一种依据BnaLCR78基因测定甘蓝型油菜含有高油酸的方法
【专利说明】-种依据BnaLCR78基因测定甘蓝型油菜含有高油酸的方法
[0001]
技术领域:本发明设及油料作物领域，具体设及一种检验和判断甘蓝型油菜是否 属于高油酸油菜的测定方法。
【背景技术】
[0002] 甘蓝型油菜是Ξ大油菜资源中的重要类型，也是在我国广泛种植的一类典型的油 料作物，其脂肪酸组成分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸对人体的健康，植物 的抗逆W及损伤后的修复都具有重要作用。根据彭埼2011年博±学位论文(彭埼，与甘蓝型 油菜脂肪酸组分形成相关新基因的克隆，2011，博±学位论文，湖南农业大学，中国知网数 据库/CNKI;W下称彭埼论文）中的叙述，T350078基因是甘蓝型油菜"湘油15"开花后35天左 右种子特异表达文库中的78号EST克隆片段，其基因的DNA全长369bp，cDNA全长237bp，基因 功能未知；同时，该论文公开了该基因的核巧酸序列(彭埼论文的第54页第1段与第2段）。通 过NCBI数据库的比对，发现该基因与拟南芥中的一个低分子量，并且富含半脫氨酸的家族 基因 LCR23同源性较高，因此T350078基因又被命名为化aLCR78。通过构建相应的表达载体 将T350078基因转化拟南芥，发现该基因可能参与油酸的合成代谢。
[0003] 现有技术通过设计引物，WPCR扩增得到BMLCR78基因的编码序列，然后利用 DNAMAN6.0软件，分析化aLCR78基因的序列特点，找出W不同模板扩增出来的序列差异;通 过序列差异，初步明确油菜的油酸含量，用于将来进一步提高油菜油酸的相关研究。为了找 到不同材料在基因序列上的差异，需要分别W不同的模板进行基因扩增和测序工作，工作 较繁琐。
[0004] 另一方面，目前对油菜脂肪酸组成还可通过相关仪器测定得到相关结果，主要有 W下几种方式：（一）近红外光谱法:近红外光谱仪(Near Infrared Spectrum Instrument, NIRS)是介于可见光(Vis)和中红外(MIR)之间的电磁福射波，美国材料检测协会(ASTM)将 近红外光谱区定义为780-2526nm的区域，是人们在吸收光谱中发现的第一个非可见光区。 近红外光谱区与有机分子中含氨基团（〇-H、N-H、C-H)振动的合频和各级倍频的吸收区一 致，通过扫描样品的近红外光谱，可W得到样品中有机分子含氨基团的特征信息，其缺点 为：1.需要大量有代表性且化学值已知的样品建立模型。运样，对小批量样品的分析用近红 外就显得不实际了。2.模型需要不断更新，由于仪器状态改变或标准样品发生变化，模型也 要随之变化了。3.模型不通用，每台仪器的模型都不相同，增加使用的局限性。4.建模本钱 高，测试用度大。因此，单独使用该方法得出的结论不可靠。（二)气相色谱法:用气体作为移 动相的色谱法。缺点：在对组分直接进行定性分析时，必须用已知物或已知数据与相应的色 谱峰进行对比，或与其他方法(如质谱、光谱)联用，才能获得直接肯定的结果。在定量分析 时，常需要用已知物纯样品对检测后输出的信号进行校正，因此分析结果的可靠性很大程 度上取决于已知物的选择，单独使用该方法得出的结果可靠性不好；（Ξ)液相色谱法:用液 体作为流动相的色谱法。缺点:液相色谱不能由色谱图直接给出未知物的定性结果，而必须 由已知标准作对照定性。当无纯物质对照时，定性鉴定就很困难，运时需借助质谱、红外和 化学法等配合，因此已知标准的选择是结果是否可靠的关键，单独使用该方法得出的结果 可靠性不好，另外大多数金属盐类和热稳定性差的物质还不能分析。虽然该缺点可高效液 相色谱法来克服，但是高效液相色谱法分析成本高，仪器昂贵并且维护费用高，分析时间较 长。
[0005] 现有的研究重点往往是通过常规育种和分子育种等手段培育品种，测定油菜中的 油酸含量，作为特定材料是否是高油酸材料的直接依据，而对相应调控基因的序列特点很 少研究，研究基因的序列特点，有针对性的筛选材料进行相关的下游工作，可对选择、培育 更优质的高油酸材料奠定重要的基础。
【发明内容】
[0006] 本发明提供可一种含有高油酸的甘蓝型油菜的测定方法，含有W下步骤：
