生产醇的好氧方法

生产醇的好氧方法
【专利摘要】反应混合物，其用于在好氧条件下从碳源生产乙醇和/或乙酸，其中所述混合物包含-处于指数生长期的第一产乙酸微生物；-游离氧；和-处于稳定期的第二产乙酸微生物其中所述第一和第二产乙酸微生物能够转化碳源为乙酸和/或乙醇。
【专利说明】生产醇的好氧方法 发明领域
[0001] 本发明涉及在好氧条件下从碳源生产醇包括高级醇的反应混合物和生物技术方 法。具体而言，所述混合物和方法涉及在氧气和年轻细胞存在的情况下生物技术生产至少 一种醇。
[0002] 发明背景 生产醇特别是乙醇的生物技术方法是本领域众所周知的。特别地，使用产乙酸菌在各 种碳源上来生产乙醇和/或乙酸是众所周知的。然而，在大部分情况下，生产乙醇仅能在不 存在氧气的情况下成功进行。这一现象至少被Brioukhanov, 2006，Imlay, 2006，Lan, 2013等所证实，其中显示产乙酸菌在好氧条件下无法成功生产乙醇。因此，在本领域已知的 目前方法中，包含氧气的碳底物诸如来自钢厂的废气首先处理以去除氧气，随后将其引入 产乙酸细胞以进行乙醇和/或乙酸生产。氧气分离步骤使得方法花费更高且耗时。此外，在 该分离步骤过程中可能存在原材料的一些损失。
[0003] 因此，本领域存在对在存在氧气的情况下生产乙醇和/或乙酸的方法的需要。乙醇 可随后用作用于生产高级碳化合物诸如醇、酸等的原材料。
[0004] 例如，丁醇和高级醇具有若干用途，包括用作燃料。例如，未来丁醇可代替汽油，因 为两种燃料的能量含量几乎相同。此外，当与乙醇比较时，丁醇作为替代染料具有若干其他 优秀的性质。这些包括丁醇具有更高的能量含量，丁醇比乙醇或汽油"挥发"更低，以及丁醇 相比于乙醇更易运输。由于这些原因及更多原因，已存在对丁醇和/或相关高级醇的现存有 潜力的市场。丁醇和其他高级醇还可用作工业溶剂。
[0005] 目前，丁醇和其他高级醇主要从石油制备。这些化合物通过裂解汽油或石油来获 得，这对于环境有害。而且，由于这些起始材料的成本将与石油价格关联，以及未来石油价 格的预期增长，因此丁醇和其他高级醇价格可能也会相对于石油价格的增长而增长。
[0006] 历史上(20世纪初至20世纪50年代），生物丁醇(biobutanol)在通常用某些产丁醇 细菌诸如丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)和拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii)的发酵方法中从玉米和糖蜜制备，所述发酵方法也产生丙酮和乙醇并且称 为ABE(丙酮、丁醇、乙醇)发酵。随着对绿色能源重新关注，该方法近来再次流行。然而，"玉 米淀粉丁醇生产"方法需要大量耗能步骤，包括农业玉米作物栽培，玉米粒收获，玉米粒淀 粉加工，和淀粉至糖至丁醇发酵。"玉米淀粉丁醇生产"方法还可能消耗与其产物丁醇的能 量值几乎一样多的能量。
[0007] Alfol ? Alcohol Process是用于使用有机错（organoaluminium)催化剂从乙稀 生产高级醇的方法。反应产生直链长链伯醇(C 2-C28)。该方法使用铝催化剂来将乙烯寡聚化 并允许产生的烷基被氧化。然而，该方法产生广谱的醇且维持分布模式。这一不变的模式限 制了生产者仅制备特定醇范围（其具有最高需求或具有最好的经济价值）的能力。而且，反 应中所需的气体必须非常清洁且对于反应成功进行需要不同的气体组成。
[0008] W02009100434还描述了从碳水化合物生产丁醇和己醇的间接方法。该方法包括同 型乙酸发酵来生产乙酸中间体，其随后化学转化为乙醇。乙醇和剩余部分的乙酸中间体随 后用作产酸发酵中的底物来产生丁酸和己酸中间体，其随后化学转化为丁醇或己醇。然而， 该方法使用昂贵的原材料碳水化合物并具有两个额外的处理步骤，酯类的形成和酯类的化 学氢化，其使得方法不仅更长而且还导致沿途有用材料的损失。
[0009] Perez，J.M.，2012公开在合成气存在的情况下使用扬氏梭菌（Clostridium 1 jungdahl i i )将短链羧酸转化为其对应醇的方法。然而，短链羧酸需要作为用于转化为对 应高级醇的底物被添加。
[0010] 因此，目前高级醇生产的可用方法具有在气体底物质量转移至发酵液中的限制、 较低的生产率和较低的终产物浓度，导致产物纯化更高的能源成本。
[0011]因此，除了完全基于石油或基于玉米的来源之外，还需要发现更多可持续的原材 料作为经生物技术方法生产丁醇和其他高级醇的起始材料，这也导致对环境更低破坏。具 体而言，存在对于简单且高效的从可持续原材料一罐(one-pot)生物技术生产丁醇和其他 高级醇的需求。
[0012]发明描述 本发明通过以下解决了上文提及的问题:提供通过引入处于指数/对数生长期的产乙 酸细胞至包含碳源和氧气的含水培养基在好氧条件下生产乙醇和高级醇的方法。处于指 数/对数生长期的这些产乙酸细胞的浓度通过本领域已知的任何方法来维持，条件是在含 水培养基中始终存在氧气。氧气可以以至少5ppm的浓度存在于含水培养基中。
[0013] 在本发明的一个方面，提供在好氧条件下从碳源生产乙醇和/或乙酸的反应混合 物，其中所述混合物包含 -处于指数生长期的第一产乙酸微生物； -游离氧;和 -处于指数期后的第二产乙酸微生物 其中所述第一和第二产乙酸微生物能够转化碳源为乙酸和/或乙醇。
[0014] 具体而言，处于指数期后的第二产乙酸微生物可处于细胞的稳定期。处于对数期 的产乙酸细胞允许含水培养基中的任何其他产乙酸细胞在氧气存在的情况下产生乙酸和/ 或乙醇。处于对数期的产乙酸细胞的浓度可以在反应混合物中维持。因此，在反应中的任何 时间点，反应混合物包含处于对数期的产乙酸细胞和处于另一生长期(例如处于稳定期）的 产乙酸细胞。
[0015] 技术人员将理解微生物的不同生长期和测量它们并鉴定它们的方法。具体而言， 批量培养物中的大多数微生物可发现于至少四个不同的生长期；即它们是:延滞期(A)、对 数期或指数期（B)、稳定期(C)和死亡期(D)。对数期可以进一步分为早对数期和中至晚对 数/指数期。稳定期还可以进一步区分为早稳定期和稳定期。例如，Cotter，J.L.，2009， Najafpour.G.，2006，Younesi, H.，2005，and K6pke, M.，2009公开了产乙酸菌的不 同生长期。具体而言，细胞的生长期可以使用至少Shuler ML, 1992 and Fuchs G.，2007 中教导的方法来测量。
[0016] 延滞期是接种细胞入新鲜培养基后紧接着的时期，种群暂时维持不变。尽管不存 在明显的细胞分裂，但细胞可以在体积或质量上增长，合成酶、蛋白、RNA等，并增加代谢活 性。延滞期的长度可取决于广泛的因素，包括接种物多少;从转移中的物理损伤或应激中恢 复所需的时间；合成必需的辅酶或分裂因子所需的时间；和合成新的（可诱导的）酶所需的 时间，所述酶对于代谢培养基中存在的底物是必需的。
[0017] 生长的指数(对数)期是平衡生长的模式，其中所有细胞通过二分裂规则分裂，并 以几何级数生长。取决于生长培养基的组成和孵育条件，细胞以恒定速率分裂。细菌培养物 的指数生长速率表示为世代时间，也称为细菌群体的倍增时间。世代时间(G)定义为每代(n =代数）的时间（t)。因此，G=t/n为从其推导世代时间计算的公式。指数期可以进一步分为 (i)早对数期和(ii)中至晚对数/指数期。技术人员可以容易地鉴定何时微生物特别是产乙 酸菌进入对数期。例如，计算产乙酸菌的生长速率以确定它们是否处于对数期的方法可以 使用至少Henstra A.M.，2007中教导的方法来完成。具体而言，根据本发明的任何方面的 处于指数生长期的微生物可包括处于早对数期以及中至晚对数/指数期的细胞。
[0018] 稳定期是这样的时期，其中指数生长结束，因为指数生长无法在批量培养物（例 如，封闭系统诸如试管或烧瓶）中永远持续。种群生长受限于三个因素之一 ：1.可用营养物 的耗尽;2.抑制性代谢物或终产物的积累;3.空间耗尽，在这种情况下称为"生物空间"的缺 乏。在稳定期过程中，如果计数活细胞，无法确定是否一些细胞死亡且相等数目的细胞正在 分裂，或者细胞群体只是已停止生长和分裂。稳定期，如同延滞期，不必须是静止阶段。生产 次级代谢物诸如抗生素的细菌在生长周期的稳定期过程中这样做(次级代谢物定义为生长 活跃期后产生的代谢物）。
[0019]稳定期后是死亡期。在死亡期，活细胞的数目呈几何(指数)降低，基本上是对数期 过程中生长的逆转。
[0020] 在一个实例中，其中〇2存在于根据本发明的任何方面的反应混合物中，第一产乙 酸菌可以处于指数生长期且其他产乙酸菌可处于产乙酸菌的生命周期的任何其他生长期。 具体而言，根据本发明的任何方面，反应混合物中的产乙酸菌可以包含处于指数生长期的 一种产乙酸菌和处于稳定期的另一种产乙酸菌。在存在氧气且不存在处于指数生长的产乙 酸菌的情况下，处于稳定期的产乙酸菌可能不能产生乙酸和/或乙醇。这一现象至少被 Brioukhanov, 2006，Imlay, 2006，Lan, 2013等所证实。因此，本发明人令人惊奇地发现 在存在处于指数生长的产乙酸菌的情况下，处于任何生长期的产乙酸菌可以好氧呼吸并以 多于或等于当不存在氧气时反应混合物产生的量来产生乙酸和/或乙醇。在一个实例中，处 于指数生长期的产乙酸菌可以能够从反应混合物去除游离氧，为处于任何生长期的产乙酸 菌提供合适的环境(无游离氧）以代谢碳底物以产生乙酸和/或乙醇。
