d Spring Harbor Laboratory Press;1997)。
[0034] 优选地，所述载体包含一个LT則寸，所述载体包含两个PBS。一个PBS位于靠所述载 体的5'末端（5'PBS)，且可被精确地置于所述驱动载体基因组转录的启动子的转录启始位 点上。一个PBS位于靠所述载体的3'末端，在所述LTR的3'端(3'PBS)。所述3'PBS在逆转录过 程中作为负义链合成的启始位点。所述5'PBS在逆转录过程中为正义链转移提供同源性。
[0035] 优选地，所述载体包含两个LTR(-个5 ' LTR和一个3 ' LTR)时，所述载体包含一个 PBS。所述PBS位于靠所述载体的5 '末端(5 ' PBS)并且位于所述5 ' LTR的3 '端。所述PBS作为负 义链合成的启始位点并且在逆转录过程中为正义链转移提供同源性。
[0036] 在一特定的实施方案中，本发明提供了一逆转录病毒载体，包含:一5'引物结合位 点、一3'长末端重复序列、一RNA包装序列，W及一3'引物结合位点或一5'长末端重复序列， 其中所述RNA包装序列位于所述3 '长末端重复序列的3 '端，运样所述RNA包装序列不被逆转 录进入祀细胞内的载体DNA中。
[0037] 所述载体包含一RNA包装序列，其位于所述长末端重复序列的3 '端，运样所述RNA 包装序列不被逆转录进入祀细胞的载体DNA中。在所述载体包含两个长末端重复序列的实 施方案中，所述RNA包装序列位于所述3 '长末端重复序列的3 '端（即，在两个LTR的3 '端），运 样所述RNA包装序列不被逆转录进入祀细胞内的载体DNA中。所述RNA包装序列对于包装逆 转录病毒RNA基因组进入病毒颗粒的过程是必要的，因为病毒颗粒由生产细胞组装。所述 RNA包装序列能够在新生的病毒颗粒中结合至病毒蛋白。在一些实施方案中，所述RNA包装 序列包含RNA包装信号（W )。在HIV-I中，gag基因的一部分被发现参与RNA包装。所述RNA包 装序列还可W包含Rev应答元件(RRE)dRNA包装序列及构成它的组件为本领域技术人员所 熟知（例如，见Retroviruses.Edited by Coffin JM,Hughes SH,and Varmus 皿.Cold Spring Harbor(NY):Cold Spring Harbor Laboratory Press；1997)〇
[0038] 在一些实施方案中，所述载体还包含一用于投送进入祀细胞的外源核巧酸序列。 运个外源核巧酸序列可W是任何可能想要插入到祀细胞中的序列。例如，所述外源核巧酸 序列可W时一可表达的转基因、一RNA干扰框或一份子条形码，例如，用于标记不同细胞的 谱系。所述外源核巧酸序列应位于所述PBS(当有两个PBS时为5'PBS)和所述LTR(当有两个 LTR时为3'LTR)之间。
[0039] 在一些实施方案中，所述外源核巧酸序列是一可表达的转基因。运个转基因是一 非逆转录病毒基因并且可W是在祀细胞中需要表达的任何基因。所述可表达的转基因应位 于所述PBS (当有两个PBS时为5 ' PBS)和所述LTR(当有两个LTR时为3 ' LTR)之间。所述转基因 可编码一肤或蛋白，或一非编码RNA。在一些实施方案中，所述转基因编码一肤或蛋白。优选 地，所述肤或蛋白应可用于基因治疗。在一些实施方案中，所述转基因在一启动子(例如，一 PGK或GAPDH启动子)的控制下。
[0040] 所述转基因的表达可能有助于细胞的正常生长或维持一对象的健康。在一些实施 方案中，所述转基因编码在对象中不表达或低表达的肤或蛋白。可选地，所述转基因可W编 码有助于预防或缓解一医疗状况的肤或蛋白。所述肤或蛋白可W是用于治疗W下疾病的一 种肤或蛋白，如癌症、动脉粥样硬化、镶刀细胞贫血症、感染、代谢素乱、神经疾病及地中海 贫血症。运类肤或蛋白的例子有血红蛋白、造血生长因子如粒细胞-巨隧细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、巨隧细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、红细胞生成素 化PO)、一般gamma链、Wiskott-Al化ich综合征蛋白（WASp)、GP91地OX及ABCDl。另一个例子 是肿瘤坏死因子(TNF)，其是一种能够被用于治疗癌症的分子，特别是肿瘤。肿瘤抑制蛋白 p53和视网膜母细胞瘤(RB)也被考虑在内。各种细胞因子，如肥大细胞生长因子(MGF)和白 细胞介素1-11也是被本发明所考虑的蛋白。