[0045] 在一些实施方案中，可W采用使用例如陶瓷中空纤维膜的细胞保留策略来实现并 维持异下締酸盐合成中的补料分批或连续发酵期间的高细胞密度。
[0046] 在一些实施方案中，在异下締酸合成中对发酵补料的主要碳源可W源自生物或非 生物给料。
[0047] 在一些实施方案中，生物给料可W是，可W包括或者可W源自单糖、二糖、木质纤 维素、半纤维素、纤维素、木质素诸如乙酷丙酸和慷醒、木质素、甘油=醋，诸如甘油和脂肪 酸、农业废物、或城市废物。
[0048] 已经在几种微生物(诸如大肠杆菌、钩虫贪铜菌、食油假单胞菌、恶臭假单胞菌和 解脂耶罗维亚酵母）中证明了源自生物柴油生产的粗制甘油的有效分解代谢化ee等， Appl.Biochem.Biotechnol.,2012,166:1801-1813;Yang等，Biotechnology for Biofuels,2012,5:13!MeiJnen等，Appl.Microbiol.Biotechnol.,2011,90:885-893)。
[0049] 已经在几种生物体(诸如钩虫贪铜菌和恶臭假单胞菌）中在经由前体丙酷基-CoA 合成3-径基戊酸中证明了木质纤维素衍生的乙酷丙酸的有效分解代谢(Jaremko and Yu, Journsl of Biotechnology, 2011,155,2011,293-298 ;M曰rtin 曰nd PrstherJournsl of Biotechnology,2009,139,61-67)。
[0050] 已经在几种微生物(诸如恶臭假单胞菌、钩虫贪铜菌）中证明了木质素衍生的芳香 族化合物诸如苯甲酸类似物的有效分解代谢（Bugg等，Current Opinion in Biotechnology,2011,22,394-400;P紅ez-Pantoja等，FEMSMicrobiol. Rev.,2008,32,736-794)。
[0051] 已经在几种微生物(包括解脂耶罗维亚酵母）中证明了农业废物(诸如橄揽磨坊废 水）的有效利用（Papan化olaou等，Bioresour. Technol .，2008，99(7): 2419-2428)。
[0052] 已经对几种微生物(诸如大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌和德氏乳杆菌和乳酸乳球菌） 证明了可发酵糖类(诸如源自纤维素、半纤维素、甘薦和甜菜糖蜜、木馨、玉米和其它农业来 源的单糖和二糖）的有效利用（参见例如化rmann et al, Journal of Biotechnology, 2003,104,155-172；Wee et al.,Food Technol.Biotechnol.,2006,44(2),163-172； Ohashi et 曰1.,Journ曰I of Bioscience 曰nd Bioengineering,1999,87(5),647-654)。
[0053] 已经对钩虫贪铜菌证明了源自多种农业木质纤维素来源的慷醒的有效利用化i 等，Biodegradation,2011,22:1215-1225)。
[0054] 在一些实施方案中，非生物给料可W是或者可W源自天然气、合成气、0)2/此、甲 醇、乙醇、来自环己烧氧化过程的非挥发性残留物(NVR)或碱洗废物流。
[0055] 已经对甲基营养型酵母己斯德毕赤酵母证明了甲醇的有效分解代谢。
[0056] 已经对克鲁佛梭菌证明了乙醇的有效分解代谢（S e e d 0 r f等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2008,105(6)2128-2133)。
[0057] 已经对钩虫贪铜菌证明了C〇2和出（其可W源自天然气和其它化学和石油化学来 源）的有效分解代谢(Piybylski等，Ene;rgy,Sustainability and Society ,2012,2:11)。
[0058] 已经对多种微生物(诸如杨氏梭菌和自产乙醇梭菌)证明了合成气的有效分解代 谢（反卸)ke:等，A卵lied and E；nvi;ronmen1:al Microbiology,2011,77(15):5467_5475)。
[0059] 已经对多种微生物(诸如食酸代尔夫特菌和钩虫贪铜菌证明了来自环己烧过程的 非挥发性残留物废物流的有效分解代谢（Ramsay等，Applied and Environmental Microbiology,1986,52(1):152-156)O
[0060] 在一些实施方案中，宿主微生物可W是原核生物。例如，原核生物可W是来自W下 的细菌:埃希氏菌属如大肠杆菌;梭菌属如杨氏梭菌、自产乙醇梭菌或者克鲁佛梭菌;棒状 杆菌属如谷氨酸棒状杆菌;贪铜菌属如钩虫贪铜菌或者耐金属贪铜菌;假单胞菌属如巧光 假单胞菌、恶臭假单胞菌或者食油假单胞菌;代尔夫特菌属如食酸代尔夫特菌;芽抱杆菌属 如枯草芽胞杆菌;乳杆菌属如德氏乳杆菌;或者乳球菌属如乳酸乳球菌。此类原核生物也可 W是构建能够生成异下締酸的本文中描述的重组宿主细胞的基因来源。