[0021] 在另一实例中，含水培养基在存在碳源的情况下可以已经包含处于任何生长期的 产乙酸菌，特别是处于稳定期的产乙酸菌。在该实例中，在供应至含水培养基的碳源中或含 水培养基自身中可以存在氧气。在存在氧气的情况下，产乙酸菌可以是无活性的并且在添 加处于指数生长期的产乙酸菌之前不产生乙酸和/或乙醇。在这一实例中，处于指数生长期 的产乙酸菌可以添加至含水培养基中。在含水培养基中已发现的无活性的产乙酸菌可以随 后被活化并可以开始生产乙酸和/或乙醇。
[0022] 在进一步的实例中，处于任何生长期的产乙酸菌可以首先与处于指数生长期的产 乙酸菌并随后与添加的碳源和/或氧气混合。
[0023] 根据本发明的任何方面，在存在氧气的情况下生长的处于指数生长期的微生物可 以导致微生物在氧气存在的情况下获得适应以生长和代谢。具体而言，微生物可以能够从 微生物周围的环境中去除氧气。这种新获得的适应允许处于指数生长期的产乙酸菌清除氧 环境并因此从碳源产生乙酸和乙醇。具体而言，具有新获得的适应的产乙酸菌允许细菌转 化碳源为乙酸和/或乙醇。
[0024] 在一个实例中，根据本发明的任何方面的反应混合物中的产乙酸菌可以包含细胞 的组合:处于对数期的细胞和处于稳定期的细胞。在根据本发明的任何方面的方法中，处于 对数期的产乙酸菌细胞可以包含选自0.01-2 h-^0.01-1 h-^0.05-1 h-^0.05-2 h-1、 0.05-0.5 IT1等的生长速率。在一个实例中，反应混合物中对数期产乙酸细胞的细胞的OD600 可以选自范围0.001-2、0.01-2、0.1-1、0.1-0.5等。技术人员将能够使用本领域已知的任 何方法来测量0D6QQ并测定反应混合物中的和/或待添加至反应混合物中的细胞的生长速 率。例如，可以使用Koch (1994)。具体而言，细菌生长可以使用不同方法来测定和监测。最 常用的之一是浊度测量，其依赖于悬浮液中细菌的光密度(0D)并使用分光光度计。0D可以 使用UV分光计在600 nm处测量。
[0025] 为了维持反应混合物中第一和第二产乙酸菌的浓度，技术人员可以能够在固定时 间点提取样品来测量〇D6Q()、pH、氧浓度和形成的乙醇和/或高级醇的浓度。技术人员将能够 添加一种或多种必需组分以维持反应混合物中第一和第二产乙酸菌的浓度并确保对于生 产乙醇和/或乙酸维持最佳环境。
[0026]如本文所用的术语"产乙酸菌"指这样的微生物，其能够进行Wood-Ljungdahl途径 并因此能够转化⑶、C02和/或氢气为乙酸。这些微生物包括其野生型形式不具有Wood-Ljungdahl途径但作为遗传修饰的结果已获得该性状的微生物。此类微生物包括但不限于 大肠杆菌细胞。这些微生物还称为一氧化碳营养菌。目前，本领域已知产乙酸菌的21个不同 的属(Drake等人，2006)，且这些还可包括一些梭菌(Drake & Kusel，2005)。这些细菌能 够使用二氧化碳或一氧化碳作为碳源和氢气作为能源(Wood，1991)。此外，醇、醛、羧酸以 及许多己糖也可用作碳源(Drake等人，2004)。导致形成乙酸的还原途径称为乙酰辅酶A 或 Wood-Ljungdahl 途径。
[0027] 具体而言，产乙酸菌可选自潮湿厌氧醋菌（Acetoanaerobium notera) (ATCC 35199)、长醋丝菌（Acetonema longum) (DSM 6540)、甲醇醋酸杆菌（Acetobacterium carbinolicum)(DSM 2925)、苹果酸醋酸杆菌（Acetobacterium malicum (DSM 4132))、醋 酸杆菌属第446号种（Acetobacterium species no. 446)(Morinaga 等人，1990，J. Biotechnol.，Vol. 14，p. 187-194)、威氏醋酸杆菌（Acetobacterium wieringae)(DSM 1911)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii) (DSM 1030)、Alkalibaculum bacchi(DSM 22112)、闪烁古生球菌（Archaeoglobus fulgidus) (DSM 4304)、（Blautia producta) (DSM 2950，之前的产生瘤胃球菌（Ruminococcus productus),之前的 Peptostreptococcus productus)、食甲基丁 酉爱杆菌（Butyribacterium methylotrophicum) (DSM 3468)、醋酸梭菌（Clostridium aceticum) (DSM 1496)、产乙醇 梭菌（Clostridium autoethanogenum) (DSM 10061、DSM 19630和DSM 23693)、 Clostridium carboxidivorans(DSM 15243)、Clostridium coskatii (ATCC编号 PTA-10522 )、Clostridium drakei(ATCC BA-623 )、蚁酸醋酸梭菌（Clostridium formicoaceticum) (DSM 92)、乙二醇梭菌（Clostridium glycolicum) (DSM 1288)、扬氏 梭菌（Clostridium ljungdahlii) (DSM 13528)、扬氏梭菌C-01 (ATCC 55988)、扬氏梭菌 ERI-2(ATCC 55380)、扬氏梭菌0-52(ATCC 55989)、马犹姆贝梭菌（Clostridium mayombei) (DSM 6539)、Clostridium methoxybenzovorans (DSM 12182)、Clostridium ragsdalei (DSM 15248)、粪味梭菌（Clostridium scatologenes) (DSM 757)、梭菌属种ATCC 29797 (Schmidt 等人，1986，Chem. Eng. Commun.，Vol. 45，p. 61-73)、库氏脱硫肠状菌 (Desulfotomaculum kuznetsovii) (DSM 6115)、热苯脱硫肠状菌thermosyntrophicum亚 种（Desulfotomaculum thermobezoicum subsp. thermosyntrophicum) (DSM 14055)、粘 液真杆菌（Eubacterium limosum) (DSM 20543)、乙酸甲烧八叠球菌（Methanosarcina acetivorans)C2A (DSM 2834)、穆尔氏菌属种HUC22-l(Moorella sp. HUC22-1) (Sakai 等人，2004，Biotechnol. Let.，Vol. 29，p. 1607-1612)、热醋穆尔氏菌（Moorella thermoacetica) (DSM 521，之前的Clostridium thermoaceticum)、热自养穆尔氏菌 (Moorella thermoautotrophica) (DSM 1974)、0xobacter pfennigii (DSM 322)、 Sporomusa aerivorans (DSM I3326)、卵形鼠抱菌（Sporomusa ovata)(DSM 2662)、 Sporomusa silvacetica (DSM 10669)、球形鼠抱菌（Sporomusa sphaeroides) (DSM 2875)、白蚁鼠抱菌（Sporomusa termitida) (DSM 4440)和凯伍热厌氧菌 (Thermoanaerobacter kivui)(DSM 2030，之前的凯伍产醋菌（Acetogenium kivui))。更 具体而言，可以使用Clostridium carboxidivorans的菌株ATCC BAA-624。甚至更具体而 言，可以使用例如描述于U. S. 2007/0275447和U.S. 2008/0057554的Clostridium carboxidivorans的标记为"P7"和"PI 1"的细菌菌株。
[0028]另一特别合适的细菌可以是扬氏梭菌。具体而言，可以使用选自扬氏梭菌PETC、扬 氏梭菌ERI2、扬氏梭菌C0L和扬氏梭菌0-52的菌株来转化合成气为己酸。这些菌株例如描述 于TO 98/00558、W0 00/68407、ATCC 49587、ATCC 55988 和ATCC 55989。根据本发明的任何 方面使用的第一和第二产乙酸菌可以是相同或不同的细菌。例如，在一种反应混合物中，第 一产乙酸菌可以是处于对数期的扬氏梭菌且第二产乙酸菌可以是处于稳定期的扬氏梭菌。 在另一实例中，在反应混合物中，第一产乙酸菌可以是处于对数期的扬氏梭菌且第二产乙 酸菌可以是处于稳定期的Clostridium carboxidivorans。在另一实例中，第一生物所选的 产乙酸菌可以是产乙醇梭菌。