[0007] (1)测定甘蓝型油菜的化化CR78基因的转录存在可变剪切，则所述甘蓝型油菜的 油酸含量高；或测定甘蓝型油菜的化化CR78基因的转录不存在可变剪切，则所述甘蓝型油 菜不属于高油酸油菜。
[0008] 由于基因序列一般同时具有外显子和内含子，在形成有活性的mRNA编码序列之 前，需要进行加工，剪切内含子，将外显子W特定的方式连接起来。WcDNA为模板扩增得到 的基因大多是只保留外显子的编码区的序列。本发明发现高油酸含量的油菜的化aLCR78基 因具有可变剪切的形式，而非高油酸含量油菜的BnaLCR78基因不具有可变剪切的形式。本 发明提供了一种测定方法，用来预判油菜作物油酸含量的高低，检验和预判是否属于高油 酸的油菜。
[0009] 进一步的，本发明提供了具体的测定方法，包含W下步骤：
[0010] (1)提取甘蓝型油菜的化aLCR78基因的mRNA,反转录得到所述mRNA的cDNA，反转录 引物的核巧酸序列如序列表SEQ ID NO. 1的核巧酸序列所示；
[0011] (2)对步骤（1)获得的cDNA进行PCR扩增，PCR扩增的引物核巧酸序列如序列表SEQ ID NO.2和沈Q ID NO.3的核巧酸序列所示；
[0012] (3)对步骤(2)制备得到的cDNA扩增产物测序，得到所述cDNA核巧酸序列；
[0013] (4)将步骤(3)测序得到的cDNA核巧酸序列与化aLCR78基因的核巧酸序列比较，步 骤(3)所述的测序结果既包括含有化aLCR78基因内含子的cDNA核巧酸序列，步骤(3)所述的 测序结果也包括不含化aLCR78基因内含子的cDNA核巧酸序列，则该甘蓝型油菜为高油酸含 量的甘蓝型油菜;所述化aLCR78基因的核巧酸序列如SEQ ID NO.4的核巧酸序列所示;或将 步骤(3)测得的cDNA的核巧酸序列与化aLCR78基因的核巧酸序列比较，步骤(3)所述的测序 结果均为不含化aLCR78基因内含子的cDNA核巧酸序列，则该甘蓝型油菜为低油酸含量的甘 蓝型油菜;所述化aLCR78基因的核巧酸序列如SEQ ID NO.4的核巧酸序列所示。
[0014] 同时，步骤（4)所述的BMLCR78基因的核巧酸序列，可替换为待测甘蓝型油菜的 化aLCR78基因的核巧酸序列。
[0015] 本发明所述的高油酸为油菜的油酸含量大于或等于60%，所述低油酸为油菜的油 酸含量小于60 %。
[0016] 进一步的，本发明测定方法由W下步骤组成：
[0017] 反转录的方法：
[0018] (1)于无菌的离屯、管中加入下表中的试剂(操作于冰上进行）；
[0019] 表1-lRNA反转录操作步骤一
[0020]
[0021] (2)混合均匀，65 °C 5min，迅速至于冰上至少Imin;
[0022] (3)再向离屯、管中加入W下试剂(操作于冰上进行）；
[0023] 表1-2RNA反转录操作步骤二
[0024]
[0026] 4)混匀后置于 50°C，60min;
[0027] 5)70°C，15min 终止反应
[0028] 6)反转录产物可W置于一 20°C下保存 [00 巧]7)PCR 扩增:使用 Bio-Rad 的 PCR 仪 T100;
[0030] 反应程序为：4min at 94Γ，40s at 94Γ，40s at 58Γ，30s at 72°Cfor 35cycles；and 7min at 72°C
[0031] 反应体系为：cDNA模板化L,上下游引物各0.化L，10mM dNTPS 0.祉L，ES Taq DNA Polymerase(抓/yL)0.祉L，10X化lymerase Buffer ：3yL，无菌水体积补足至30化
[0032] 8)对步骤7)扩增得到的cDNA产物进行测序，得到测序结果cDNA的核巧酸序列；
[0033] 9)序列比较，得到序列比较的结果。可将步骤8)得到的测序结果cDNA核巧酸序列 与化aLCR78基因的核巧酸序列比较，步骤8)所述的测序结果既包括含有化aLCR78基因内含 子的cDNA核巧酸序列，步骤8)所述的测序结果也包括不含化aLCR78基因内含子的cDNA核巧 酸序列，则该甘蓝型油菜为高油酸含量的甘蓝型油菜;所述化aLCR78基因的核巧酸序列如 SEQ ID NO.4的核巧酸序列所示；
[0034] 或将步骤8)测得的测序结果cDNA的核巧酸序列与化化CR78基因的核巧酸序列比 较，步骤8)所述的测序结果均为不含化aLCR78基因内含