性化之间的关联进行统计检验。对于检验，能够根据X2检验、费希 尔精确检验(Fischer'S exact test)等统计学的适当方法进行检验，根据需要，还可W进 行显著性水平的校正。
[0043] 对于检测上述等位基因的方法，没有特别的限定，对本领域技术人员而言，能够从 公知方法中选择。例如，能够根据目的等，从化qMan PCR法、基质辅助激光解吸电离飞行时 间质谱（MALDI-T0F/MS)法、等位基因特异性寡核巧酸分析法（ASO(allele-specific oligonucleotide))法、直接测序法、限制性片段长度多态性(RFLP)法、侵染（invader)法、 溫度梯度凝胶电泳（TGGE)法、变性梯度凝胶电泳（DGGE)法、Mu t Y酶法、微阵列忍片法 (microarray)、蛋白质截短测试法（Protein truncation test(PTT))法、Snipper法等公知 的分型方法中进行选择。虽然有很多应用PCR法的方法，但是也存在不依赖于PCR法的方法。
[0044] 本发明人等针对于日本人皿V患者组中的489个检测体和健康对照组中的467个检 测体、韩国人皿V患者组中的340个检测体和健康对照组中的140个检测体进行HLA-DPBl分 型，鉴定HLA-DPB1*05: Ol和HLA-DPB1*09: Ol为对B型肝炎慢性化具有敏感性的等位基因，鉴 定HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:0巧肌LA-DPB1*02: Ol为对B型肝炎慢性化具有抵抗性的 等位基因。另外，鉴定化A-DPB1*02:01为对B型慢性肝炎的病症发展具有抵抗性的等位基 因。HLA是人的主要组织相容性复合体(M肥;Major HistocompaUbility Complex)，其是与 移植片、细菌、病毒等外来抗原肤进行结合从而提呈给T细胞的膜蛋白质。已知HLA中存在有 许多等位基因，关于它们的信息，在HLA系统命名（HLA nomenclature) (http:// hla.alleles.org/announcement.html)等中有记载。此外，本说明书中的等位基因、多态性 的记号是基于HLA系统命名法的表记方法。
[0045] 例如，与上述等位基因相关的序列数据可W使用GenBank(NIH基因序列数据库， NIH genetic sequence database)、孤BJ(日本DNA数据库，DNA Data Bank of Japan)等的 登记在数据库中的数据。例如，HLA-DPB1*05:01的cDNA为917个碱基、在GenBank中登记为 AY804138(序列号1)、氨基酸为258个残基、且登记为AAW78743(序列号2)dHLA-DPB1*09:01 的cDNA为907个碱基、在GenBank中登记为AY804139(序列号3)、氨基酸为258个残基、且登记 为 AAW78744(序列号 4)eHLA-DPBl*04:02 的 cDNA 是 917 个碱基、在 GenBank 中登记为 AY804137 (序列号5)、氨基酸是258个残基、且登记为AAW78742(序列号6KHLA-DPB1*04:01的CDNA为 883个碱基、在GenBank中登记为AY804136(序列号7)、氨基酸为258个残基、且登记为 AAW7874U序列号8)。化4-0?81*02:01的。0麻为908个碱基、在66118曰扯中登记为4￥804134 (序列号9)、氨基酸为258个残基、且登记为AAW78739(序列号10)。将DPB1*01:01:01的氨基 酸序列示于序列号11(AAW78748)，图1表示其与本发明的上述等位基因的序列比对。
[0046] 此夕 h 上述等位基因 HLA-DPBl^SiOUHLA-DPBl^giOUHLA-DPBl^AiOS'HLA-DPBl^A: Ol 和HLA-DPB1*02: Ol有时称作 "本发 明的与B型肝炎慢性化和 / 或病症发展有关的 等位基因"、"本发明的与B型肝炎慢性化有关的等位基因""本发明的等位基因"、或者有时 称作多态性、SNP来替代等位基因。
[0047] 对于在本发明中使用的等位基因而言，除单链和双链的DNAW外，还包括与它们互 补的RNA链，其可W是天然所得的物质、也可W是人工制备的产物。例如，在DNA中，可W举出 基因组DNA、对应于所述基因组DNA的CDNA、化学合成的DNA、由PCR进行扩增的DNA、W及它们 的组合、DNA与RNA的杂交产物，但并不限于上述物质。此外，在本发明中，多核巧酸是指2个 W上的核巧酸进行结合而成的物质，通常含有被称作寡核巧酸的长度的物质。另外，本发明 中的多核巧酸既可W是DNA，还可W是RNA。
[0048] 运些碱基序列可通过本领域技术人员所公知的方法、使用合适的片段W制备探 针，并使用所述探针通过菌落杂交法、斑点杂交法、Southern印迹法等公知的杂交法从cDNA 库和基因组库等中获得。
[0049] 关于杂交法的详细步骤，可W参见"Molecular Cloning,A LaboratoiT Manual 3rd ed." (Cold Spring Harbor Press(2001);重点参见Section 6-7)、"Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley&Sons(1987-1997);重点参见Section 6.3-6.4)、"DNA Cloning I: Core Techniques,A Practical Approach 2nd ed."(Oxford University(1995);关于杂交法条件重点参见Sections. 10)等。
