650mL转移到新的2ml管中，加氯仿：异戊醇650mL，颠倒混勾，13000r/min离心5min， 取上清液500mL置于新的2ml管中。
[0053]③加乙醇(预先放置于_20°C冰箱中，用完及时放入冰箱中）至2ml处，上下颠倒几 次(会有絮状物出现），置于-20 °C冰箱中静置5min(放置时间可以略长），倒掉管中的乙醇， 再加入乙醇至2ml处，轻轻上下混匀几次后倒掉乙醇(注意不要将DNA倒掉），然后8000r/min 离心30s，倒掉剩余的乙醇。
[0054] ④加500mL ddH20，置于37 °C水浴溶解DNA约4min，放冰上预冷5min，加冷乙醇至 2mL，轻轻上下颠倒混匀。13000r/min离心3min，空柱8000r/min离心2min，如果看到沉淀物 不是透明色重复步骤④。
[0055]⑤将空管放在真空栗抽提15min，根据固体剩余量加200ml ddH20，测定核酸含量， 并用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测提取的总DNA(图1)。
[0056]实施例2 SSR标记的选择和引物的初筛
[0057]在获得的10万个含有SSR位点的序列中，二碱基和三碱基是茶树基因组中比较丰 富的微卫星类型，其中涉及茶树基因组中三个特异的微卫星SSR标记，分别为:① SSR-54: 57-AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG-37 ； (2)SSR-256：57-AAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAG- 3、③SSRISSj'-ATGATGATGATGATGATGATGATGATG-S'JSEQ ID No:卜3)。
[0058] 上述标记SSR-54、SSR-256和SSR-285的左、右侧翼保守序列分别如SEQ ID No:6和 7、SEQIDNo:l(^Pll&&SEQIDNo:l^P15m*。
[0059] 从中选取2923条含有SSR位点的序列，成功设计了415对引物。
[0060] SSR引物筛选的原则如下：
[00611①引物的长度为18-23bp，目的片段在250bp左右。
[0062] ②GC含量为45%-55%，引物序列中避免出现3或4个连续碱基。
[0063]③退火温度在45°C_55°C，最好在50°C左右，上、下游引物Tm值相差不大于4°C。
[0064]④引物3'端避免出现A或出现3个以上连续碱基，尽量避免引物二聚体和发夹结 构。
[0065] PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳初筛：
[0066] PCR扩增体系：50ng/yL基因组DNA 2yL，ΙΟμΜ上、下游引物各0.5yL，10 X EasyTaq酶 缓冲液2yL，EasyTaq DNA聚合酶lU，2.5mM dNTP 2yL，ddH20加至总量20yL。
[0067] PCR 程序：94°C 预变性 5min;94°C 变性 3〇8,55。〇±3。(：退火3〇8,72。(：延伸3〇8，共30 个循环;72°C延伸10min，4°C保存。
[0068] 其中退火温度根据每个引物决定。将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，选取扩增 率大于等于75%、条带清晰且单一的PCR产物进行测序，通过与目的片段比对进行引物的初 筛。
[0069] 实施例3 Fragment Analyzer ?全自动毛细管电泳系统复筛引物 [0070] 具体操作如下：
[0071] 1、试剂的准备：
[0072] 1)配胶：向200mL dsDNA 800Separation Gel中加入 10yL Inter calating Dye， 充分混匀。
[0073] 2)1 X Inter Buffer:将5 X Inter Buffer稀释5倍。
[0074] 3)1X Capi1lary conditioning solution:将5XCapi1lary conditioning solution稀释5倍，向96孔板中分别加入lmL Capillary conditioning solution，避免出 现气泡。
[0075] 4)Marker:向96孔板中分别加入33yL 35bp and 500bp Markers，每个孔里加入一 滴Mineral oil封住，离心。
[0076] 5)样品制备：向96孔板的各孔中加入20yL Dolution buffer和3yL PCR产物，最后 一个孔加入23yL 35_400bp Range DNA Ladder，离心避免出现气泡。
[0077] 2、操作步骤:将所配制好的试剂放入仪器指定位置，点击仪器的运行程序。
[0078] 3、数据记录和结果分析:每条带中选取峰值最高的条带，记录具体数值大小。对引 物复筛的要求包括以下几点：（1)主带清晰，没有多余杂带；（2)多态性值高，等位位点多； (3)在两个相近的等位位点之间条带相差大小应大于4bp; (4)对符合上述三点的引物进行 三次重复性扩增，选择重复性、稳定性好的引物，最终筛选出三对用于鉴定舒茶早品种的核 心SSR引物，分别为SSR-54(SEQ ID No:4和5)、SSR-256(SEQ ID No:8和9)和SSR-285(SEQ ID No:12和13)。
