序列所 示，SEQ ID NO. 14翻译完全。
[0113] 高油酸材料的对照材料的的cDNA序列的核巧酸序列如如序列表SEQ ID NO. 11的 核巧酸序列所示;其翻译的蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.15的氨基酸序列所示， 沈Q ID NO. 15翻译完全。
[0114] 低油酸材料的化aLCR78基因的cDNA序列的cDNA序列的核巧酸序列如如序列表SEQ ID NO.12的核巧酸序列所示;其翻译的蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.16的氨基酸 序列所示，SEQ ID NO. 16翻译完全。
[0115] 彭埼论文公开的化aLCR7 8基因的cDNA序列的cDNA序列的核巧酸序列如如序列表 SEQ ID NO. 13的核巧酸序列所示;其翻译的蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 17的氨 基酸序列所示，SEQ ID NO. 17翻译完全。
【主权项】
1. 一种含有高油酸的甘蓝型油菜的测定方法，含有以下步骤： (1)测定甘蓝型油菜的BnaLCR78基因的转录存在可变剪切，则所述甘蓝型油菜含有高 油酸； 或测定甘蓝型油菜的BnaLCR78基因的转录不存在可变剪切，则所述甘蓝型油菜不含高 油酸。2. 根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述可变剪切为，BnaLCR78基因内含子 的转录存在可变剪切。3. 根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于包含以下步骤： (1) 提取甘蓝型油菜的BnaLCR78基因的mRNA，反转录得到所述mRNA的cDNA，反转录引物 的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1的核苷酸序列所示； (2) 对步骤（1)获得的cDNA进行PCR扩增，PCR扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的核苷酸序列所示； (3) 对步骤(2)制备得到的cDNA扩增产物测序，得到所述cDNA核苷酸序列； (4) 将步骤（3)测序得到的cDNA核苷酸序列与BnaLCR78基因的核苷酸序列比较，步骤 (3)所述的测序结果既包括含有BnaLCR78基因内含子的cDNA核苷酸序列，步骤(3)所述的测 序结果也包括不含BnaLCR78基因内含子的cDNA核苷酸序列，则该甘蓝型油菜为高油酸含量 的甘蓝型油菜;所述BnaLCR78基因的核苷酸序列如SEQIDN0.4的核苷酸序列所示； 或将步骤(3)测得的cDNA的核苷酸序列与BnaLCR78基因的核苷酸序列比较，步骤(3)所 述的测序结果均为不含BnaLCR78基因内含子的cDNA核苷酸序列，则该甘蓝型油菜为低油酸 含量的甘蓝型油菜;所述BnaLCR78基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4的核苷酸序列所示。4. 根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述高油酸为油菜的油酸含量大于或 等于60%，所述低油酸为油菜的油酸含量小于60%。5. 根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于步骤(4)所述的BnaLCR78基因的核苷酸 序列，可替换为待测甘蓝型油菜的BnaLCR78基因的核苷酸序列。6. 根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，所述的测定方法由以下步骤组成： (1) 反转录:提取待测材料的mRNA，在冰上，于无菌的离心管中加入提取的mRNA10pg-5y g，引物lyL，1 OmM dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)混合物lyL，然后加入由焦碳酸二乙酯处 理并经高温高压灭菌过滤的纯水至13yL;所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1的 核苷酸序列所示； (2) 混合均匀，65°C保持5分钟，然后迅速至于冰上保持1分钟； (3) 在冰上，向离心管中加入5倍First-Strand缓冲液4yL，40u/yL的RNA降解酶RNase抑 制剂lyL，0.1mol 的二硫苏糖醇 DTT lyL，200u/yL 的反转录酶 III Superscript III Reverse Transcriptase lyL，至总体积2〇yL; (4) 混匀，置于50°C，保持60分钟； (5) 置于70 °C保持15分钟，终止反应，得反转录产物cDNA; (6) 将步骤(5)制备的反转录产物置于零下20°C保存； (7 )PCR扩增:使用Bio-Rad的PCR仪T100，反应程序为:94°C保持4分钟，94°C保持40秒， 