[0029] 在根据本发明的任何方面的反应混合物中，可以存在氧气。有利的是将02掺入反 应混合物中和/或作为包括合成气的最多废气供应于反应混合物的气流包含少量或大量的 氧气。在使用合成气作为碳源用于生产高级醇之前去除该氧气是困难且昂贵的。根据本发 明的任何方面的方法允许生产至少一种高级醇而无需首先从碳源中去除任何痕量的氧气。 这允许节约时间和金钱。
[0030] 更具体而言，气流中的〇2浓度可以以小于气流中的气体总量的1体积％存在。具体 而言，氧气可以以0.000005-2体积％的浓度范围存在，以以下范围存在:0.00005-2体积％、 0.0005-2体积％、0.005-2体积％、0.05-2体积％、0.00005-1.5体积％、0.0005-1.5体积％、 0 ? 005-1 ? 5体积％、0 ? 05-1 ? 5体积％、0 ? 5-1 ? 5体积％、0 ? 00005-1体积％、0 ? 0005-1 体积％、 0.005-1体积％、0.05-1体积％、0.5-1体积％、0.55-1体积％、0.60-1体积％、特别是以 0.60-1.5体积％、0.65-1体积％、和0.70-1体积％的范围存在。具体而言，当气相/气流中0 2 的比例相对于气流中气体的体积为约0.00005、0.0005、0.005、0.05、0.15、0.5、0.6、0.7、 0.8、0.9、1、1.5、2体积％时，产乙酸微生物是特别合适的。技术人员将能够使用本领域已知 的任一种方法来测量气流中氧气的体积浓度。具体而言，氧气的体积可以使用本领域已知 的任何方法来测量。在一个实例中，氧气的气相浓度可以通过来自PreSens Precision Sensing GmbH的痕量氧气浸入探头(dipping probe)来测量。氧气浓度可以通过焚光猝灭 来测量，其中猝灭程度与气相中氧分压相关。甚至更具体而言，根据本发明的任何方面的第 一和第二微生物当氧气通过气流以低于供应于反应混合物的气流中的总气体的1体积％的 氧气浓度、以供应于反应混合物的气流中的气体总体积的约0.015体积％供应时，能够在含 水培养基中最佳工作。
[0031]根据本发明的任何方面，在反应混合物中将碳源转化为乙醇和/或乙酸的好氧条 件指反应混合物周围的气体。气体可以包含至少1体积％总气体的氧气和包括碳源诸如C0、 C〇2等的其他气体。
[0032]根据本发明的任何方面的含水培养基可以包含氧气。氧气可以通过本领域已知的 任何方式溶解于培养基中。具体而言，氧气可以在不存在细胞的情况下以〇.5mg/L存在。具 体而言，含水培养基中游离氧的溶解浓度可以为至少0.01 mg/L。在另一实例中，溶解氧可以 为约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.511^/1。具体而言，溶解氧浓度可以 为0.01-0.5mg/L、0.01-0.4mg/L、0.01-0.3mg/L、0.01-0 .lmg/L。具体而言，氧气可以以持续 气流提供于含水培养基。更具体而言，含水培养基可以包含氧气和含有C0和/或C〇2的碳源。 更具体而言，氧气和含有C0和/或C0 2的碳源以连续气流提供于含水培养基。甚至更具体而 言，连续气流包含合成气和氧气。在一个实例中，两种气体为相同的流(flow/stream)的部 分。在另一实例中，每一气体为提供于含水培养基的分开的流(flow/stream)。这些气体可 以分开，例如使用单独的开口在含水培养基内的喷嘴、熔料(fri t )、在供应气体至含水培养 基的管内的膜等。氧气可以为游离氧。根据本发明的任何方面，'包含游离氧的反应混合物' 指包含以〇 2形式的元素氧的反应混合物。〇2可以为反应混合物中的溶解氧。具体而言，溶解 氧可以为2 5ppm (0.000005体积％; 5xl(T6)的浓度。技术人员能够使用本领域已知的任何 方法来测量溶解氧的浓度。在一个实例中，溶解氧可以通过氧气浸入探头(Type PSt6,来自 PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Germany)来测量。
[0033]根据本发明的任何方面，反应混合物进一步包含 _能够进行乙醇羧酸发酵途径并转化乙酸和/或乙醇形成酸的第三微生物;和 其中所述第一和/或第二产乙酸微生物能够转化酸为相应的高级醇。
[0034]在一个实例中，产乙酸菌可以与第二微生物联合使用，所述第二微生物可以能够 进行乙醇-羧酸发酵途径。在一个实例中，可以使用第一和第二产乙酸菌两者以及可以能够 进行乙醇-羧酸发酵途径的第三微生物来从碳源产生高级酸。酸可以随后转化为选自以下 相应的高级醇:丁醇、戊醇、己醇、辛醇、壬醇、癸醇等。在一个实例中，高级醇可以选自1-丁 醇、2-甲基-1-丁醇、异丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、1-辛醇、1-戊醇、1-庚醇、3-甲基-1-戊 醇、4-甲基-1-己醇、5-甲基-1-庚醇、4-甲基-1-戊醇、5-甲基-1-己醇、6-甲基-1-庚醇及其 组合。
[0035]在一个实例中，乙醇和/或乙酸可以在存在能够进行乙醇-羧酸发酵途径的第三微 生物的情况下转化为相应的高级酸。乙醇-羧酸发酵途径详细描述于至少Seedorf，H.，等 人，2008。具体而言，第三生物可以选自克氏梭菌（Clostridium kluyveri)、 C.Carboxidivorans等。这些第三微生物包括其野生型形式不具有乙醇-羧酸发酵途径但作 为遗传修饰的结果已获得该性状的微生物。具体而言，第三微生物可以是克氏梭菌。
[0036] 在另一实例中，第三微生物可以是野生型生物，其表达选自￡1至￡11的至少一种酶， 其中为Ei醇脱氢酶(adh)，E 2为乙醛脱氢酶(ald)，E3为乙酰乙酰-CoA硫解酶(thl)，E4为3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶(hbd) 45为3_羟基丁酰基-CoA脱水酶(crt)，E6为丁酰基-CoA脱氢酶 (bed)，E7为电子转移黄素蛋白亚基(etf )，E8为辅酶A转移酶(cat)，Eg为乙酸激酶(ack)，Eio 为磷酸转乙酰酶(pta)且En为转氢酶。具体而言，根据本发明的任何方面的野生型第三微生 物可以表达至少E 2、E3和E4。甚至更具体而言，根据本发明的任何方面的野生型第三微生物 可以表达至少E 4。
[0037] 在另一实例中，根据本发明的任何方面的第三微生物可以是遗传修饰生物，其相 对于野生型微生物具有选自￡1至￡ 11的至少一种酶的增加的表达，其中为Ei醇脱氢酶 (adh)，E2为乙醛脱氢酶(ald)，E 3为乙酰乙酰-CoA硫解酶（thl)，E4为3-羟基丁酰基-CoA脱 氢酶(hbd) 45为3_羟基丁酰基-CoA脱水酶(ert)，E6为丁酰基-CoA脱氢酶(bed)，E7为电子转 移黄素蛋白亚基（etf)，E 8为辅酶A转移酶(cat)，E9为乙酸激酶(ack)，E1Q为磷酸转乙酰酶 (pta)且En为转氢酶。具体而言，根据本发明的任何方面的遗传修饰的第三微生物可以表达 至少酶E 2、E3和E4。甚至更具体而言，根据本发明的任何方面的遗传修饰的第三微生物可以 表达至少E 4。酶￡1至￡11可以分离自克氏梭菌。技术人员可以能够使用本领域已知的方法来 测量这些酶的每一种的活性。具体而言，酶活性可以使用至少在Hillmer P.， 1972，Lurz R.，1979中教导的测定法来测量;E2酶的活性也可以使用Smith L.T.，1980 中教导的测定法来测量，酶E3和E4的活性可以使用至少Sliwkowski M.X.，1984中教导的 测定法来测量;E4的活性还可以使用Madan，V.K.，1972中教导的测定法来测量;E5的活性 也可以使用Bartsch，R.G.，1961中教导的测定法来测量;酶E6和E7的活性可以使用Li， F.，2008中教导的测定法来测量;E7的活性还可以使用Chowdhury，2013中教导的测定法 来测量;E8的活性可以使用Stadman，1953中教导的测定法来测量;E9的活性可以使用 Winzer，K.，1997中教导的测定法来测量;E10的活性可以使用Smith L.T.，1976中教导 的测定法来测量;且E11的活性可以使用Wang S，2010中教导的测定法来测量。
[0038] 根据本发明的任何方面，第二和/或第三微生物可以是遗传修饰的微生物。遗传修 饰的细胞或微生物可以在基因上与野生型细胞或微生物不同。根据本发明的任何方面的遗 传修饰的微生物与野生型微生物之间的遗传差异可以在于遗传修饰的微生物中存在完整 基因、氨基酸、核苷酸等，其在野生型微生物中可能不存在。在一个实例中，根据本发明的任 何方面的遗传修饰的微生物可以包含能够使微生物产生至少一种羧酸的酶。相对于根据本 发明的任何方面的遗传修饰的微生物，野生型微生物可以不具有或者无可检测的能够使遗 传修饰的微生物产生至少一种羧酸的酶的活性。如本文所用，术语'遗传修饰的微生物'可 以与术语'遗传修饰的细胞'互换使用。根据本发明的任何方面的遗传修饰可以对微生物的 细胞进行。