[0061] 在一些实施方案中，宿主微生物可W是真核生物。例如，真核生物可W是来自曲霉 属如黑曲霉的丝状真菌。另外，真核生物可W是来自酵母属如酿酒酵母;来自毕赤氏酵属如 己斯德毕赤酵母;来自耶罗维亚酵母属如解脂耶罗维亚酵母;来自伊萨酵母属如东方伊萨 酵母;来自德己利酵母属如汉逊德己利酵母;来自Arxula属如Arxula adenoinivorans;或 者来自克鲁维酵母菌属如乳酸克鲁维酵母菌的酵母。此类真核生物也可W是构建能够生成 异下締酸的本文中描述的重组宿主细胞的基因来源。
[0062] 可W在细胞中表达的外源酶可W包括下列一项或多项:例如EC 2.2.1.6下分类的 乙酷乳酸合酶;例如，6(：1.1.1.86,6(：1.2.1.39,6(：1.3.8.1，6(：1.3.8.7，或6(：1.3.99.12 下分类的脱氨酶，或由EC 1.2.4.4，EC 1.8.1.4和EC 2.3.1.168构成的支链脱氨酶复合物； 例如EC 4.2.1.9下分类的脱水酶;例如EC 4.1.1.72下分类的脱酸酶;例如EC 2.8.3.-，诸 如EC 2.8.3.1下分类的CoA转移酶;例如EC 6.2.1.7下分类的连接酶;或酷基-CoA水解酶或 例如EC 3.1.2.-下分类的硫醋酶。
[0063] 例如，重组宿主可W包含至少一种编码苯乙醒脱氨酶或异下醒脱氨酶的外源核 酸，并且生成异下締酸。苯乙醒脱氨酶可W在EC 1.2.1.39下分类，例如与SEQ ID N0:8中所 列的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的苯乙醒脱氨酶。异下醒脱氨酶可W与SEQ ID N0:6中所列的氨基酸序列具有至少70%序列同一性。宿主还可W包含一种或多种(例如2、 3、4、5、6、7、8、9或更多）可^用于将丙酬酸转化为异下締酸的外源酶。例如，重组宿主可^ 包含外源丙酸CoA转移酶(例如与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少70% 序列同一性丙酸CoA转移酶）、外源丙酸CoA连接酶、外源硫醋酶（例如YciA或tesB的基因产 物或与沈Q ID NO: 1、沈Q ID NO: 2或SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少70%序列同一性 的硫醋酶）、外源异下酷基-CoA脱氨酶(例如与SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:9中所列的氨基酸 序列具有至少70%序列同一性的异下酷基-CoA脱氨酶）、外源乙酷乳酸合酶、外源二径基异 戊酸脱氨酶、2，3-二径基异戊酸脱水酶、2-氧代戊酸脱酸酶、支链脱氨酶复合物。
[0064] 在一些实施方案中，提供重组宿主的基本上纯的培养物。如本文中使用的，重组细 胞的"基本上纯的培养物"是下述细胞的培养物，其中在培养物中活细胞的总数中少于约 40% (即，小于约：35%;30% ;25%;20% ;2% ;1% ;0.5%;0.25% 0.01% ;0.001% :0.0001%;或甚至更少)是不同于重组细胞的活细胞，例如，细菌、真菌(包 括酵母）、支原体或原生动物细胞。在此上下文中的术语"约"意指相关百分比可W是高于或 低于规定百分比的15%规定百分比。因此，例如，约20%可W是17%至23%。重组细胞的此 类培养物包括细胞和生长培养基，胆存培养基或转运培养基。培养基可W是液体、半固体 (例如，凝胶状培养基)或冷冻的。培养物包括在液体培养基中或在半固体培养基中/上生长 或正在胆存或转运培养基(包括冷冻胆存或转运培养基）中胆存或转运的细胞。培养物是在 培养容器或胆存容器或基质(例如，培养皿、烧瓶、或管或胆存管形瓶或管）中。
[00化]代谢工程
[0066] 本文件提供方法，所述方法牵设少于对上述途径描述的所有的步骤。运种方法可 牵设例如此类步骤中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多个。在运种方法包含少于所有步骤 的情况下，第一个步骤可为所列步骤中的任何步骤。
[0067] 此外，本文中描述的重组宿主可W包括上述酶中的任何组合，使得所述步骤中的 一个或者多个，例如此类步骤中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多个可^在重组宿主内实 施。
[0068] 另外，本文件认识到，在酶已经被描述为接受CoA活化的底物的情况下，存在与 [acp]结合底物相关的相似的酶活性，其不一定为相同的酶种类。
[0069] 此外，本文件认识到，在酶已经被描述为接受底物