2%、10%、50%人参总基因组（总浓度均为2以 8/^)的 三七基因组进行实时荧光定量PCR，DNA实时荧光定量PCR的条件相同，均是按照实施例1中 的步骤(2)操作;最后，分别测试所得扩增结果的高分辨熔融曲线，测试条件为95°C变性，40 。(:复性30s，65 °C保持1 s，从65 °C以4.4°C/s的速度缓慢升温95 °C至DNA双链完全打开，升温 过程中采集荧光，每个样品测试两次，所得结果如图6A、图6B所示，其中，图6A为三七总DNA 及三七基因组掺入不同比例人参基因组的归一化和变换熔解曲线，图6B为三七总DNA及三 七基因组掺入不同比例人参基因组的归一化和熔解度差异曲线，从图6A及图6B中可以看出 2 %的人参基因掺伪就可以有效地被检出。
[0109] 实施例4关于荧光PCR定量检测
[0110] 本实施例分别称取相同的三七对照药材30mg(l号）、20mg(2号）、10mg(3号）按实施 例1中的步骤⑴在相同的条件下提取总DNA;对所得的总DNA，以SEQ ID NO: 1及2，按实施例 1中的步骤(2)，在相同的条件下进行实时荧光定量扩增，其中，每个样品测试两次，所得结 果如图7所示，从图7中可以看出不同浓度的PCR产物的出峰时间(Ct值)相差约为0.5个循环 左右，与所称质量相符。
[0111] 另外，将1号样品基因组进行稀释，以得到1倍，1/10倍，1/100倍，1/1000倍浓度的 三七基因组，在上述相同的条件下进行荧光PCR检测，所得结果如图8所示，从图8中可以看 出，不同浓度的PCR产物的出峰时间(Ct值)相差约为3个循环左右，与所称质量相符。
[0112]实施例5PCR扩增体系lightcycler 480 HRM master mix(2倍浓度），MgCl2(25mM) 试剂用量的优化实验
[0113] 以实施例1中提取的三七的总DNA为模板，采用罗氏LightCycler? 480II实时荧光定 量PCR系统对其进行扩增，其中，改变MgCl2(25mM)试剂的用量，分别在25yL的PCR反应体系 中加入2.0、2.5、3.0、3.5、4. OyL的MgCl2试剂进行检测，该PCR反应体系中其他试剂及其用 量均同实施例1，按实施例1中的步骤(2)分别扩增，所得结果如图9所示，从图9中可以看出 MgCl2试剂浓度在3. OyL时PCR扩增效率更高。
[0114] 以实施例1中提取的三七的总DNA为模板，采用罗氏LighiCyc丨crS480II实时荧光定 量PCR系统对其进行扩增，其中，改变lightcycler 480 HRM master mix(2倍浓度）的用量， 设定按25yL加入12.5yL为1倍体积量，在梯度实验中选择1.2、1、0.8倍体积量进行实验，该 PCR反应体系中其他试剂及其用量均同实施例1，按实施例1中的步骤(2)分别扩增，所得结 果如图10所示，从图10中可以看出在lightcycler 480 HRM master mix(2倍浓度)为1倍体 积时PCR扩增效果最佳。
[0115] 最后说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点，而非限制本发 明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应 当理解:依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何 修改或局部替换，均应涵盖在本发明的保护范围当中。
【主权项】
1. 一种检测样品中是否存在五加科植物成分的方法，该方法包括： 从待检样品中提取总DNA; 以所提取的总DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增；所述引物对包括SEQ ID NO: 1和 SEQ ID N0:2； SEQ ID N0：1：CGGAGGGGCGGATAATGG； SEQ IDN0：2：CGCACGACATGAGAAGAGG； 对上述PCR扩增产物进行分析判断以鉴别所述检测样品中是否存在五加科植物成分； 优选地，所述对上述PCR扩增产物进行分析判断包括用凝胶电泳显示所述扩增产物，并 包括对照从相应的五加科植物对照品中提取的DNA进行PCR扩增的结果； 优选地，所述五加科植物选自三七、人参和/或西洋参。