一编码多药物抗性基因(mdR)的糖蛋白也被考 虑为转基因。所述肤或蛋白也可W是一针对真核细胞中的抗性筛选标记。其他种类的筛选 标记，如APRT缺陷细胞中的腺嚷岭憐酸核糖转移酶(APRT)，巧光蛋白或蛋火虫巧光素酶基 因也被包括在内。所述肤或蛋白可W是给宿主提供附加的或改变的酶活性的一蛋白，如单 纯瘤疹病毒胸巧激酶蛋白用于反应性移植的"自杀疗法"，或一毒蛋白，如用于治疗癌症的 白喉毒蛋白。编码运些蛋白的转基因可通过多种方法中的任一种所提供，如常规的克隆步 骤（Sambrook et al.(1989),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring 化rbor，NY)，从含有所关注的基因的载体上切除，或基于已经发表的序列信息的化学或酶 法的合成。在众多例子当中编码所关注蛋白的DNA可购买获得。在另一实施方案中，所述转 基因编码一蛋白，其能够在实验上操作细胞，例如一毒蛋白或一巧光或药物筛选标记。
[0041] 在另一优选的实施方案中，所述转基因能够被转录成一非编码RNA分子。在一些实 施方案中，所述转基因编码一非编码RNA，所述非编码RNA可W改变细胞内基因表达的水平 或具有酶活性的核糖核蛋白复合物的一个组件。运类非编码RNA的例子有短干扰RNA (SiRNAs)、microRNA、小核仁RNA(snoRNAs)、小核RNA(snRNAs)、piwi-作用RNA(PiRNAs)、长 非编码RNAs、转运RNA( tRNAs)和核糖体RNA(rRNAs)。在一些实施方案中，所述转基因可能编 码一非编码RNA，所述非编码RNA的互补性足够与一所关注的mRNA或DNA杂交。运样的RNA分 子为反义RNA，并且在防止或限制产量过度的、缺陷的或其他不需要的分子的表达或研究一 基因的功能上有用。本发明的载体可W包含一编码一反义RNA的序列作为转基因，其与一祀 序列足W互补到其结合至所述祀序列。例如，所述祀序列可W是编码一多肤的mRNA的一部 分，运样所述反义RNA结合到并组织编码所述多肤的mRNA的翻译。在另一实施方案中，所述 祀序列是一基因的一个片段，所述片段是转录所必需的，运样所述反义RNA结合到所述片段 (例如，一启动子或编码区）上并阻止或限制转录。因此，所述反义RNA必需具有足够的长度 和互补性来防止其祀mRNA的翻译或其祀DNA的转录。本领域技术人员可W确定对一祀序列 具有足够互补性的反义分子，运样所述反义分子能够结合到祀标上从而抑制了翻译或转 录。所述转基因的序列可W通过，例如化学或酶法合成，或商业来源提供。
[0042] 所述载体可能还包含有助于所述载体转导和表达的元件。运些元件通常位于所述 PBS(当有两个PBS时为5 ' PBS)和所述LTR(当有两个LTR时为3 ' LTR)。
[0043] 例如，所述载体可能还包含一3 '多聚嚷岭区（3 'PPT)。当在RNA中存在时，运是一个 对逆转录病毒的逆转录酶的RNase巧舌性有抗性的位点。优选地，其位于所述LTR(当有两个 LTR时为3 ' LTR)的5 '端。所述PPT可能在5 '端的一侧位置紧接所述LTR(如果有两个3 ' LTR)。
[0044] 所述载体可能还包含一中央多聚嚷岭区（cPPT)。所述载体还可能包含一转录后调 控元件(PRE)，如一啄木鸟肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。在一些实施方案中，所述载体 还包含一中央嚷岭区（cPPT)和一转录后调控元件(PRE)。
[0045] 所述载体还可能包含一多聚腺巧酸化(POlyA)信号，如猴空泡病毒40(SV40)早期 或晚期多聚腺巧酸化(POlyA)信号。优选地，所述POlyA信号位于所述RNA包装序列的3'端。 优选地，所述载体还包含一 SV40晚期POlyA信号。优选地，其位于所述载体的3 '末端，在其他 组件之后，如所述RNA包装序列。
[0046] 所述载体优选地包含一驱动所述载体基因组转录的启动子。其可能是任何合适的 启动子，包括Rous肉瘤病毒(RSV)启动子、人巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、脾焦点形成 病毒(SFFV)启动子或HIV-1U3启动子。运种启动子优选地位于所述载体的5'末端。
[0047] 优选地，所述载体的引物结合位点精确地位于所述驱动载体基因组转录的启动子 的转录启始位点上。当有两个PBS的时候，所述5'PBS优选地精确地位于所述驱动载体基因 组转录的启动子的转录启始位点上。
