2.txt)广P设置为blas1:p;-〇设置为任何期望的文件名称(例如C:\output.txt);并且所 有其它选项保持为其缺省设置。例如，可W使用W下命令来产生含有两种氨基酸序列间的 比较的输出文件：C:\B12seq-i c:\seql.txt-j c:\seq2.txt-p blastp-〇 c:\ output.txt。如果两种比较序列共享同源性（同一性），那么指定的输出文件会呈现那些同 源性区作为比对序列。如果两种比较序列不共享同源性（同一性），那么指定的输出文件不 会呈现比对序列。可W对核酸序列遵循相似的规程，只是使用blastn。
[0032] -旦比对，通过计算相同氨基酸残基在运两种序列中呈现的位置的数目确定匹配 数目。通过用匹配数目除W全长多肤氨基酸序列的长度，接着将所得的数值乘WlOO来确定 百分比同一性（同源性）。注意到百分比同一性（同源性)值被四舍五入到最近的十分位。例 如，78.11、78.12、78.13、和78.14被向下四舍五入到78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18、和 78.19被向上四舍五入到78.2。还注意到长度值会总是整数。
[0033] 应当领会，许多核酸可W编码具有特定氨基酸序列的多肤。遗传密码的简并性是 本领域中公知的；即对于许多氨基酸，存在有超过一种充当氨基酸密码子的核巧酸=联体。 例如，可W修饰给定酶的编码序列中的密码子，从而获得特定物种(例如细菌或真菌）中的 最佳表达，运使用适合于所述物种的密码子偏爱表进行。
[0034] 也可W在本文件的方法中使用本文中描述的任何酶的功能性片段。如本文中使用 的，术语"功能性片段"指与相应的成熟、全长、野生型蛋白质的活性具有至少25% (例如至 少30%;40%;50%;60%;70%;75%;80%;85%;90%;95%;98%;99%;100%;或甚至大 于100%)的蛋白质的肤片段。功能性片段一般但不总是可W由蛋白质的连续区构成，其中 该区具有功能性活性。
[0035] 此文件还提供了（i)本文件的方法中使用的酶的功能性变体和(ii)上文描述的功 能性片段的功能性变体。相对于相应的野生型序列，酶和功能性片段的功能性变体可W含 有添加、缺失、或取代。具有取代的酶一般会具有不超过50(例如不超过1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、12、15、20、25、30、35、40、或50)处氨基酸取代(例如保守取代）。运适用于本文中描述 的任何酶和功能性片段。保守取代是用一种氨基酸取代具有相似特征的另一种。保守取代 包括下列组内的取代:鄉氨酸、丙氨酸和甘氨酸;亮氨酸、鄉氨酸、和异亮氨酸;天冬氨酸和 谷氨酸;天冬酷胺和谷氨酷胺;丝氨酸、半脫氨酸、和苏氨酸;赖氨酸和精氨酸;和苯丙氨酸 和酪氨酸。非极性疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、鄉氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、 色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半脫氨酸、酪氨酸、天冬 酷胺和谷氨酷胺。带正电荷的（碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的（酸 性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。用上文提及的极性、碱性或酸性组的一种成员被相同组 的另一种成员的任何取代可W视为保守取代。比较而言，非保守取代是用一种氨基酸取代 具有不同特征的另一种。
[0036] 缺失变体可 W缺乏 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20 个氨基酸的区段(具有两种或更多种氨基酸)或非连续的单一氨基酸。添加(添加变体)包括 融合蛋白，其含有：（a)本文中描述的任何酶或其片段;和(b)内部或末端(C或N)无关或异源 氨基酸序列。在此类融合蛋白的背景中，术语"异源氨基酸序列"指与（a)不同的氨基酸序 列。异源序列可W是例如用于纯化重组蛋白的序列（例如FLAG、多组氨酸(例如六组氨酸）、 凝集素(HA)、谷脫甘肤-S-转移酶(GST)、或麦芽糖结合蛋白（MBP))。异源序列也可W是可用 作可检测标志物的蛋白质，例如蛋光素酶、绿色巧光蛋白（GFP)、或氯霉素乙酷基转移酶 (CAT)。在一些实施方案中，融合蛋白含有来自另一种蛋白质的信号序列。在某些宿主细胞 (例如酵母宿主细胞）中，可W经由使用异源信号序列提高祀蛋白的表达和/或分泌。在一些 实施方案中，融合蛋白可W含有可用于例如引发免疫应答W生成抗体的载体(例如KLH)或 ER或高尔基体保留信号。异源序列可W是不同长度的，并且在一些情况中可W是比与异源 序列附接的全长祀蛋白质更长的序列。
