Yarrowia)如解脂耶罗维亚酵 母（Yarrowia Iipolytica);来自伊萨酵母属（Issatchenkia)如东方伊萨酵母 (Issathenkia oriental is);来自德己利酵母属（Debaryomyces)如汉逊德己利酵母 (Debaryomyces hansenii);来自Arxula属如Arxula adenoinivorans;或者来自克鲁维酵 母菌属化Iuyveromyces)如乳酸克鲁维酵母菌化Iuyveromyces Iactis)。
[0017] 可W在一种或多种细胞(例如宿主细胞)株中实施本文中描述的途径的反应，所述 细胞株(a)天然表达一种或多种相关酶，（b)经过遗传工程化改造 W表达一种或多种相关 酶，或（C)天然表达一种或多种相关酶，并且经过遗传工程化改造 W表达一种或多种相关 酶。或者，相关酶可W自任何上述类型的宿主细胞提取，并且可W W纯化或半纯化形式使 用。任选地，提取的酶可W固定化到固体基片，诸如合适的反应容器的底和/或壁。此外，此 类提取物包括可W用作相关酶的来源的裂解物(例如细胞裂解物)或部分纯化的裂解物。在 由本文件提供的方法中，可W在宿主(宿主细胞）中进行所有步骤，可W使用提取的酶进行 所有步骤，或者可W在细胞中进行一些步骤，并且可W使用提取的酶进行其他步骤。在任何 方法中，反应可W是单步骤转化，其中将一种化合物直接转化为感兴趣的不同化合物(例如 异下締酷基-CoA至异下締酸盐），或者转化可W包括两个或更多个步骤来将一种化合物转 化为感兴趣的不同化合物。
[0018] 除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术 人员的通常理解具有相同的意义。虽然可W使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的 方法和材料来实施本发明，但是下文描述了合适的方法和材料。通过提及完整并入本文中 提及的所有出版物、专利申请、专利、和其它出版物。在冲突的情况中，应W本说明书(包括 定义)为准。另外，材料、方法和例子仅是例示性的，而不意图为限制性的。
[0019] 本发明的一个或者多个实施方案的细节在附图和下面的描述中阐明。根据说明书 和附图，并根据权利要求书，本发明的其它特征、目的和优点将是明显的。根据专利法的标 准实践，词语"包含"在权利要求书中可被"基本上由…组成"或者"由…组成"替代。
[0020] 附图简述
[0021] 图I是导致异下締酸生成的生物合成途径的示意性概述。
[0022] 图2含有大肠杆菌硫醋酶(GenBank登录号AAA24665.1，SEQ ID NO: 1)、大肠杆菌硫 醋酶（GenBank登录号ACX40038,沈Q ID N0:2)，流感嗜血菌化aemopMlus influenza)酷 基-CoA 硫醋酶（GenBank 登录号 AD096882, SEQ ID N0:3)，丙酸梭菌（Clostridium propionicum)丙酸CoA-转移酶(GenBank登录号CAB77207.1，SEQ ID N0:4)，埃氏巨球形菌 (Megas地aera elsdenii)DSM20460丙酸CoA-转移酶（Genbank登录号CCC72964.1，SEQ ID N0:5)，假单胞菌物种（Pseudomo nas sp. )VLB 120异下醒脱氨酶（Genbank登录号 AGZ35351.1 ,SEQ ID N0:6) ,Shewanella oneidensis MR-I异下酷基-CoA脱氨酶（SEQ ID NO: 7)、大肠杆菌苯乙醒脱氨酶(GenBank登录号CAA67780.1，SEQ ID NO: 8)和阿维链霉菌 (Sheptomyces avermitilis)异下酷基-CoA脱氨酶（GenBank登录号AAD44196.1,SEQ ID N0:9)的氨基酸序列。
[0023] 发明详述
[0024] 特别地，本文件提供了酶、非天然途径、培养策略、给料、宿主微生物和对宿主生物 化学网络的减弱，其可W用于从中屯、前体或中屯、代谢物合成异下締酸（2-甲基丙締酸）。例 如，可W从丙酬酸生成异下締酸，合成经由2-氧代-异戊酸，接着是异下醒、异下酸和异下酷 基Co A进行。或者，合成可W直接从2-氧代-异戊酸进行到异下酷基CoA，而没有首先形成异 下醒，然后形成异下酸。如本文中使用的，术语"中屯、前体"用于表示导致异下締酸合成的本 文中公开的途径中的任何代谢物。术语"中屯、代谢物"在本文中用于表示在所有微生物中产 生W支持生长的代谢物。
