增得到的基因序列；
[0066] G-化aLCR78-2: W高油酸油菜化aLCR78基因的mRNA反转录得到的cDNA为模板扩增 得到基因序列。
[0067] 图2a彭埼论文公开的化aLCR78基因的cDNA序列与高油酸材料的化aLCR78基因的 不含内含子的cDNA序列、高油酸材料的对照材料W及低油酸材料的
[006引化aLCR78基因的cDNA序列的比对结果图。
[0069] 图化彭埼论文公开的化aLCR78基因的cDNA序列与高油酸材料的化aLCR78基因的 不含内含子的cDNA序列、高油酸材料的对照材料W及低油酸材料的
[0070] 化aLCR78基因的cDNA序列分别对应翻译出的蛋白序列的比对结果图。
[0071] 化aLCR78:彭巧论文公布的基因的cDNA序列；
[0072] G-BnaLCR78:高油酸材料中的&iaLCR78基因的cDNA序列；
[0073] CK-BnaLCR78:高油酸材料的对照材料中&iaLCR78基因的cDNA序列；
[0074] D-BnaLCR78:低油酸材料中&iaLCR78基因的cDNA序列。
[0075] 图3高油酸材料的化化CR78基因的核巧酸序列翻译得到的断裂蛋白的示意图，见 实施例一。
[0076] 图4彭埼2011年论文化化CR78基因核巧酸序列翻译得到的断裂蛋白的示意图，见 实施例一。
[0077] W下为【具体实施方式】 实施例
[007引实施例一
[0079] (1)取高油酸材料甘蓝型油菜的保持系100B的种子，经过航天诱变+叠代化钢复合 处理，并经过多代栽培稳定遗传的后代，油酸含量62.60%，WG表示。也可W使用自然形成 的高油酸材料(油酸含量>60%)的种子替代经过航天诱变+叠代化钢复合处理的甘蓝型油 菜的保持系100B的种子，W进行本实验。
[0080] 取高油酸材料的对照材料，即未经过任何处理的甘蓝型油菜的保持系100B，在田 间自然状态下生长，成熟后收获的种子，油酸含量56.57%;用CK表示。
[0081 ]取低油酸材料中油821的种子，油酸含量<40%，为25.17%，多是高芥酸的材料，用 D表示。
[0082] (2)根据彭埼2011年论文关于化aLCR78基因的叙述(BnaLCR78基因核巧酸序列如 序列表SEQIDN0.4所示），通过软件DNAMAN6.0设计引物，引物序列如序列表SEQIDN0.2 和SEQ ID NO.3的核巧酸序列所示。
[0083] (3)分别W基因组DNA和反转录得到的cDNA为模板，反转录引物的核巧酸序列如序 列表SEQ ID NO. 1所示。通过PCR扩增得到该基因完整的基因序列和编码序列。PCR反应程序 为:94度4分钟，94度40秒，58度40秒，72度30秒，35个循环，72度保溫7分钟；
[0084] 反转录的具体方法：
[0085] (1)于无菌的离屯、管中加入下表中的试剂(操作于冰上进行）；
[00化]表1-1RNA反转录操作步骤一
[0087]
[0089] (2)混合均匀,65°C5min,迅速至于冰上至少Imin;
[0090] (3)再向离屯、管中加入W下试剂(操作于冰上进行）；
[0091] 表1-2RNA反转录操作步骤二
[0092]
[0093] 4)混匀后置于 50°C，60min;
[0094] 5)70°C，15min 终止反应
[00M] 6)反转录产物可W置于一 20°C下保存
[0096] 7)PCR扩增的方法：
[0097] PCR扩增使用 B i 0-Rad 的 PCR仪T100
[009引 反应程序为：4min at 94°C，40s at 94°C，40s at 58°C，30s at 72°Cfor 35cycles;and7min at 72°C
[0099] 反应体系为：cDNA模板化L,上下游引物各0.化L，10mM dNTPS 0.如L，ES TaqDNA Polymerase(抓/yL)0.祉L，10 X化lymerase Buffer 无菌水体积补足至30化
[0100] 8)对步骤7)扩增得到的cDNA产物进行测序，得到测序结果cDNA的核巧酸序列；
