min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；
[0087] (c)加入700yL酸/氯仿（v/v 1:1)，充分混勾，12000rpm(~13400Xg)离心5min;
[0088] (d)小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中，加入700yL缓冲液GP2， 充分混匀；
[0089] (e)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm(~13,400Xg)离心30s，弃掉废液 (吸附柱容积为700yL左右，可分次加入离心）；
[0090] (f)向吸附柱CB3中加入500yL缓冲液⑶(使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12000rpm(~13400 X g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
[0091] (g)向吸附柱CB3中加入600yL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12000rpm(~13，400 X g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
[0092] (h)重复操作步骤（g)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(~13400Xg)离心 2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液； 该步目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中的乙醇的残留会影响后续的酶反应 (酶切、PCR等)实验；
[0093] (i)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50yL pH为7.0~8.5的洗脱缓冲液TE，室温放置2~5min，12000rpm(~13，400 X g)离心2min，将提 取的总DNA溶液收集到离心管中；且DNA产物保存在-20 °C，以防DNA降解，采用Th ermo Fi sher DNA测定仪测得三七、人参、西洋参的总DNA的浓度分别为23yg/yL、30yg/yL、29yg/y L〇
[0094] (2)采用罗氏LighlCycler?480II实时荧光定量PCR系统对步骤（1)提取得到的三 七、人参、西洋参的总DNA分别进行实时荧光定量扩增，其中，荧光PCR体系为25yL，其包括上 下游引物SEQ ID N0:1 及2(浓度2μΜ)各lyL，每种样品的总DNA lyL，lightcycler 480HRM master mix(2倍浓度）12 · 5yL，MgCl2(25mmoL)3 · OyL，其余用ddH20补至总反应体系25yL; SEQ ID NO:1及2的序列如下所示：
[0095] SEQ ID NO：1：CGGAGGGGCGGATAATGG；
[0096] SEQ ID NO：2：CGCACGACATGAGAAGAGG；
[0097] SEQ ID NO: 1及2的序列定制合成于上海捷瑞生物工程有限公司。
[0098] PCR扩增条件为:95°C预变性5min;95°C变性3〇8,56°(：退火3〇8,72°(：延伸458，扩增 40个循环;每个样品测试两次;扩增时，采集465~510nm的荧光信号，所得结果如图1所示， 从图1中可以看出本发明SEQ ID NO: 1及2能够有效的对三七、人参或西洋参的DNA进行扩 增，可有效的应用于检测样品中是否存在五加科植物成分。
[0099] 实施例2SEQ ID NO: 1和2和ITS 2通用引物的比较
[0100] 以跌打活血散中的多味植物源性药材为例，对比SEQ ID NO: 1和2与ITS 2通用引 物的PCR扩增结果。跌打活血散中的植物药材包括红花、当归、骨碎补、续断、大黄和三七药 材等，分别称取30mg各药材粉末，及人参粉末，按实施例1中的步骤（1)在相同的条件下，提 取各药材的总DNA;对每种药材的总DNA，分别以ITS 2通用引物及SEQ ID NO: 1及2,按实施 例1中的步骤(2)，在相同的条件下进行实时荧光PCR扩增，其中，每个样品测试两次，ITS 2 通用引物的序列为：
[0101] ITS2-3R：GACGCTTCTCCAGACTACAAT；