[0050] (2)使用本发明的等位基因来检测B型肝炎慢性化和/或病症发展的素因的方法
[0051] 本发明设及一种使用上述本发明的与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位 基因（在下述的记载中，有时也称作"多态性""SNP")来对B型肝炎慢性化和/或病症发展的 素因进行检测的方法(分型方法）。具体而言，包括下述工序：，a)比较工序:将与B型肝炎慢 性化和/或病症发展有关的等位基因和检测体中对应于所述等位基因的碱基序列或氨基酸 序列进行比较;b)分析工序:对检测体中对应于所述等位基因的位点的碱基或氨基酸残基 是否与等位基因的碱基或氨基酸残基一致进行分析；W及，C)确定工序:对检测体的B型肝 炎是否发生慢性化和/或病症是否发展进行确定。本发明的上述方法是基于下述发现：如 "(1)本发明的与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因"中所述，对B型肝炎慢性化 具有敏感性的等位基因是HLA-DPB1*05:01和HLA-DPB1*09:01，对B型肝炎慢性化具有抵抗 性的等位基因是化A-DPB 1*04:02、HLA-DPB 1*04: Ol和HLA-DPB 1*02: Ol，对B型慢性肝炎的病 症发展具有抵抗性的等位基因是HLA-DPB1*02:01。下面，针对上述方法进行详细说明。
[0052] 对于"a)比较工序:将与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因和检测体 中对应于所述等位基因的碱基序列或氨基酸序列进行比较"，换言之，即是检测序列号1~ 10所不的碱基序列和氨基酸序列的等位基因。
[0053] 在本发明中，对于等位基因的检测而言，能够在基因水平或蛋白质水平下进行。例 如，能够由检测体制备基因组DNA或mRNA，基于碱基序列，对基因组DNA或mRNA中的本发明的 与B型肝炎慢性化有关的等位基因进行检测。另外，能够由检测体制备人HLA-DP分子蛋白 质，通过使用例如抗体等，对DP 分子中的HLA-DPB1 *09:01、HLA-DPB1 *0 5:01、HLA-DPB1 *04: 02、HLA-DPB1*04: Ol和/或HLA-DPB1*02: Ol等位基因进行检测。下面，对运些方法进行简单 说明。
[0化4] (2-1)由检测体制备基因组DNA或mRNA
[0055] 对于在本发明的方法中所使用的样品而言，能够使用基于从检测体中采集的生物 样品并根据本领域技术人员所公知的方法制成的基因组DNA或mRNA,所述检测体是要对B型 肝炎慢性化和/或病症发展具有敏感性还是具有抵抗性进行检测的个体。对于在本发明的 方法中使用的从检测体中采集的生物样品而言，例如能够使用检测体的细胞或从组织、毛 发、粪便、尿液、唾液、细胞、鼻腔粘膜中通过摩擦而取得的细胞等，但并不限于此。
[0056] 基因组DNA能够通过任何公知的方法进行制备，例如，可举出酪/氯仿法、十六烷基 S甲基漠化锭(CTAB)法等。另外，对于mRNA,也能够通过任何公知的方法来进行制备，例如， 可举出异硫氯酸脈法等。在基因组DNA或mRNA的制备中，可W使用市售的试剂盒。作为该试 剂盒，例如，作为用于制备基因组D N A的试剂盒，可举出W i Z a r d基因组D N A纯化试剂盒 (Wizard Genomic DNA化rification Kit)(普洛麦格公司制造）等，作为用于制备mRNA的 试剂盒，可举出Nucleo化ap (注册商标)mRNA试剂盒(Clontech公司制造)等。此外，为了对下 述等位基因进行检测，可W由mRNA合成cDNA。对于CDNA的合成方法，可W使用本技术领域中 所公知的任何方法，例如，能够使用随机引物或多聚T引物，并通过RNA逆转录酶一聚合酶链 式反应(RT-PCR)来合成cDNA。
[0057 ] (2_2)等位基因的检测
[0化引对如上述制备的基因组0麻或1111?熱中的化4-0口81*09:01、化4-0口81*05:01、化八- DPB1*04:02、HLA-DPB1*04: Ol和/或HLA-DPB1*02: Ol等位基因的检测而言，能够使用本技术 领域所公知的任何基因多态性检测方法进行检测。例如，可W举出使用直接测序法、聚合酶 链式反应(PCR)法、限制性片段长度多态性(RFLP)法、杂交法、引物延伸反应法、质谱法等的 方法，但并不限于运些方法。但是，在HLA-DRBl基因中，特别是在第2外显子中存在大量多态 性位点，因此，为了检测运些等位基因，需要对大量多态性进行判别。下面，针对该方法进行 说明。
[0059] (2-2-1)直接测序法
[0060] 在本发明中，通过使用来自基因组DNA或mRNA的CDNA进行的直接测序法，能够检测 HLA-DPB1*09:Ol、HLA-DPB1*05:Ol、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:Ol和/或HLA-DPB1*02: Ol等位基因。直接测序法通过下述步骤进行：由上述制备的基因组DNA或mRNA来制备cDNA， 将含有作为检测对象的 HLA-DPB1*09: Ol、HLA-DPB1*05: Ol、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1