[0101] 核巧酸序列比较/比对，可采用本领域常用的序列比对软件进行序列比较，如可利 用DNAMAN 6. ο软件，版本6. ο. 3.99，选择菜单序列(S)，在比对(A)下面选择多序列比对(Μ)， 在弹出的窗口 "序列与文件"中点击"文件"按钮，选择合适的序列文件，依据序列是核巧酸 序列还是蛋白序列，选择DNA或者是蛋白质，选择下一步，在"方式"窗口中，如果是比较DNA 序列，在"尝试使用双链"前打钩，点击下一步，如果是比较蛋白序列，此步骤可W省略，在 "多序列比对"窗口中点击下一步，其余参数按照系统默认值设定，在"多重比对"窗口中点 击"完成"按钮，即可进入"多序列比对"的结果界面
[0102] 氨基酸序列预测的方法，可采用本领域常用的氨基酸序列预测软件进行，如可采 用DNAMAN6.0软件。具体操作方法为:打开DNAMAN6.0软件，打开"文件"菜单下的"文件"命 令，选择合适的含有核巧酸序列的文件，点击"打开"按钮，选择"编辑"菜单下的"全选"命 令，选择"序列"菜单下的"载人序列"命令下的"从选定项目"子命令，点击"是"按钮，选择 "蛋白质"菜单下的"翻译"命令，在"翻译参数"对话框中，"读码框"一栏选择"读码框Γ，在 "显示DNA" -栏选择"无"，其余参数按照系统默认值设定，点击"确定"按钮，即出现的编码 蛋白的预测结果，W序列文件的格式出现
[0103] 利用DNAMAN6.0软件中的多重序列比较的功能进行基因序列的比对，找到不同材 料中基因序列的差异，作为初步快速判断油菜油酸含量的依据。
[0104] 实验的结果，序列比对的结果：
[0105] 高油酸材料的Bn￡iLCR78基因、高油酸材料的Bn￡iLCR78基因的cDNA、彭埼论文 化aLCR78基因序列比对的比对实验结果见说明书附图1。
[0106] 图1实验结果表明，在高油酸含量的油菜中，W其cDNA作为模板，经PCR扩增仍然得 到的是保留了内含子的BnaLCR78的全长基因序列。表明高油酸甘蓝型油菜的基因组 化aLCR78基因含有内含子，反转录得到的高油酸材料的基因组化aLCR78的cDNA也保留了内 含子。
[0107] 高油酸材料的化aLCR78基因的核巧酸序列如序列表SEQ ID NO.5的核巧酸序列所 示，该基因翻译的蛋白是提前中止的，包括了断裂蛋白序列SEQ ID NO.7、SEQ ID NO. 18、 SEQ ID N0.19、SEQ ID N0.20、SEQ ID N0.2USEQ ID N0.22、SEQ ID N0.23、SEQ ID N0.24、WQ ID N0.25、WQ ID N0.26、WQ ID側.27共^^一个断裂的蛋白/多肤序列；断裂 蛋白的具体形式见附图3所示。
[0108] 高油酸材料的化曰10?78基因的〇0魁的核巧酸序列如序列表569 10^.6的核巧酸 序列所示，其翻译的蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.8的氨基酸序列所示，SEQ ID NO. 8翻译完全。
[0109] 彭巧2011年论文化aLCR78基因（BnaLCR78基因核巧酸序列如序列表沈Q ID N0.4 所示）翻译出的蛋白是提前中止的，包括了断裂蛋白序列SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29共Ξ个断裂的蛋白/多肤序列;断裂蛋白的具体形式见附图4所示。
[0110] 在另一组平行进行的，彭埼论文公开的化化CR78基因的cDNA序列，与高油酸材料 的化化CR78基因的cDNA序列，高油酸材料的对照材料W及低油酸材料的化aLCR78基因的 cDNA序列比对实验结果见说明书附图2a、W及分别翻译出的蛋白氨基酸序列的比对实验结 果见图化所不。
[0111] 图2实验结果表明，W高油酸含量油菜的cDNA作为模板扩增得到的化化CR78基因 的另一种形式就是正常的被剪切了的内含子，与另两种类型（高油酸对照材料、低油酸材 料)油菜中扩增得到的结果一致。图1实验结果显示，W高油酸含量油菜的cDNA作为模板扩 增得到的化化CR78基因的另一种形式是含有内含子的形式。内含子的可变剪切，只是在高 油酸油菜中被发现。
[0112] 高油酸材料的化化CR78基因的cDNA序列的核巧酸序列如如序列表SEQ ID N0.10 的核巧酸序列所示；其翻译的蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.14的氨基酸