[0039] 如本文中与细胞或微生物联合使用的短语"野生型"可指具有处于自然环境中天 然可见的形式的基因组构成的细胞。该术语可以适用于完整细胞或单个基因。因此，术语 "野生型"不包括这样的细胞或这样的基因，其中基因序列已由人使用重组方法至少部分改 变。
[0040] 技术人员将能够使用本领域已知的任何方法来遗传修饰细胞或微生物。根据本发 明的任何方面，遗传修饰的细胞可以被遗传修饰，使得在定义的时间间隔中，在2小时内，特 别是在8小时或24小时内，其相比野生型细胞产生至少2倍、尤其是至少10倍、至少100倍、至 少1000倍或至少10000倍的羧酸和/或各羧酸酯。产物形成中的增加可以例如通过在合适的 营养培养基中在相同条件下（相同的细胞密度、相同的营养培养基、相同的培养条件)分别 各自培养根据本发明的任何方面的细胞和野生型细胞持续特定的时间间隔并随后测定营 养培养基中目标产物(羧酸)的量来确定。
[0041] 在另一实例中，酸可以从碳源产生，其通过公开于Steinbusch, 2011，Zhang, 2013, Van Eerten-Jansen, M. C. A. A, 2013, Ding H. et al, 2010, Barker H.A., 1949, Stadtman E.R., 1950, Bornstein B. T.,等人，1948等的任何方法。甚至更具体 而言，酸可以在克氏梭菌存在的情况下从碳源产生。
[0042]甚至更具体而言，根据本发明的任何方面，酸在处于两种不同生长期的至少一种 产乙酸微生物以及克氏梭菌的存在的情况下产生。在一个实例中，产乙酸微生物可以是扬 氏梭菌或拉格斯代尔梭菌(Clostridium ragsdahlei)。新形成的酸在醇存在的情况下可以 转化为对应的高级醇。选自克氏梭菌和C.Carboxidivorans的第三微生物可以转化乙酸和/ 或乙醇以形成新形成的酸。如之前所提及，对于该方法有利的是在〇 2存在的情况下进行 (即，在反应混合物中包括〇2)，因为大部分包括合成气的废气包含少量或大量的氧气。该反 应混合物允许从废气生产高级醇的方法，而不需要经历首先抽取氧气的额外昂贵步骤。 [0043]反应混合物可以包含以均质混合物的两种/三种微生物。如本文所用的术语"均质 混合物"指微生物空间上均匀地分布于培养基中的混合物。具体而言，混合物可以包含至少 两种微生物，均匀分布于含水培养基中的处于不同生长期的两种产乙酸微生物。在一个实 例中，混合物中可以存在大约相同数目的两种微生物。在另一个实例中，混合物中可以存在 相比于处于对数期的产乙酸微生物更多的处于稳定期的产乙酸微生物。在仍另一个实例 中，混合物中可以存在相比于处于稳定期的产乙酸微生物更多的处于对数期的产乙酸微生 物。在所有可能的实例中，微生物处于单一的均质混合物中，其中它们均匀地分布于混合物 中。如本文所用的"含水培养基"可与术语"反应混合物"互换使用。
[0044]如本文所用的术语"乙酸(acetate)"指乙酸及其盐两者，这是不可避免的结果，因 为如本领域已知，由于微生物在含水环境中活动，因此始终存在所存在的盐和酸之间的平 衡。
[0045]术语"第二微生物"或"第三微生物"指与根据本发明的任何方面的"第一微生物" 不同的微生物。
[0046]在一个实例中，第一和第二微生物可以存在于第一发酵罐中而第三微生物可存在 于第二发酵罐中。在发酵罐1中，第一和第二微生物与碳源接触以产生乙酸和/或乙醇。乙醇 和/或乙酸可以随后与发酵罐2中的第三微生物接触以产生至少一种酸。该酸可随后给料回 发酵罐1以产生至少一种醇。可以产生这样的循环，其中发酵罐1中产生的乙酸和/或乙醇可 以定期给料至发酵罐2,发酵罐2中的乙酸和/或乙醇可以转化为至少一种酸且发酵罐2中的 酸给料回发酵罐1。
[0047]类似地，在发酵罐1中，第一和第二微生物可以与包含⑶的碳源接触以产生乙酸 和/或乙醇。乙醇和/或乙酸可以随后与发酵罐2中的第三微生物接触以产生至少一种酸。酸 随后任选地提取并给料回发酵罐1以转化酸为期望的高级醇。可以产生这样的循环，其中发 酵罐1中产生的乙酸和/或乙醇可以定期给料至发酵罐2,发酵罐2中的乙酸和/或乙醇可以 转化为至少一种酸且发酵罐2中的酸给料回发酵罐1。给料至发酵罐1的CO可以与乙酸和/或 乙醇一同转移至发酵罐2。可以不需要特定的提取方法，因为已令人惊讶地发现第三微生物 在C0存在的情况下转化乙酸和/或乙醇为至少一种酸。
[0048]在另一实例中，培养基在发酵罐1和2之间循环。因此，发酵罐1中产生的乙醇和/或 乙酸可以给料至发酵罐2且发酵罐2中产生的酸可以给料回发酵罐1。在循环培养基的方法 中，来自发酵罐1的C0可以引入发酵罐2中。而且，发酵罐2中产生的酸可以随后重新引入发 酵罐1中。发酵罐2中的第三微生物可以能够持续在从发酵罐1循环至发酵罐2的C0存在的情 况下从乙酸和乙醇产生酸。发酵罐1和2中积累的醇可随后通过本领域已知的方法提取。 [0049]在进一步的实例中，可以存在三个容器来进行根据本发明的任何方面的方法。第 一和第二微生物可以存在于第一发酵罐中，第三微生物在第二发酵罐中，且第三发酵罐中 为第一和第二微生物。在发酵罐1中，第一和第二微生物与碳源接触以产生乙酸和/或乙醇。 乙醇和/或乙酸可以随后与发酵罐2中的第三微生物接触以产生至少一种酸。该酸可随后给 料至发酵罐3以产生至少一种醇。
[0050] 在从碳源产生酸和/或高级醇中，可以使用细菌的组合。可以存在多于一种产乙酸 菌与一种或多种第三微生物的组合。在另一实例中，可以存在多于一种类型的产乙酸菌和 仅一种类型的第三微生物。在仍另一实例中，可以存在多于一种第三微生物与仅一种产乙 酸菌的组合。
[0051] 如本文所有的术语"约"指20%内的变化。具体而言，如本文所用的术语"约"指给 定测量值或值的+/- 20%，更具体而言为+/- 10%，甚至更具体而言为+/- 5%。
[0052] 除非另有说明，所有百分比（％)均为体积百分比。
[0053] 根据本发明的任何方面所用的碳源包括二氧化碳和/或一氧化碳。技术人员将理 解存在许多可能的提供C0和/或C02的来源作为碳源。可见，实际上，作为根据本发明的任何 方面的碳源，可以使用能够为微生物供应足量的碳的任何气体或任何气体混合物，使得乙 酸和/或乙醇可以从C0和/或C0 2的来源的形成。
[0054] 通常，对于根据本发明的任何方面的混合的培养物，碳源包含至少50体积％、至少 70体积％、尤其是至少90体积％的0)和/或C0 2,其中体积百分比-%涉及混合的培养物中第 一微生物可用的所有碳源。
[0055] 在根据本发明的任何方面的混合的培养物中，可以提供碳材料来源。气体形式的 碳源的实例包括废气诸如合成气、烟道气和酵母发酵或梭菌发酵产生的石油炼厂气 (petroleum refinery gas)。这些废气从含纤维素的材料的气化或煤气化形成。在一个实 例中，这些废气可以不一定作为其他方法的副产物产生但可以特别产生以与根据本发明的 任何方面的混合的培养物一起使用。
[0056] 根据本发明的任何方面，碳源可以是合成气。合成气可以例如作为煤气化的副产 物产生。因此，根据本发明的任何方面的混合的培养物的微生物可以能够转化作为废产物 的物质为有价值的资源。在另一实例中，合成气可以是广泛可得的、低成本的农业原材料气 化的副产物，以与本发明的混合的培养物一起使用来产生至少乙醇和/或一种高级醇。
[0057] 存在可以转化为合成气的很多原材料的实例，因为几乎所有形式的植被都可以用 于该目的。具体而言，原材料选自多年生牧草诸如芒草、玉米残渣、加工废料诸如锯肩等。
[0058] 通常，合成气可以在干燥的生物质的气化装置中获得，主要经热解、部分氧化和蒸 气重整，其中合成气的主要产物为CO、H2和0)2。合成气（Syngas)也可以是C0 2电解的产物。 技术人员将理解进行C02电解以产生包含期望量的C0的合成气的合适条件。
[0059]通常，获自气化方法的一部分合成气首先处理以优化产品产率并避免形成焦油。 合成气中不希望的焦油和C0的裂解可以使用石灰和/或白云石来进行。这些方法详细描述 于例如 Reed, 1981。
[0060] 来源的混合物可以用作碳源。
[0061] 根据本发明的任何方面，还原剂例如氢气可以与碳源一起供应。具体而言，当供应 和/或使用C和/或C02时，可以供应该氢气。在一个实例中，氢气是根据本发明的任何方面存 在的合成气的部分。在另一实例中，当合成气中的氢气对于本发明的方法不足时，可以供应 额外的氢气。
[0062] 技术人员将理解进行根据本发明的任何方面的方法所需的其他条件。具体而言， 容器(发酵罐）中的条件可以根据所用的第一和第二微生物而不同。适合于微生物行使最佳 功能的条件的改变在技术人员的知识内。
[0063]在一个实例中，根据本发明的任何方面的方法可以在pH为5_8、5.5-7的含水培养 基中进行。压力可以为1至10巴(bar)。
[0064]本发明的优点可以是可以使用多得多的原材料的有利的C02/C0混合物。这些各种 来源包括天然气、生物气、煤、油、植物残渣等。方法的另一优点可以是高碳产率。这通过返 回形成的C02而变得可能。即，C0 2可以在第一阶段中反应回到乙酸。