[0048] 优选地，一逆转录病毒主要剪接供体(MSD)位点位于所述载体的5'末端邻近启动 子。该MSD位点可能位于所述PBS(当有两个PBS时为5'PBS)的3'端。已经发现运增加了所述 载体的滴度水平。
[0049] 在一所述载体含有一个LTR和两个PBS的实施方案中，，所述载体从5'到3'方向包 含如下组件：
[(K)加]5'-启动子-PBS-可表达的转基因-LTR-PBS-RNA包装序列-3'。
[0051 ]在一所述载体包含两个LTR和一个PBS的实施方案中，所述载体从5 '到3 '方向包含 如下组件：
[0化2] 5'-启动子-LTR-PBS-可表达的转基因-LTR-RNA包装序列-3'。
[0053] 在一所述载体包含一个LTR和两个PBS的实施方案中，所述载体从5'到3'方向包含 如下组件：
[0054] 5 启动子-PBS-MSD (任选的）-CPPT (任选的）-可表达的转基因 -WPRE (任选的）-PPT-LTR-PBS-MSD (任选的）-RNA包装序列-PO IyA信号(任选的）-3 '。
[0055] 在一所述载体包含两个LTR和一个PBS的实施方案中，所述载体从5'到3'方向包含 如下组件：
[0056] 5 启动子-LTR-PBS-MSD(任选的）-CPPT(任选的）-可表达的转基因-WPRE(任选 的)-PPT-LTR-MSD (任选的)-RNA包装序列-PO IyA信号(任选的)-3 '。
[0057]在另一实施方案中，提供了一包含上述载体的宿主细胞。所述宿主细胞可能是所 述载体被引入其中的任何合适的真核细胞。
[005引编码本发明所述逆转录病毒载体的质粒通过本领域技术人员所知的标准方法被 转染进入合适的宿主细胞(或包装细胞）内。合适的包装细胞在运里被定义为包含辅助病毒 的细胞，辅助病毒足W使所转录自所述逆转录病毒载体的RNA被包装且释放载体病毒颗粒。 通常，包装所需的编码反式作用病毒序列但缺乏顺式作用序列的附加质粒会被共转染。运 些附加质粒提供了所需的结构和酶蛋白来包装并产生表达的病毒骨架RNA。运样的包装细 胞为本领域技术人员是本领域技术人员所知并能获得，包括，例如，肥K293T细胞。
[0059] 产生自转染细胞的重组逆转录病毒通过标准方法收集。所收集的呈病毒颗粒形式 的逆转录病毒通过标准的技术被用于转导一受纳祀细胞。祀细胞在运里被定义为任何易于 接受本发明逆转录病毒载体所产生的病毒的感染的细胞。所述祀细胞可W为体外或离体。 代表性的祀细胞包括，例如，骨髓干细胞、肝细胞、肌肉细胞、肿瘤细胞、神经元、视网膜与气 道上皮细胞。随后在所述祀细胞中形成的前病毒可W表达转基因。因为所述前病毒不包含 RNA包装序列，任何内源存在的辅助蛋白都不能触发从前病毒产生感染性的病毒。
[0060] 在一进一步的实施方案中，提供了一含有上述载体的病毒颗粒。
[0061] 还提供了一药物组合物，包含上述载体或病毒颗粒。所述药物组合物可能进一步 包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
[0062] 此外，提供了一用于治疗，特别是用于基因治疗的载体或病毒颗粒。
[0063] 还提供了在基因治疗中用于投送一转基因至一对象的载体或病毒颗粒。
[0064] 本发明提供了一种投送一基因至一对象内祀细胞的方法，所述方法包括对所述对 象施用有效量的载体或病毒颗粒。该方法可用于构建一表达所关注基因的细胞系。例如，所 述基因可W编码一生物治疗产物，运样所述细胞系产生所述生物治疗产物，例如，一种治疗 的蛋白或抗体。
[0065] 本发明还提供了通过上述方法产生的细胞。
[0066] 进一步，提供了一投送一基因至一对象祀细胞的方法，所述方法包括对所述对象 施用有效剂量的一载体或病毒颗粒。
[0067] 所述对象可W是人或动物。当所述对象是人时，所述基因可W作为基因治疗的一 部分被投送到所述对象，使所述基因在所述对象体内表达。当所述对象是一动物时，上述方 法可被用于产生一转基因动物，其中所述基因被表达。
[0068] 本发明还提供了通过上述方法所产生的一转基因动物。
[0069] 下面将仅通过举例的方式结合W下图片对本发明进行详细描述。
[0070] 附图简述
[0071] 图基因组与由其衍生的RRL/CCL第S代慢病毒载体系统的示意图。U3,3' 区独特;R，重复区域;U5，5 '区独特;PBS，引物结合位点；W，RNA包装信号;PPT，多聚嚷岭区； LTR，长末端重复序列;RSV，Rous肉瘤病毒U3启动子;CMV，人巨细胞病毒立即早期启动子；A gag，截短的gag序列；