的(R)-对映异构体的情况下，存 在与底物的(S)-对映异构体相关的相似的酶活性，其不一定为相同的酶种类。
[0070] 本文件还认识到，在已经显示酶接受特定辅因子如NADPH或者共底物如乙酷基-CoA的情况下，许多酶在催化特定酶活性中在接受大量不同辅因子或者共底物方面是泛宿 主性的（promiscuous)。此外，本文件认识到，在酶对例如特定辅助因子如NADH具有高特异 性的情况下，对辅助因子NADPH具有高特异性的具有相似或者相同活性的酶可为不同的酶 种类。
[0071] 在一些实施方案中，上文概述的途径中的酶是经由非直接或者合理酶设计方法的 酶工程的结果，目的在于改善活性、改善特异性、降低反馈抑制、降低阻抑、改善酶溶解度、 改变立体特异性，或者改变辅助因子特异性。
[0072] 在一些实施方案中，将上文概述的途径中的酶经由附加型或者染色体整合方法基 因投入(gene dose)(即，过表达)至所得的遗传修饰的生物体中。
[0073] 在一些实施方案中，利用基因组级别(genome-scale)系统生物学技术如通量平衡 分析来设计用于将碳流量引导至异下締酸盐的基因组级别的弱化或者敲除策略。
[0074] 弱化策略包括但不限于使用转座子、同源重组（双交叉方法）、诱变、酶抑制剂和 RNAi干扰。
[00巧]在一些实施方案中，利用通量组(fluxomic)、代谢物组(metabolomic)和转录物组 (transcriptomal)数据来告知或者支持基因组级别的系统生物学技术，由此在将碳流量导 向异下締酸盐中设计基因组级别的弱化或者敲除策略。
[0076] 在使用天然积累聚径基链烧酸醋(polyhy化〇巧日化anoates)的宿主的一些实施方 案中，可W在宿主菌株中弱化酶聚合物核酶。
[0077] 在需要丙酬酸的胞内利用度的一些实施方案中，可W通过生物素限制策略弱化丙 酬酸簇化酶的活性。
[0078] 在需要2-乙酷乳酸的胞内利用度的一些实施方案中，可W在宿主生物体中过表达 反馈抑制抗性乙酷乳酸合酶酶突变体。
[0079] 在一些实施方案中，可W在宿主中弱化导致中屯、代谢物和中屯、前体的前体和异下 締酸盐的内源降解途径。
[0080] 在一些实施方案中，通过遗传工程化改造对细胞膜的结构修饰或者提高异下締酸 盐的任何关联转运蛋白活性增强或放大异下締酸盐穿过细胞膜到胞外介质的流出。
[0081] 其它实施方案
[0082] 应理解的是，尽管本发明结合其详细描述进行了描述，但是前面的描述意图例示 并且不限制发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点和修 饰也在所附权利要求书的范围内。
【主权项】
1. 一种生成异丁烯酸盐的方法，所述方法包括使用硫酯酶或CoA-转移酶将异丁烯酰 基-CoA酶促转化为异丁烯酸盐。2. 权利要求1的方法，其中所述硫酯酶在EC 3.1.2.-下分类。3. 权利要求1的方法，其中所述硫酯酶是tesB或YciA的基因产物。4. 权利要求1-3中任一项的方法，其中所述硫酯酶与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少70%序列同一性。5. 权利要求1的方法，其中所述CoA-转移酶在EC 2.8.3下分类。6. 权利要求5的方法，其中所述CoA-转移酶与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO: 5的氨基酸序 列具有至少70 %序列同一性。7. 权利要求1-5中任一项的方法，其中从丙酮酸盐酶促合成异丁烯酰基-CoA。8. 权利要求7的方法，其中经由异丁醛从丙酮酸盐酶促合成异丁烯酰基-CoA。9. 权利要求8的方法，其中使用一种或多种下述酶从丙酮酸盐酶促合成异丁烯酰基-CoA:乙酰乳酸合酶;二羟基异戊酸脱氢酶;2，3-二羟基异戊酸脱水酶;2-氧代戊酸脱羧酶； 苯乙醛脱氢酶，异丁醛脱氢酶或乳醛脱氢酶;或CoA转移酶或连接酶;或酰基-CoA脱氢酶。10. 权利要求7的方法，其中经由将2-氧代-异戊酸盐转化为异丁酰基-CoA从丙酮酸盐 酶促合成异丁烯酰基-CoA。11. 权利要求10的方法，其中使用一种或多种下述酶从丙酮酸盐酶促合成异丁烯酰基-CoA:乙酰乳酸合酶;二羟基异戊酸脱氢酶;2，3-二羟基异戊酸脱水酶;支链脱氢酶;或酰基-CoA脱氢酶。12. -种生成异丁烯酸盐的方法，所述方法包括从丙酮酸盐酶促合成异丁醛，并且将异 丁醛酶促转化成异丁烯酸盐。13. 权利要求12的方法，其中使用苯乙醛脱氢酶、异丁醛脱氢酶或乳醛脱氢酶将异丁醛 转化为异丁酸，使用CoA转移酶或连接酶将异丁酸转化为异丁酰基-CoA，使用酰基-CoA脱氢 酶将异丁酰基-CoA转化为异丁烯酰基-CoA，并且使用硫酯酶或CoA转移酶将异丁烯酰基-CoA转化为异丁稀酸。14. 权利要求13的方法，其中所述苯乙醛脱氢酶在EC 1.2.1.39下分类。