[0065]另一优点可在于关于所用的发酵条件更大的灵活性，因为任何产乙酸微生物和能 够进行乙醇-羧酸发酵途径的任何微生物可以组合使用用于实际生产高级醇。本发明的另 一优点可以是第三微生物在C0存在的情况下可以行使功能和/或从乙酸和/或乙醇生产酸， 第一、第二和第三微生物均可以存在于均质混合物中用于从包含C0的碳源生产高级醇。第 三微生物的该特点使得从碳源如C0生产高级醇成为一步方法，使得方法更有效且产率更 高。令人惊奇地，由于第三微生物的这一优点，制备高级醇的一步程序可以在单一发酵罐中 进行而无中间分离步骤。使用该一步程序还可以增加终产物的浓度。这是令人惊讶的，因为 Baffert C.，2011 and Thauer, R.K., 1973均教导氢化酶在C0存在的情况下被抑制。对 于这一原因和更多原因，W02013/167663包括了在(a)在产乙酸生物存在的情况下从⑶和/ 或C0 2形成乙酸和/或乙醇的步骤与(b)在第二微生物存在的情况下形成包含至少一个氧原 子的烃(例如，己酸)步骤之间的分离步骤。在根据本发明的任何方面从C0在一罐合成中产 生醇尤其是包含至少6个碳原子的醇的能力因此是令人惊讶的结果。在任何情况下，即使步 骤(a)和(b)在两个分开的步骤(即两个不同容器）中进行，可能不存在对于去除所有痕量的 C0以使第一和第三微生物行使功能的任何特定提取步骤的需要。
[0066] 如实例中可见，存在C0允许在根据本发明的任何方面的方法(其中碳源至少包含 C0)中产生至少丁醇和己醇。
[0067] 根据本发明的任何方面，碳源包含⑶。包含⑶的碳源在存在至少第一和第二产乙 酸微生物和能够在好氧条件下进行乙醇-羧酸发酵途径的第三微生物的情况下可以转化为 至少一种酸。具体而言，酸可包含4个或更多个碳原子。更具体而言，形成的酸可以选自丁 酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸等。具体而言，包含C0的碳源在第一和第二产乙酸菌 存在的情况下可以导致产生乙醇和/或乙酸。
[0068] 具体而言，C0可以在持续气流中提供于含水培养基。气流中的C0浓度可以以气流 中气体总量体积的至少2体积％存在。具体而言，C0可以以2-99体积％的浓度范围存在，以 2-95体积％、5-95体积％、10-90体积％、15-85体积％的范围，特别是20-80体积％的范围存 在。更具体而言，C0的浓度可以为约24体积％。碳源中一氧化碳的气相浓度可以使用具有热 电导检测器的Agilent Technologies Inc.的至少气相色谱GC 6890N来测量。
[0069] 具体而言，含水培养基可以包含含有C0和/或C02的碳源。更具体而言，含有C0和/ 或C02的碳源在连续气流中提供于含水培养基。甚至更具体而言，连续气流包含合成气。在 一个实例中，气体为相同的流(flow/stream)的部分。在另一实例中，每一气体为提供于含 水培养基的分开的流(f 1 ow/strearn)。这些气体可以例如使用单独的开口在含水培养基内 的喷嘴、熔料(frit)、在供应气体至含水培养基的管内的膜。
[0070] 在根据本发明的任何方面的一个实例中，碳源为合成气且碳源可以与氧气掺合， 随后供应至含水培养基。该掺合步骤可以改善效率和反应中高级醇的产生。本发明的方法 的总体效率、醇生产率和/或总体碳捕获可以取决于连续气流中〇) 2、〇)、出和02的化学计量。 施加的连续气流可以组成为〇2、C〇2和H2。具体而言，在连续气流中，0 2的浓度范围可以在 0.000005体积%至1体积％，⑶/C02为约10-50体积％，尤其是33体积％，且H 2将在44体积％至 84体积％，尤其64-66.04体积％。更具体而言，连续气流中气体浓度可以为0.15体积％的 〇 2，32体积％的0)/0)2和64体积％的出。在另一实例中，连续气流还可以包含惰性气体如N2， 高至50体积％的他浓度。
[0071] 技术人员将理解可能必须以相关间隔检测流的组成和流速。控制流的组成可以通 过改变组分流的比例以实现目标或期望的组成。掺合的流的组成和流速可以通过本领域已 知的任何方法来监测。在一个实例中，系统适合于持续监测至少两种流的流速和组成并将 它们组合以产生最佳组成的持续气流中的单一掺合底物流，和将最佳底物流传送至根据本 发明的任何方面的混合培养物的方法。
[0072] 具体而言，根据本发明的任何方面的反应混合物（即第一微生物一处于对数期的 产乙酸生物、第二微生物一处于稳定期的产乙酸生物、在存在氧气的情况下的碳源)可以在 任何已知的生物反应器或发酵罐中利用来进行本发明的任何方面。反应混合物可以进一步 包含第三微生物以导致发酵罐中产生高级醇。
[0073] 如本文所用的'高级醇'指含有4-10个碳原子的醇并可以是稍微粘性的或油状的， 并具有较重的水果香味。高级醇可以包括但不限于丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇 等。更具体而言，高级醇可以选自1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、异丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、 1-辛醇、1-戊醇、1-庚醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇、5-甲基-1-庚醇、4-甲基-1-戊醇、 5-甲基-1-己醇、6-甲基-1-庚醇及其组合。
[0074] 根据本发明的任何方面，'相应的高级醇'指具有与相应高级醇从中形成的酸相同 数目的碳原子的醇。例如，丁酸可以转化为相应的醇一丁醇；己酸可以转化为相应的醇一己 醇;庚酸可以转化为相应的醇一庚醇;辛酸可以转化为相应的醇一辛醇;壬酸可以转化为相 应的醇一壬醇;癸酸可以转化为相应的醇一癸醇等等。
[0075] 根据本发明的任何方面的方法可以进一步包括提取产生的高级醇的步骤。基于本 领域已知的方法，技术人员将知晓这样做的手段。
[0076]根据本发明的另一个方面，在好氧条件下从碳源生产乙醇和/或乙酸的方法，所述 方法包括 (a)接触反应混合物，所述反应混合物包含 一处于指数生长期的第一产乙酸微生物； 一游离氧;和 一处于稳定期的第二产乙酸微生物 其中所述第一和第二产乙酸微生物能够转化碳源为乙酸和/或乙醇。
[0077]根据本发明的另一个方面，在好氧条件下从碳源生产至少一种高级醇的方法，所 述方法包括 (a)在好氧条件下使根据本发明的任何方面的反应混合物与碳源接触。
[0078] 附图简述 无附图。 实施例
[0079] 上文描述了优选的实施方案，如本领域技术人员所理解的，其可以进行设计、构建 或操作上的改变和变化，而不偏离权利要求书的范围。这些改变例如旨在被权利要求书的 范围所覆盖。
[0080] 实施例1 用扬氏梭菌从无氧气的合成气生产乙酸和乙醇 在该实施例中，将扬氏梭菌在复合培养基中与合成气（由出和〇)2组成)在不存在氧气 的情况下厌氧培养以产生乙酸和乙醇。对于扬氏梭菌的细胞培养，将2 mL的冷冻培养物 (Cryoculture)在具有约400 mg/L L-盐酸半脫氛酸和400 mg/L Na〗S x 9 H2O的200 ml培 养基(ATCC1754培养基：pH 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L酵母提取物，0.8 g/L NaCl，1 g/L NH4CI，0.1 g/L KC1, 0.1 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgS〇4 x 7 H20; 0.02 g/L CaCl2 X 2H20; 20 mg/L次氮基三乙酸 10 mg/L MnS〇4 x H2O; 8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H2O; 2 mg/L C0CI2 x 6 H2O; 2 mg/L ZnS〇4 x 7 H2O; 0.2 mg/L C11CI2 x 2 H2O; 0.2 mg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O; 0.2 mg/L NiCl2 x 6 H2O; 0.2 mg/L Na2Se〇4; 0.2 mg/L Na2W〇4 x 2 H20; 20 yg/L d-生物素，20 yg/L叶酸，100 g/L盐酸吡哆醇；50 yg/L盐酸硫胺素x H20; 50 yg/L 核黄素；50 yg/L烟酸，50 yg/L 泛酸钙；1 yg/L 维生素B12 ; 50 yg/L 对氨基苯甲酸；50 yg/L硫辛酸，约67.5 mg/L NaOH)中厌氧培养。培养在防火1L玻璃瓶 中用由6 7 % H 2， 3 3 % C 0 2构成的预混合气体混合物化能自养 (chemolithoautotrophically)进行，其处于37°C，150 rpm的开放水浴摇床中且具有1-3 L/h的熏蒸持续161小时。气体进入培养基通过具有10微米孔径的滤器进行，且所述滤器固 定在反应器中央于通气管处。将细胞离心，用10 ml ATCC培养基洗涤并再次离心。