58 °C保持40秒，72 °C保持30秒，进行35个循环，于72 °C保持7分钟；反应体系为:cDNA模板2μ L，上下游引物各0.5yL，10mM dNTPS(四种脱氧核苷酸的混合物)0.8yL，5U/yL的ES Taq DNA 聚合酶0.8yL，10倍聚合酶链式反应缓冲液3yL，然后用无菌水体积补足至30yL; (8) 对步骤(7)扩增得到的cDNA产物进行测序，得到测序结果cDNA的核苷酸序列； (9) 序列比对:将步骤(8)得到的测序结果cDNA核苷酸序列与BnaLCR78基因的核苷酸序 列比较，步骤⑶所述的测序结果既包括含有BnaLCR78基因内含子的cDNA核苷酸序列，步骤 (8)所述的测序结果也包括不含BnaLCR78基因内含子的cDNA核苷酸序列，则该甘蓝型油菜 为高油酸含量的甘蓝型油菜;所述BnaLCR78基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4的核苷酸序 列所示； 或将步骤(8)测得的测序结果cDNA的核苷酸序列与BnaLCR78基因的核苷酸序列比较， 步骤(8)所述的测序结果均为不含BnaLCR78基因内含子的cDNA核苷酸序列，则该甘蓝型油 菜为低油酸含量的甘蓝型油菜;所述BnaLCR78基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4的核苷酸 序列所示。7. 权利要求1-6任一项所述的测定方法在检验和判定甘蓝型油菜是否属于高油酸油菜 的用途。8. -种检测甘蓝型油菜BnaLCR78基因的基因型的PCR方法，包括： (1) 反转录:提取待测材料的mRNA，在冰上，于无菌的离心管中加入提取的mRNA 10pg-5 yg，引物lyL，10mM dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)混合物lyL，然后加入由焦碳酸二乙酯 处理并经高温高压灭菌过滤的纯水至13yL;所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1 的核苷酸序列所示； (2) 混合均匀，65°C保持5分钟，然后迅速至于冰上保持1分钟； (3) 在冰上，向离心管中加入5倍First-Strand缓冲液4yL，40u/yL的RNA降解酶RNase抑 制剂lyL，0.1mol 的二硫苏糖醇 DTT lyL，200u/yL 的反转录酶 III Superscript III Reverse Transcriptase lyL，至总体积2〇yL; (4) 混匀，置于50°C，保持60分钟； (5) 置于70 °C保持15分钟，终止反应，得反转录产物cDNA; (6) 将步骤(5)制备的反转录产物置于零下20°C保存； (7 )PCR扩增:使用Bio-Rad的PCR仪T100，反应程序为:94°C保持4分钟，94°C保持40秒， 58 °C保持40秒，72 °C保持30秒，进行35个循环，于72 °C保持7分钟；反应体系为:cDNA模板2μ L，上下游引物各0.5yL，10mM dNTPS(四种脱氧核苷酸的混合物)0.8yL，5U/yL的ES Taq DNA 聚合酶0.8yL，10倍聚合酶链式反应缓冲液3yL，然后用无菌水体积补足至30yL; (8) 对步骤(7)扩增得到的cDNA产物进行测序，得到测序结果cDNA的核苷酸序列； (9) 序列比对:将步骤(8)得到的测序结果cDNA核苷酸序列与BnaLCR78基因的核苷酸序 列比较，步骤⑶所述的测序结果既包括含有BnaLCR78基因内含子的cDNA核苷酸序列，步骤 (8)所述的测序结果也包括不含BnaLCR78基因内含子的cDNA核苷酸序列，则该甘蓝型油菜 为高油酸含量的甘蓝型油菜;所述BnaLCR78基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4的核苷酸序 列所示； 或将步骤(8)测得的测序结果cDNA的核苷酸序列与BnaLCR78基因的核苷酸序列比较， 步骤(8)所述的测序结果均为不含BnaLCR78基因内含子的cDNA核苷酸序列，则该甘蓝型油 菜为低油酸含量的甘蓝型油菜;所述BnaLCR78基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4的核苷酸 序列所示。
【专利摘要】本发明提供了一种快速、便捷的判断甘蓝型油菜是否属于高油酸含量的油菜的测定方法，具体公开了通过判断甘蓝型油菜的BnaLCR78基因的转录是否存在可变剪切，即BnaLCR78基因的内含子是否存在可变剪切的测定方法，以此判断油菜是否属于高油酸油菜。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105671161
【申请号】CN201610118586
【发明人】李壮, 余世聪, 蔺丽丽, 牛应泽, 吴永成, 郭世星, 杜俊波
【申请人】四川农业大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月2日