[0102] ITS2-2F：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；
[0103] 采用ITS 2通用引物扩增的PCR结果如图2A所示，采用SEQ ID N0:1及2扩增的PCR 结果如图2B所示，从图2A中可以看出采用ITS 2通用引物可以将跌打活血散中的多味植物 源性药材以及人参药材扩增出，缺乏特异性，因此，采用高分辨熔融曲线(HRM)难以实现对 跌打活血散制剂中是否含有三七成分的快速鉴别，因为其复方成分较多，采用ITS 2通用引 物无特异性扩增后，HRM曲线会受非三七成分的干扰，无特异性；从图2B中可以看出，采用 SEQ ID NO: 1和2引物对可特异性的对三七成分进行荧光PCR扩增，因此，采用HRM可特异性 地快速鉴别跌打活血散中是否含有三七药材。
[0104]分别称取30mg三七、人参粉末，按实施例1中的步骤（1 )，在相同的条件下提取三 七、人参的总DNA，分别以所述ITS 2通用引物及SEQ ID NO: 1及2引物，按实施例1中的步骤 (2)，在相同的条件下进行实时荧光PCR扩增，采用ITS 2通用引物扩增的PCR结果如图3A所 示，采用SEQ ID N0:1及2扩增的PCR结果如图3B所示，对比图3A及图3B可以看出，采用SEQ ID NO: 1和2引物的PCR反应，荧光PCR产物更快进入平台期，更符合PCR反应过程中，DNA片段 指数化变化的规则，证明该PCR反应效果更好。因此，与ITS2引物相比，本实施例SEQ ID N0: 1和2引物的荧光PCR效果更好。
[0105]分别称取30mg三七、人参粉末，按实施例1中的步骤（1)，在相同的条件下分别提取 三七、人参的总DNA;对每种药材的总DNA分别以上述ITS 2通用引物以SEQ ID NO: 1及2弓| 物，按实施例1中的步骤(2)，在相同的条件下进行实时荧光定量扩增，并测试所得扩增结果 的高分辨熔融曲线，测试条件为95 °C变性，40 °C复性30s，65 °C保持1 s，从65 °C以4.4°C/s的 速度缓慢升温95°C至DNA双链完全打开，在升温的过程中采集荧光，每个样品测试多次，所 得结果如图4A、图4B所示，其中，图4A为ITS 2通用引物扩增产物的三七、人参高分辨熔解曲 线图，图4B为SEQ ID NO: 1和2引物扩增产物的三七、人参高分辨熔解曲线图，从图4A中可以 看出采用ITS2通用引物进行扩增的三七和人参样品，其HRM图有明显的双峰存在，证明PCR 产物有两个熔点，也就是存在非特异扩增产物;从图4B可以看出，采用SEQ ID NO: 1和2引物 进行PCR反应，处于较低温度的PCR产物熔解峰消失，结果专一性更强。
[0106]实施例3利用SEQ ID NO: 1及2鉴别待检测三七样品中是否掺伪 [0107]分别称取30mg三七、人参、西洋参的极细粉末，按实施例1中的步骤（1 )，在相同的 条件下分别提取三七、人参、西洋参的总DNA;对每种药材的总DNA以SEQ ID NO: 1及2作为引 物，按实施例1中的步骤(2)，在相同的条件下进行实时荧光定量扩增，并测试所得扩增结果 的高分辨熔融曲线，测试条件为95 °C变性，40 °C复性30s，65 °C保持1 s，从65 °C以4.4°C/s的 速度缓慢升温95°C至DNA双链完全打开，升温的过程中采集荧光，每个样品测试两次，所得 结果如图5A及图5B所示，其中，图5A为三七、人参、西洋参归一化和变换熔解曲线，图5B为图 5A的归一化和熔解度差异曲线，从图5A及图5B可以看出，高分辨率熔融曲线可以有效区分 如上所述的仅有个别碱基差异的三七、人参、西洋参的PCR产物。
[0108] 近年来，由于三七价格远高于人参价格，不法分子将人参粉末掺入三七粉末的现 象多见。为验证本实施例是否能够鉴别出待检三七样品中掺有人参，本实施例分别称取 30mg三七、人参的极细粉末，按实施例1中的步骤（1 )，在相同的条件下分别提取三七、人参 的总DNA，并将提到到的三七的总DNA (三七基因组)及人参的总DNA (人参基因组)稀释为相 同浓度，均为约2yg/yL，并在98yL的浓度为2yg/yL的三七基因组中加入2yL的浓度为2yg/yL 的人参基因组，得含2%人参基因组的三七基因组(含98%的三七基因组），按同样的操作， 分别制得含1 〇 %人参基因组的三七基因组(含90 %的三七基因组)及含50 %人参基因组的 三七基因组(含50%的三七基因组）；然后使用本发明所述SEQ ID NO: 1和2引物分别对浓度 为2yg/yL的三七总DNA(100%)、掺有