[0081] 对于预培养，将来自扬氏梭菌的生长培养物的许多经洗涤的细胞转移至具有约 400 mg/L L-盐酸半胱氨酸的200 mL ATCC培养基中并生长至0.12的0D6QQ。培养在耐压 500ml玻璃瓶中用由67% H2，33% C02构成的预混合气体混合物进行，其处于37°C，150 rpm的开放水浴摇床中且具有3 L/h的通气持续65小时。气体进入培养基通过具有10微米孔 径的滤器进行，其放置于反应器中央。将细胞离心，用10 ml生产缓冲液(pH 6.2; 0.5 g/L 的K0H，用67% H2、33% C02的预混气体混合物以1 L/hr通气1小时)洗涤并再次离心。
[0082]对于生产培养，将来自扬氏梭菌的预培养物的许多经洗涤的细胞转移至具有约 400 mg/L L-盐酸半胱氨酸的200 mL ATCC培养基中并生长至0.2的0D6Q()。培养在耐压500ml 玻璃瓶中用由67% H2、33% C02构成的预混合气体混合物进行，其处于37 °C，150 rpm的开 放水浴摇床中且具有3 L/h的通气持续118小时。气体进入培养基通过具有10微米孔径的滤 器进行，其放置于反应器中央。当pH降至低于5.0,加入1 ml 140 g/1 K0H溶液。当取样时， 移取各5 ml样品用于测定0D_、pH和产物范围。产物浓度的测定通过半定量1 H-NMR光谱学 进行。三甲基甲硅烷基丙酸钠(T (M) SP)用作内部定量标准品。
[0083]随118小时的培养时期，生产培养物中的细胞密度保持恒定，其可通过停滞的OD600 为0.2来识别，对应于y = 0 hf1的生长速率。乙酸浓度同时从4 mg / L至3194 mg / L且乙 醇浓度从17 mg / L至108 mg / L显著增加。
[0084] 实施例2 用扬氏梭菌从包含C02和出与氧气的合成气中不产生乙酸和乙醇 将扬氏梭菌在复合培养基中用合成气和氧气培养。将扬氏梭菌在存在合成气（由H2和 C02组成)且不存在氧气的情况下首先培养以产生乙酸和乙醇。对于培养，细胞生长在耐压 玻璃瓶中，所述玻璃瓶可以用丁基橡胶塞气密密封。扬氏梭菌细胞涉及的所有步骤均在厌 氧条件下进行。
[0085] 对于扬氏梭菌的细胞培养，将2 mL的冷冻培养物(Cryoculture)在具有约400 mg/ L L-盐酸半胱氨酸和400 mg/L Na2S x 9 H20的200 ml培养基(ATCC1754培养基：pH 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L酵母提取物，0.8 g/L NaCl，1 g/L NH4CI，0.1 g/L KC1，0.1 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgS〇4 x 7 H2O; 0.02 g/L CaCl2 X 2H20; 20 mg/L次氮基三乙酸 10 mg/L MnS〇4 x H20; 8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H20; 2 mg/L CoCl2 x 6 H20; 2 mg/L ZnS〇4 x 7 H2O; 0.2 mg/L CuCh x 2 H2O; 0.2 mg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O; 0.2 mg/L NiCh x 6 H2O; 0.2 mg/L Na2Se〇4; 0.2 mg/L Na2W〇4 x 2 H2O; 20 yg/L d-生物素，20 yg/L 叶酸，100 g/L盐酸吡咳醇；50 yg/L盐酸硫胺素x H2O; 50 yg/L核黄素；50 yg/L烟 酸，50 yg/L泛酸|丐；1 yg/L维生素B12 ; 50 yg/L对氨基苯甲酸；50 yg/L硫辛酸， 约67.5 11^/1似01〇中厌氧培养。培养在防火11玻璃瓶中用由67%112、33%(：02构成的预混合 气体混合物化能自养(chemolithoautotrophically)进行，其处于37°C、150 rpm的开放水 浴摇床中且具有1-3 L/h的熏蒸持续161小时。气体进入培养基通过具有10微米孔径的滤器 进行，且所述滤器固定在反应器中央于通气管处。将细胞离心，用10 ml ATCC培养基洗涤并 再次离心。
[0086] 对于预培养，将来自扬氏梭菌的生长培养物的许多经洗涤的细胞转移至具有约 400 mg/L L-盐酸半胱氨酸的200 mL ATCC培养基中并生长至0.12的0D6QQ。培养在耐压 500ml玻璃瓶中用由67% H2，33% C02构成的预混合气体混合物进行，其处于37 °C，150 rpm的开放水浴摇床中且具有3 L/h的通气持续24小时。随后，气体混合物改变为具有 66.85% H2、33% C02和0.15% 02的组成的气体混合物且细胞以3 L/h进一步通气67小时。气 体进入培养基通过具有10微米孔径的Begasungsfritte进行，其放置于反应器中央于分布 器(sparger)处。将细胞离心，用10 ml ATCC培养基洗涤并再次离心。气体进入培养基通过 具有10微米孔径的滤器进行，其放置于反应器中央。将细胞离心，用10 ml ATCC培养基洗涤 并再次离心。
[0087]对于生产培养，将来自扬氏梭菌的预培养物的许多经洗涤的细胞转移至具有约 400 mg/L L-盐酸半胱氨酸的200 mL ATCC培养基中并生长至0.1的0D6Q()。培养在耐压500ml 玻璃瓶中用由66.85% H2、33% C02和0.15% 02构成的预混合气体混合物进行，其处于37 °C、 150 rpm的开放水浴摇床中且具有3 L/h的通气持续113小时。气体进入培养基通过具有10 微米孔径的滤器进行，其放置于反应器中央。当取样时，移取各5 ml样品用于测定0D6QQ、pH 和产物范围。产物浓度的测定通过半定量1 H-NMR光谱学进行。三甲基甲硅烷基丙酸钠(T (M) SP)用作内部定量标准品。
[0088] 在89小时至113小时的时期中，未显示出可识别的细胞生长。0D6Q()稳定在0.29，对 应于生长速率y = 0 1T1。在该时间过程中乙酸浓度从89.4 mg/L略微增加至86.9 mg/L且乙 醇浓度从16.2 mg/L降至11.9 mg / L。
[0089] 实施例3 在存在包含C02和0.15%氧气的合成气的情况下处于对数期的扬氏梭菌的培养 扬氏梭菌从进料的气相外给料出和0)2,并形成乙酸和乙醇。对于培养，可以使用耐压 玻璃瓶，所述玻璃瓶可以用丁基橡胶塞气密密封。其中扬氏梭菌细胞涉及的所有培养步骤 均在厌氧条件下进行。
[0090] 对于扬氏梭菌的细胞培养，将5 mL的冷冻培养物在具有约400 mg/L L-盐酸半胱 氨酸和400 mg/L Na2S x 9 H20的500 ml培养基（ATCC1754培养基：pH 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L酵母提取物，0.8 g/L NaCl，1 g/L NH4CI，0.1 g/L KC1，0.1 g/L KH2P〇4，0.2 g/L MgS〇4 x 7 H2O; 0.02 g/L CaCl2 X 2H20; 20 mg/L次氮基三乙酸 10 mg/L MnS〇4 x H2O; 8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H2O; 2 mg/L C0CI2 x 6 H2O; 2 mg/L ZnS〇4 x 7 H2O; 0.2 mg/L C11CI2 x 2 H2O; 0.2 mg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O; 0.2 mg/L NiCl2 x 6 H2O; 0.2 mg/L Na2Se〇4; 0.2 mg/L Na2W〇4 x 2 H2O; 20 yg/L d-生物素，20 yg/L 叶酸，100 g/L 盐酸吡咳醇；50 yg/L盐酸硫胺素x H2O; 50 yg/L核黄素；50 yg/L烟酸，50 yg/L泛 酸1丐；11^凡维生素1312;5〇1^/1对氨基苯甲酸；5〇1^/1硫辛酸，约67.5 11^/1 NaOH)中厌氧培养。培养在防火1L玻璃瓶中用由67% H2、33% C02构成的预混合气体混合物化 能自养(chemolithoautotrophically)进行，其处于37°C、100 rpm的开放水浴摇床中且具 有3 L/h的熏蒸持续72小时。气体进入培养基通过具有10微米孔径的滤器进行，且所述滤器 固定在反应器中央于通气管处。将细胞离心，用10 ml ATCC培养基洗涤并再次离心。
[0091] 对于主要培养，将来自扬氏梭菌的生长培养物的许多经洗涤的细胞转移至具有约 400 mg/L L-盐酸半胱氨酸的500 mL ATCC培养基中并生长至0.1的0D6Q()。培养在耐压1 L玻 璃瓶中用由66.85% H2、33% C02、0.15% 02构成的预混合气体混合物进行，其处于37 °C、150 rpm的开放水浴摇床中且具有1 L/h的通气持续45小时。气体进入培养基通过具有10微米孔 径的滤器进行，其放置于反应器中央。当取样时，移取各5 ml样品用于测定OD600 nm、pH和产 物范围。产物浓度的测定通过半定量1 H-匪R光谱学进行。三甲基甲硅烷基丙酸钠(T (M) SP)用作内部定量标准品。