2. -种鉴定待检三七样品中是否掺伪的方法，所述方法包括如下步骤： 从待检三七样品中提取总DNA; 以所提取的总DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增；所述引物对包括SEQ ID NO: 1和 SEQ ID N0:2； SEQ ID N0：1：CGGAGGGGCGGATAATGG； SEQ IDN0：2：CGCACGACATGAGAAGAGG； 测试上述扩增结果的高分辨熔解曲线并进行分析判断待检三七样品是否掺伪； 优选地，用于掺伪的伪品为人参和/或西洋参，更优选地，所述伪品为人参。3. 根据权利要求2所述的方法，其中，所述测试上述扩增结果的高分辨熔解曲线包括从 40°C以上，以2~4.5°C/s的速度，升温至95°C，测试所述扩增结果的熔解曲线的过程;优选 地，将上述扩增结果95°C变性lmin，40°C复性30s，65°C保持ls，从65°C以4.4°C/s升温至95 °C，在升温过程中采集信号。4. 根据权利要求2所述的方法，其中，所述从待检三七样品中提取总DNA的过程包括如 下步骤： 在待检三七样品中加入液氮进行研磨； 加入用于提取植物DNA的含离子型表面活性剂的缓冲液，在60°C~70°C消化5min~4小 时； 用氯仿法或酚仿法抽提； 加入醇溶剂沉淀富集DNA; 利用PCR纯化试剂盒进行纯化，得到所提取的总DNA。5. 根据权利要求2所述的方法，其中，所述PCR扩增为荧光定量PCR扩增； PCR扩增条件为:95°C预变性5min;95°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸45s，扩增30个 循环以上。6. 根据权利要求2所述的方法，其中，所述待检三七样品为中药细粉、中药最细粉或中 药极细粉； 所述中药细粉指能全部通过五号筛，并含能通过六号筛不少于95 %的粉末； 所述中药最细粉指能全部通过六号筛，并含能通过七号筛不少于95 %的粉末； 所述中药极细粉指能全部通过八号筛，并含能通过九号筛不少于95%的粉末。7. 根据权利要求2~6中任一项所述的方法，该方法还包括： 将待检三七样品的高分辨熔解曲线与从三七对照品中提取DNA进行PCR扩增后测试得 到的高分辨熔解曲线对照，分析判断待检三七样品是否掺伪； 当待检三七样品PCR产物的高分辨熔解曲线与三七对照药材PCR产物的高分辨熔解曲 线具有基本相同的熔解特征时，表明待检三七样品未掺伪； 当待检三七样品PCR产物的高分辨熔解曲线与三七对照药材PCR产物的高分辨熔解曲 线具有不同的熔解特征时，表明待检三七样品掺伪，当待检三七样品没有PCR产物检出时， 表明样品中不含有三七药材。8. 用于实现权利要求1所述检测样品中是否存在五加科植物成分的方法的引物对，或 权利要求2~7中任一项所述鉴定待检三七样品中是否掺伪的方法的引物对，所述引物对包 括SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2; SEQ ID N0：1：CGGAGGGGCGGATAATGG； SEQ ID N0:2:CGCACGACATGAGAAGAGG。9. 权利要求8所述的引物对在检测样品中是否存在五加科植物成分或鉴定待检三七样 品是否掺伪中的应用。10. -种鉴定待检三七样品是否掺伪的试剂盒，该试剂盒包含权利要求8所述的引物 对;优选地，该试剂盒还包括荧光染料和Mg2+试剂;更优选该试剂盒还包括dNTPs、DNA聚合酶 和PCR缓冲液。
【专利摘要】本发明提供检测样品中是否存在五加科植物成分及是否掺伪的方法，检测样品中是否存在五加科植物成分的方法包括：从待检样品中提取总DNA；以所提取的总DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增；所述引物对包括SEQ？ID？NO:1和SEQ？ID？NO:2；对上述PCR扩增产物进行分析判断以鉴别所述检测样品中是否存在五加科植物成分。本发明SEQ？ID？NO:1和2为根据真核生物r？DNA上的ITS2顺反子序列设计，相较于ITS2的通用序列，其能特异性地使五加科植物的ITS？2片段序列进行扩增，而不能扩增其它科属的植物药材，可以检测样品中是否存在五加科植物成分，尤其是人参、三七和/或西洋参成分。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105624291
【申请号】CN201610034379
【发明人】王菲菲, 张聿梅, 戴忠, 马双成
【申请人】中国食品药品检定研究院
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年1月19日