[0025] 因此，本文中描述的宿主微生物可W包含内源途径，该内源途径可W经操作，使得 可W生成异下締酸。在内源途径中，宿主微生物天然表达催化途径内的反应的所有酶。含有 工程化途径的宿主微生物不天然表达催化途径内的反应的所有酶，但是已经经过工程化改 造，使得在宿主中表达途径内的所有酶。例如，宿主可W包含合成丙酬酸的内源酶。在工程 化途径内，酶可W来自单一来源，即来自一种物种，或者可W来自多种来源，即不同物种。编 码本文中描述的酶的核酸已经从各种生物体中鉴定，并且在公众可用的数据库诸如 GenBank或EMBL中容易得到。
[0026] 可W用于异下締酸生成的本文中描述的任何酶可W与相应的野生型酶的氨基酸 序列具有至少70 %序列同一性（同源性）（例如至少75 %、80 %、85 %、90 %、95 %、97 %、 98%、99%或100%)。例如，本文中描述的硫醋酶可W与大肠杆菌硫醋酶诸如testB的基因 产物(GenBank登录号AAA24665.1,沈Q ID NO: IKGenBank登录号ACX40038的大肠杆菌硫醋 酶(SEQ ID N0:2)、或来自流感嗜血菌的酷基-CoA硫醋酶，诸如yciA的基因产物(GenBank登 录号AD096882，SEQ ID N0:3)具有至少70%序列同一性（同源性）（例如至少75%、80%、 85%'90%'95%'97%'98%'99%或 100%)。
[0027] 例如，本文中描述的丙酸CoA-转移酶与来自丙酸梭菌（GenBank登录号 CAB77207.1，SEQ ID N0:4)或埃氏巨球形菌DSM 20460(Genbank登录号CCC72964.1，SEQ ID N0:5)的丙酸CoA-转移酶的氨基酸序列可W具有至少70%序列同一性（同源性）（例如至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%)。参见Prabhuetal.，2012， Appl .Environ.Microbiol. ,78(24) ,8564-8570,其指示了来自埃氏巨球形菌的丙酸CoA-转 移酶接受异下締酷基-CoA作为底物。
[00%]例如，本文中描述的异下醒脱氨酶可W与EC 1.2.1.-下分类的来自假单胞菌物种 化8120的异下醒脱氨酶(66扣曰证登录号46235351.1，569 10^:6)的氨基酸序列具有至少 70 % 序列同一性（同源性）（例如至少 75 %、80 %、85 %、90 %、95 %、97 %、98 %、99 % 或 100%)。参见Lang et al.,2014,Microbial Cell Factories,13(2),1-14,其指示异下醒 脱氨酶接受异下醒作为底物。
[0029] 例如，本文中描述的异下酷基-CoA脱氨酶可W与例如EC 1.3.99.12下分类的来自 化ewanella oneidensis MR-1(SEQ ID N0:7)或来自阿维链霉菌（Genbank登录号 AAD44196.1，SEQ ID N0:9)的异下酷基-CoA脱氨酶的氨基酸序列具有至少70%序列同一性 (同源性）（例如至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99% 或 100%)。参见 Kazakov et al.,2009,J.Bacteriol.,191(1),52-64,及Zhang et al.,1999,Microbiology,145, 2323-2334,其指示异下酷基-CoA脱氨酶接受异下酷基-CoAQsobyty^ ^CoA)作为底物。
[0030] 例如，本文中描述的苯乙醒脱氨酶可W与来自大肠杆菌的苯乙醒脱氨酶的氨基酸 序列(Genbank登录号CAA67780.1，沈Q ID N0:8)具有至少70%序列同一性（同源性）（例如 至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%)。参见Xiongetal.，2012， Sci . Rep .，2，1 -13，其指示苯乙醒脱氨酶接受异下醒作为底物。
[0031] 可W如下测定两种氨基酸序列间的百分比同一性（同源性）。首先，使用来自含有 BLASTP第2.0.14版的单机版BLASTZ的BLAST 2 Sequences(B12seq)程序比对氨基酸序列。 此单机版BLASTZ可W获自Fish&Richardson的网站(例如WWW. fr. com/blast/)或美国政府 国立生物技术信息中屯、网站(WWW.ncbi .nlm.nih.gov)。解释如何使用B12seq程序的用法说 明可W参见伴随BLASTZ的自述文件。B12seq使用BLASTP算法实施两种氨基酸序列之间的比 较。为了比较两种氨基酸序列，如下设置B12seq的选项:-i设置为含有要比较的第一氨基酸 序列的文件(例如C:\seql.txt) ;-j设置为含有要比较的第二氨基酸序列的文件(例如C:\ seq...