[0037] 工程化宿主可W天然表达本文中描述的途径的酶中的无一或一些(例如一种或多 种、两种或更多种、=种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、或六种或更多种）。还可W 破坏工程化宿主的内源基因 W阻止不想要的代谢物的形成或阻止经由对中间体起作用的 其它酶的途径中的此类中间体的损失。工程化宿主可W称为重组宿主或重组宿主细胞。如 此，如本文中描述的，重组宿主可W包含编码下列一项或多项的核酸：乙酷乳酸合酶、脱氨 酶，诸如二径基异戊酸脱氨酶、2-甲基酷基-CoA脱氨酶、苯乙醒脱氨酶、异下醒脱氨酶、短链 或中等链酷基-CoA脱氨酶，诸如异下酷基-CoA( isobuy化yl-CoA)脱氨酶、2,3-二径基异戊 酸脱水酶、转移酶，诸如丙酸CoA转移酶、连接酶，诸如乙酸CoA连接酶或酷基-CoA水解酶或 硫醋酶，如下文更为详细描述的。
[0038] 另外，可W使用本文中描述的分离的酶，使用来自宿主微生物的裂解物(例如细胞 裂解物)作为酶来源，或者使用来自不同宿主微生物的多种裂解物作为酶来源在体外实施 异下締酸盐的生成。
[0039] 如本文中描述的，可W通过脱氨酶，诸如例如在EC 1.3.8.1、EC 1.3.8.7、EC 1.3.99.12下分类的酶，或类EC 1.3.99.-中的其它酶酶促形成异下締酸盐的碳-碳双键，如 本文中描述的。
[0040] 在一些实施方案中，丙酬酸是异下締酸合成的前体。如图1中描绘，可W通过例如 EC 2.2.1.6下分类的乙酷乳酸合酶将丙酬酸转化为乙酷乳酸。通过例如EC 1.1.1.86下分 类的二径基异戊酸脱氨酶将2-乙酷乳酸转化为2,3-二径基异戊酸；接着通过例如在EC 4.2.1.9下分类的2，3-二径基异戊酸脱水酶将2，3-二径基异戊酸转化为2-氧代-异戊酸;接 着通过例如EC 4.1.1.72下分类的2-氧代戊酸脱酸酶将2-氧代-异戊酸转化为异下醒;接着 通过例如EC 1.2.1.39下分类的苯乙醒脱氨酶，异下醒脱氨酶，或例如EC 1.2.1.22下分类 的乳醒脱氨酶将异下醒转化为异下酸;接着通过例如EC 2.8.3下类型的CoA转移酶，诸如 例如EC 2.8.3.1下分类的丙酸CoA转移酶或者通过例如EC 6.2.1.下分类的连接酶，诸如例 如EC 6.2.1.7下分类的丙酸CoA连接酶将异下酸转化为异下酷基-CoA;接着通过例如EC 1.3.8 下分类的酷基-CoA脱氨酶诸如EC 1.3.8.1下分类的短链酷基-CoA脱氨酶，或EC 1.3.8.7下分类的中等链酷基-CoA脱氨酶，或者通过例如EC 1.3.99.12下分类的2-甲基酷 基-CoA脱氨酶将异下酷基-CoA转化为异下締酷基CoA;接着通过例如酷基-CoA水解酶或例 如EC3.1.2 .-下分类的硫醋酶，诸如yciA或tesB的基因产物或例如EC 2.8.3 .-下分类的 CoA-转移酶，诸如例如EC 2.8.3.1下分类的丙酸CoA转移酶将异下締酷基CoA转化为异下締 酸。
[0041] 在一些实施方案中，丙酬酸再次是异下締酸合成的前体，但是使用部分不同的途 径。如图1中描绘，可W通过例如EC 2.2.1.6下分类的乙酷乳酸合酶将丙酬酸转化为2-乙酷 乳酸。可W通过例如EC 1.1.1.86下分类的二径基异戊酸脱氨酶将2-乙酷乳酸转化为2,3-二径基异戊酸;接着通过例如EC 4.2.1.9下分类的2，3-二径基异戊酸脱水酶将2，3-二径基 异戊酸转化为2-氧代-异戊酸；接着通过W其亚基分类的支链脱氨酶复合物（例如在EC 1.2.4.4、EC 1.8.1.4和EC 2.3.1.168下)将2-氧代-异戊酸转化为异下酷基-CoA;接着通过 例如EC 1.3.8下分类的酷基-CoA脱氨酶，诸如EC 1.3.8.1下分类的短链酷基-CoA脱氨 酶，或EC 1.3.8.7下分类的中等链酷基-CoA脱氨酶，或者通过例如EC 1.3.99.12下分类的 2-甲基酷基-CoA脱氨酶将异下酷基-CoA转化为异下締酷基CoA;接着通过例如酷基-CoA水 解酶或例如EC 3.1.2下分类的硫醋酶，诸如yciA或tesB的基因产物或例如EC 2.8.3下 分类的CoA-转移酶，诸如例如EC 2.8.3.1下分类的丙酸CoA转移酶(参见例如，GenBank登录 号CAB77207.1下的转移酶，SEQ ID N0:4)将异下締酷基-CoA转化为异下締酸。
[0042] 培养策略
[0043] 在一些实施方案中，可W使用发酵策略在重组宿主中生物合成异下締酸盐，所述 发酵策略可W包括重组宿主的厌氧、微需氧或需氧培养。
[0044] 异下締酸盐合成中的途径需要维持低溶解氧浓度，同时维持足够氧转移W防止底 物氧化受控条件的微需氧策略，所述途径渗入需要分子氧的酶和体外表征为氧敏感性的酶 (Qiayabatra&Lu-Kwang,Appl.Environ.Microbiol.,2000,66(2),493 0 498)。