[0092] 在培养期过程中，显示显著的细胞生长，其通过OD600 nm从0.10至0.54的增加所证 实，对应于生长速率y = 0.037 h -、乙酸浓度同时从9.6 mg / L增加至3,304 mg / L且乙 醇浓度从2.2 mg / L增加至399 mg / L。
[0093] 实施例4 在存在包含CO和0.1%氧气的合成气的情况下处于对数期的扬氏梭菌的培养 将扬氏梭菌在复合培养基中用合成气（由C0、H2和C〇2组成)在存在氧气的情况下自养 培养以产生乙酸和乙醇。
[0094]使用由以下组成的复合培养基：1 g/L NH4C1，0.1 g/L KC1，0.2 g/L MgS〇4 x 7 H2O，0.8 g/L NaCl，0.1 g/L KH2PO4，20 mg/L CaCl2 x 2 H2O，20 g/L MES, 1 g/L酵母 提取物，0.4 g/L L-盐酸半胱氨酸，0.4 g/L Na2S x 9 H20, 20 mg/L次氮基三乙酸，10 mg/L MnS〇4 x H20，8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H20，2 mg/L CoCl2 x 6 H20，2 mg/L ZnS04 x 7 H2O, 0.2 mg/L CuCl2 x 2 H20, 0.2 mg/L Na2Mo04 x 2 H20, 0.2 mg/L NiCl2 x 6 H20, 0.2 mg/L Na2Se〇4, 0.2 mg/L Na2W〇4 x 2 H20, 20 yg/L生物素，20 yg/L叶酸， 100 yg/L盐酸吡哆醇，50 yg/L盐酸硫胺素x H20，50 yg/L核黄素，50 yg/L烟酸，50 yg/L泛酸妈，1 yg/L维生素 B12, 50 yg/L对氨基苯甲酸，50 yg/L硫辛酸。
[0095]自养培养在500 mL培养基中于1 L血清瓶中进行，所述血清瓶持续用由67.7% C0、 3.5% H2和15.6% C02组成的合成气以3.6 L/h的速率通气。通过具有10 ym的孔径的微气泡 分散器（microbubble disperser)将气体引入液相中。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放式水浴Innova 3100中在37 °C和120 mirf1的摇动速率下持续摇动。 [0096] 不控制pH。
[0097]在实验开始时，将扬氏梭菌以0.1的Oof?用在H2/C02上自养生长的细胞接种。因此， 扬氏梭菌在具有500 mL复合培养基的1L血清瓶中在用由67%出和33% C02组成的合成气以3 L/h的速率持续通气下生长于复合培养基中。上述培养基也用于该培养。通过具有10 ym的 孔径的微气泡分散器(microbubble disperser)将气体引入液相中。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放式水浴Innova 3100中在37 °C和150 mirf1的摇动速率下持 续摇动。在OD.为0.49的对数期且pH为5.03时通过厌氧离心（4500 min-\ 4300 g，20°C， 10 min)收获细胞。弃去上清液并将沉淀重悬于上述10 mL培养基中。该细胞悬浮液随后用 于接种培养实验。一氧化碳的气相浓度如下测量:对气相取样并通过具有热电导检测器的 Agilent Technologies Inc.的气相色谱GC 6890N离线分析。氧气的气相浓度可以通过来 自PreSens Precision Sensing GmbH的痕量氧气浸入探头(dipping probe)来测量。氧气 浓度通过荧光猝灭来测量，而猝灭程度与气相中氧分压相关。氧气测量指示所用的合成气 中0.1体积％的〇2浓度。
[0098] 在实验过程中，取5 mL样品用于测定0D6Q()、pH和产物浓度。后者通过定量1H-NMR-光谱学来测定。
[0099]接种扬氏梭菌后，细胞开始以0,062 1T1的生长速率y生长，且持续生产乙酸直至 94.5小时后6.2 g/L的浓度。伴随生产乙酸，乙醇以相比于乙酸生产较低的速率生产直至 94.5小时后1 g/L的浓度。
表1.实施例4的结果(n.d.=未检测到）。
[0100] 实施例5 通过扬氏梭菌在具有2 %氧气的合成气上生长和乙酸产生 对于生物转化氢气和二氧化碳为乙酸，在具有氧气的合成气上培养同型产乙酸菌扬氏 梭菌。所有培养步骤在厌氧条件下在可以用丁基橡胶塞气密封闭的耐压玻璃瓶中进行。
[0101] 对于预培养，用5 mL扬氏梭菌的冰冻的冷冻原种接种具有额外400 mg/L L-盐酸 半胱氨酸和400 mg/L Na2S x 9 H20的500 ml培养基(ATCC1754培养基：pH 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L酵母提取物，0.8 g/L NaCl，1 g/L NH4CI，0.1 g/L KC1，0.1 g/L KH2P〇4， 0.2 g/L MgS〇4 x 7 H2O; 0.02 g/L CaCl2 X 2H20; 20 mg/L次氮基三乙酸 10 mg/L MnS〇4 x H2O; 8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H2O; 2 mg/L C0CI2 x 6 H2O; 2 mg/L ZnS〇4 x 7 H2O; 0.2 mg/L CuCh x 2 H2O; 0.2 mg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O; 0.2 mg/L NiCh x 6 H2O; 0.2 mg/L Na2Se〇4; 0.2 mg/L Na2W〇4 x 2 H2O; 20 yg/L d-生物素，20 yg/L 叶酸，100 yg/L盐酸吡咳醇；50 yg/L盐酸硫胺素X H2〇; 50 yg/L核黄素；50 yg/L烟酸，50 yg/ !^泛酸|丐；1此凡维生素1312;50此凡对氨基苯甲酸；50狀凡硫辛酸，约67.5 11^/ L NaOH)。化能自养培养在1L耐压玻璃瓶中在37°C、100 rpm下和3 L/h的通气速率用具有 67% H2、33% C02的预混气体在开放水浴摇床中进行72小时。将气体经具有10 ym的孔径的 分布器排放至培养基中，所述分布器固定在反应器的中央。培养在无pH控制下进行。
[0102] 预培养后，将细胞悬浮液离心（10 min，4200 rpm)并将沉淀用10 ml培养基洗涤 并再次离心。对于主要培养物，将必需数量的来自预培养物的经洗涤的细胞以0.1的〇D600nm 转移至具有额外400 mg/L L-盐酸半胱氨酸的200 mL培养基。化能自养培养在250 mL耐压 玻璃瓶中在37°C、150 rpm下和1 L/h的通气速率用具有65% H2、33% C〇2、2%〇2的预混气体在 开放水浴摇床中进行47小时。将气体经具有10 ym的孔径的分布器排放至培养基中，所述分 布器固定在反应器的中央。培养在无pH控制下进行。培养过程中，取若干5 mL样品来测定 0D6QQnm、pH和产物形成。产物浓度的测定通过半定量1H-WR光谱学进行。三甲基甲硅烷基丙 酸钠（T(M)SP)用作内部定量标准品。还通过氧气浸入探头（具有0xy4Trace的PSt6， Presens，Germany)在线测量培养基中的溶解氧。
[0103] 在培养期过程中，通过OD6QQnmW〇.ll增加至0.32观察到细胞生长，其与y = 0.022 h 4的生长速率相关。乙酸浓度从8 mg/L增加至91 mg/L、没有观察到乙醇浓度的增加。在培 养期过程中，溶解氧浓度在0.06-0.15 mg/L之间变化。
[0104]在具有相同参数(培养基组成、体积、瓶、气体、通气速率、温度、摇动频率）的相似 技术设定(但培养基中无细胞)中，测量到0.50 mg/L的溶解氧浓度。
[0105] 实施例6 通过扬氏梭菌在具有0.15%氧气的合成气上生长和乙酸产生 对于生物转化氢气和二氧化碳为乙酸，在具有氧气的合成气上培养同型产乙酸菌扬氏 梭菌。所有培养步骤在厌氧条件下在可以用丁基橡胶塞气密封闭的耐压玻璃瓶中进行。