[0079] 三对引物组合能够有效的将32个茶树品种区分开来，引物256和引物285各能区分 11个茶树品种，引物54能区分10个品种，其中引物54对舒茶早品种扩增出两个特异性等位 位点，分别是193bp和221bp，能够准确、快速的鉴定出舒茶早品种，结果见表2和图2,三对核 心引物的毛细管电泳指纹图谱见图3-图5,由于Fragment Analyzer ?全自动毛细管电泳系 统最低分辨为2bp，因此该核心引物对舒茶早品种扩增出的两条带所允许范围分别是193± 3bp、221 ±3bp。
[0080] 丟?！ 3对核心印物亦;《个茶Μ品釉由扩增m的甚田型
[0081]
[0082]
[0083] 三对核心SSR引物的PCR产物测序结果与目的片段比对图见图6。
[0084] 实施例4舒茶早茶树品种真实性的鉴定
[0085] 供试材料:待测茶品种干茶样A，确定为舒茶早品种的干茶样B。
[0086]试验方法:①分别对干茶样A、B提取DNA，②利用实施例3的三对核心引物对上述两 份DNA样品进行PCR扩增，③用Fragment Analyzer TM全自动毛细管电泳系统对PCR产物分 析。
[0087] 结果与讨论:通过与舒茶早品种的毛细管电泳指纹图谱比对，如果茶样A扩增出与 茶样B相同的多态性条带（即大小分别为193bp和221bp)，或者扩增条带与茶样B在一定误差 范围内一致(分别为193±3bp、221±3bp)，则可以确定茶样A为舒茶早品种，不符合上述原 则的不是舒茶早品种。
[0088] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 茶树基因组中特异的SSR标记，其特征在于，包括3条不同的SSR标记，其核苷酸序列 分另IJ 为：① SSR-54 : 57 -AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG-37 ;②SSR-256 : 57 -AAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAG-3';③SSR-285:5'-ATGATGATGATGATGATGATGATGATG-3,。2. 根据权利要求1所述SSR标记的侧翼序列设计的引物，其特征在于， SSR-54引物序列为： 上游引物:5' -AGACACGAAATAGGTAGG-3, 下游引物:5' -AGACACGAAATAGGTAGG-3, 其中，所述SSR-54标记的左、右侧翼序列分别如SEQ ID No:6和7所示； SSR-256引物序列为： 上游引物:5' -ACTGGTAGGCGACAAACT-3' 下游引物:5' -GCGACCCAAATCACTTAG-3' 其中，所述SSR-256标记的左、右侧翼序列分别如SEQIDNo:10和ll所示； SSR-285引物序列为： 上游引物:5' -GCCATAAAGAGCAACAAG-3' 下游引物:5' -CCTCACCATAACAACACC-3' 其中，所述SSR-285标记的左、右侧翼序列分别如SEQIDNo:14和15所示。3. 利用SSR指纹图谱鉴别舒茶早茶树品种的方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 提取待测植株的基因组DNA; 2) 以待测植株的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物，进行PCR扩增反应； 3) 检测PCR扩增产物，如果用引物SSR-54能够扩增出193bp和221bp大小的特征条带，则 待测植株为舒茶早茶树品种。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中PCR扩增体系：50ngAiL基因组DNA 2yL，1 ΟμΜ上、下游引物各0 · 5yL，10 X EasyTaq酶缓冲液2yL，EasyTaq DNA聚合酶 1U，2 · 5mM dNTP 2yL，ddH20加至总量20yL。5. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤2)中PCR程序:94 °C预变性5min; 94 。(:变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共30个循环；72°C延伸10min，4°C保存。6. 根据权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中采用聚丙烯酰胺凝胶电 泳检测PCR扩增产物，然后银染显色;或者通过毛细管电泳检测PCR扩增产物。7. 根据权利要求3-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)用改良的CTAB法从干茶或 茶树叶片中提取基因组DNA。8. 用于筛选或鉴别舒茶早茶树品种的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包 含权利要求2所述引物。
【专利摘要】本发明提供一种利用SSR指纹图谱鉴别舒茶早茶树品种的方法，涉及到茶树全基因组中3条特异的SSR标记(SEQ？ID？No:1-3)及其引物。利用32份来自12个省份的优良茶树品种作为样本材料，在茶树全基因组中选取415对SSR引物进行多态性筛选，最终确定3对引物作为舒茶早品种鉴定的核心SSR引物，可有效将舒茶早和其它茶树品种区分开，不仅有利于舒茶早品种的保护，还对市售舒茶早茶的真伪鉴别提供了一个快速、准确的方法。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105624320
【申请号】CN201610189371
【发明人】韦朝领, 刘洪伟, 侯艳, 饶佳, 冯爽爽
【申请人】安徽农业大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年3月28日