15. 权利要求14的方法，其中所述苯乙醛脱氢酶与SEQ ID N0:8中所列的氨基酸序列具 有至少70 %序列同一性。16. 权利要求13的方法，其中所述异丁醛脱氢酶与SEQ ID N0:6中所列的氨基酸序列具 有至少70 %序列同一性。17. 权利要求13的方法，其中所述CoA转移酶是EC 2.8.3.1下分类的丙酸CoA转移酶。18. 权利要求17的方法，其中所述丙酸CoA-转移酶与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO: 5的氨 基酸序列具有至少70%序列同一性。19. 权利要求13的方法，其中所述连接酶是EC 6.2.1.13下分类的丙酸CoA连接酶。20. 权利要求13-19中任一项的方法，其中所述酰基-CoA脱氢酶是异丁酰基-CoA脱氢 酶。21. 权利要求20的方法，其中所述异丁酰基-CoA脱氢酶与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9 中所列的氨基酸序列具有至少70%序列同一性。22. 前述权利要求中任一项的方法，其中在重组宿主中进行所述方法。23. 权利要求22的方法，其中所述宿主经受厌氧、需氧或微需氧培养条件下的培养策 略。24. 权利要求22或23的方法，其中经由氮、磷酸盐或氧限制在营养物限制的条件下培养 所述宿主。25. 根据权利要求22或23的方法，其中使用陶瓷中空纤维膜保留所述重组宿主细胞以 在发酵期间维持高细胞密度。26. 权利要求22或23的方法，其中补料到发酵的主要碳源源自生物或非生物给料。27. 权利要求26的方法，其中所述生物给料是或源自单糖，二糖，木质纤维素、半纤维 素、纤维素、木质素诸如乙酰丙酸和糠醛、木质素、甘油三酯例如甘油和脂肪酸、农业废物或 城市废物。28. 权利要求26的方法，其中所述非生物给料是或源自天然气、合成气、C02/H2，甲醇，乙 醇，非挥发性残留物(NVR)或来自环己烷氧化过程的碱洗液(caustic wash)。29. 权利要求22的方法，其中所述宿主是原核生物或真核生物。30. 权利要求29的方法，其中经由在选择性环境中的连续培养改善所述宿主对高浓度 的异丁烯酸的耐受性。31. 权利要求29的方法，其中在所述宿主中减弱导致并且包含异丁烯酸的中心代谢物 和中心前体的内源降解途径。32. 权利要求22的方法，其中通过遗传工程化改造对细胞膜的结构修饰或者提高异丁 烯酸的任何关联转运蛋白活性增强或放大异丁烯酸穿过细胞膜到胞外介质的流出。33. -种重组宿主，其包含至少一种编码苯乙醛脱氢酶的外源核酸，其中所述重组宿主 生成异丁烯酸。34. 权利要求33的宿主，其中所述苯乙醛脱氢酶在EC 1.2.1.39下分类。35. 权利要求33或权利要求34的宿主，其中所述苯乙醛脱氢酶与SEQ ID NO:8中所列的 氨基酸序列具有至少70 %序列同一性。36. 权利要求33-35中任一项的宿主，所述宿主进一步包含外源丙酸CoA转移酶。37. 权利要求36的宿主，其中所述丙酸CoA转移酶与SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:5的氨基 酸序列具有至少70 %序列同一性。38. 权利要求33-35中任一项的宿主，所述宿主进一步包含外源丙酸CoA连接酶。39. 权利要求33-38中任一项的宿主，所述宿主进一步包含外源硫酯酶。40. 权利要求39的宿主，其中所述硫酯酶是YciA或tesB的基因产物。41. 权利要求39的宿主，其中所述硫酯酶与SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3 的氨基酸序列具有至少70%序列同一性。42. 权利要求33-41中任一项的宿主，所述宿主进一步包含外源异丁酰基-CoA脱氢酶。43. 权利要求42的宿主，其中所述异丁酰基-CoA脱氢酶与SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:9 中所列的氨基酸序列具有至少70%序列同一性。
【专利摘要】本文件描述了使用酶(诸如一种或多种硫酯酶、转移酶或脱氢酶)以及表达一种或多种此类酶的重组宿主经由异丁醛和异丁酰基-CoA从前体(诸如丙酮酸)生成异丁烯酸盐的生物化学途径。
【IPC分类】C12P7/40, C12N9/16, C12N9/10
【公开号】CN105705650
【申请号】CN201480053694
【发明人】A.L.博特斯, A.V.E.康拉迪
【申请人】英威达技术有限责任公司
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2014年8月28日
【公告号】EP3039151A2, US20160201094, WO2015031653A2, WO2015031653A3