[0106] 对于预培养，用5 mL扬氏梭菌的冰冻的冷冻原种接种具有额外400 mg/L L-盐酸 半胱氨酸和400 mg/L Na2S x 9 H20的500 ml培养基(ATCC1754培养基：pH 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L酵母提取物，0.8 g/L NaCl，1 g/L NH4CI，0.1 g/L KC1，0.1 g/L KH2P〇4， 0.2 g/L MgS〇4 x 7 H2O; 0.02 g/L CaCl2 X 2H20; 20 mg/L次氮基三乙酸 10 mg/L MnS〇4 x H2O; 8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H2O; 2 mg/L C0CI2 x 6 H2O; 2 mg/L ZnS〇4 x 7 H2O; 0.2 mg/L CuCh x 2 H2O; 0.2 mg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O; 0.2 mg/L NiCh x 6 H2O; 0.2 mg/L Na2Se〇4; 0.2 mg/L Na2W〇4 x 2 H2O; 20 yg/L d-生物素，20 yg/L 叶酸，100 yg/L盐酸吡咳醇；50 yg/L盐酸硫胺素X H2〇; 50 yg/L核黄素；50 yg/L烟酸，50 yg/ !^泛酸|丐；1此凡维生素1312;50此凡对氨基苯甲酸；50狀凡硫辛酸，约67.5 11^/ L NaOH)。化能自养培养在1L耐压玻璃瓶中在37°C、100 rpm下和3 L/h的通气速率用具有 67% H2、33% C02的预混气体在开放水浴摇床中进行72小时。将气体经具有10 ym的孔径的分 布器排放至培养基中，所述分布器固定在反应器的中央。培养在无pH控制下进行。
[0107] 预培养后，将细胞悬浮液离心（10 min，4200 rpm)并将沉淀用10 ml培养基洗涤 并再次离心。对于主要培养物，将必需数量的来自预培养物的经洗涤的细胞以0.1的〇D600nm 转移至具有额外400 mg/L L-盐酸半胱氨酸的200 mL培养基。化能自养培养在250 mL耐压 玻璃瓶中在37°C、150 rpm下和1 L/h的通气速率用具有66.85% H2、33% C〇2、0.15%〇2的预混 气体在开放水浴摇床中进行47小时。将气体经具有10 ym的孔径的分布器排放至培养基中， 所述分布器固定在反应器的中央。培养在无pH控制下进行。培养过程中，取若干5 mL样品来 测定0D6QQnm、pH和产物形成。产物浓度的测定通过半定量1H-NMR光谱学进行。三甲基甲硅烷 基丙酸钠（T(M)SP)用作内部定量标准品。还通过氧气浸入探头（具有0xy4Trace的PSt6， Presens，Germany)在线测量培养基中的溶解氧。
[0108] 在培养期过程中，通过0D6QQnJA0.10增加至0.45观察到细胞生长，其与y = 0.032 h 的生长速率相关。乙酸浓度从7 mg/L增加至2347 mg/L且乙醇浓度从2 mg/L增加至319 mg/L。在整个培养期，溶解氧浓度为0.00 mg/L。
[0109] 在具有相同参数(培养基组成、体积、瓶、气体、通气速率、温度、摇动频率）的相似 技术设定(但培养基中无细胞)中，测量到0.03 mg/L的溶解氧浓度。
[0110] 实施例7 扬氏梭菌和克氏梭菌在确定成分培养基中在氢气和二氧化碳上的共培养 扬氏梭菌作为第一微生物在确定成分培养基中自养培养以产生乙酸和乙醇。给定时间 后，克氏梭菌作为第二生物随后接种在相同反应器中用于转化乙酸和乙醇为丁酸和己酸。 随后，扬氏梭菌然后转化丁酸为丁醇。
[0111] 使用确定成分培养基用于两种微生物的共培养，所述培养基由以下组成：2 g/L (NH4)2HP〇4, 0.2 g/L NaCl, 0.15 g/1 KC1, 1 g/1 KOH, 0.5 g/L MgCl2 x 6 H20, 0.2 g/L CaCl2 x 2 H20, 15 mg/L FeCl2 x 4 H20, 0.4 g/L L-盐酸半胱氨酸，0.4 g/L Na2S x 9 H2O, 3 mg/L硼酸，2 mg/L C0CI2 x 6 H2O，1 mg/L ZnS〇4 x 7 H2O，0.3 mg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O, 0.3 mg/L MnS04 x H2O, 0.2 mg/L NiCl2 x 6 H2O, 0.1 mg/L CuCl2 x 2 H2O, 0.1 mg/L Na2Se〇3, 106 yg/L生物素，5 yg/L叶酸，2.5 yg/L盐酸吡咳醇，266 yg/L盐酸硫胺素x H20, 12.5 yg/L叶黄素，12.5yg/L盐酸，413 yg/L泛酸?丐， 12.5 yg/L维生素B12，12.5 yg/L对氨基苯甲酸，15 yg/L硫辛酸。
[0112] 自养培养在250 mL确定成分培养基中于500 L血清瓶中进行，所述血清瓶持续用 由67% H2和33% C02组成的合成气以1 L/h的速率通气。通过具有10 ym的孔径的微气泡分散 器（microbubble disperser)将气体引入液相中。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放式水浴Innova 3100中在37 °C和150 mirf1的摇动速率下持续摇动。通过 持续加入K0H的厌氧储备溶液(40 g/L)将pH保持在pH 5.0 - 6.5的范围。
[0113] 在实验开始时，将扬氏梭菌以0.1的0D6QQ用自养生长的细胞接种。因此，扬氏梭菌 在具有500 mL复合培养基的1L血清瓶中在用由67%出和33% C02组成的合成气以3 L/h的速 率持续通气下生长于复合培养基中。使用由以下组成的复合培养基g/L NH4C1，0.1 g/ L KC1，0.2 g/L MgS〇4 x 7 H2O，0.8 g/L NaCl，0.1 g/L KH2PO4，20 mg/L CaCl2 x 2 H20，20 g/L MES，1 g/L酵母提取物，0.4 g/L L-盐酸半胱氨酸，0.4 g/L Na2S x 9 H2O，20 mg/L次氮基三乙酸，10 mg/L MnS〇4 x H2O，8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H2O，2 mg/L C0CI2 x 6 H2O，2 mg/L ZnS〇4 x 7 H2O，0.2 mg/L C11CI2 x 2 H2O，0.2 mg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O，0.2 mg/L NiCl2 x 6 H2O，0.2 mg/L Na2Se〇4, 0.2 mg/L Na2W〇4 x 2 H20, 20 yg/L生物素，20 yg/L叶酸，100 yg/L盐酸吡哆醇，50 yg/L盐酸硫胺素x H20， 50 yg/L核黄素，50 yg/L烟酸，50 yg/L泛酸妈，1 yg/L维生素B12, 50 yg/L对氨基苯 甲酸，50 yg/L硫辛酸。通过具有10 ym的孔径的微气泡分散器将气体引入液相中。血清瓶 在来自New Brunswick Scientific的开放式水浴Innova 3100中在37 °C和150 min-1 的摇 动速率下持续摇动。在〇D6QQ为0.67的晚对数期且pH为4.69时通过厌氧离心（4500 min-1， 4300 g，20°C，10 min)收获细胞。弃去上清液并将沉淀重悬于上述10 mL确定成分培养基 中。该细胞悬浮液随后用于接种共培养实验。
[0114] 与此平行，将克氏梭菌异养生长于500 mL血清瓶中的200 mL复合培养基中乙酸和 乙醇上。使用由以下组成的复合培养基:0.25 g/L NH4C1，0.2 g/L MgSCk x 7 H20, 0.31 g/L K2HPO4, 0.23 g/L KH2PO4, 2.5 g/L NaHCOs, 1 g/L酵母提取物，10 g/L乙酸钾，20 g/1乙醇，0.25 g/L L-盐酸半胱氨酸，1.5 mg/L FeCb x 4 H2O，70 yg/L ZnCl2 x 7 H2O，100 yg/L MnCl2 x 4 H2O，6 yg/L硼酸，190 yg/L C0CI2 x 6 H2O，2 yg/L C11CI2 x 6 H2O，24 yg/L NiCl2 x 6 H2O，36 yg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O，3 yg/L Na2Se003 x 5 H2O，4 yg/L Na2W〇4 x 2 H2O，100 yg/L 维生素B12, 80 yg/ L对氨基苯甲酸，20 yg/L生物素，200 yg/L烟酸，100 yg/L泛酸钙，300 yg/L盐酸吡哆 醇，200 yg/L盐酸硫胺素x H2O。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放式水浴 Innova 3100中在37 °C和100 mirT1的摇动速率下持续摇动。在OD6(x)为0.81的晚对数期且pH 为5.96时通过厌氧离心（4500 min-\ 4300 g，20°C，10 min)收获细胞。弃去上清液并将 沉淀重悬于上述10 mL确定成分培养基中。运行实验96小时后，随后将该细胞悬浮液用于以 0.2的OD600接种共培养实验。
[0115] 在实验过程中，取5 mL样品用于测定0D6Q()、pH和产物浓度。后者通过定量1H-NMR-光谱学来测定。
[0116]接种扬氏梭菌后，细胞开始生长并持续产生乙酸。伴随生产乙酸，乙醇以相比于乙 酸生产较低的速率生产。96小时后，然后将克氏梭菌接种入反应器中，在以下实验中测量乙 醇浓度的降低。然后在实验随后的113小时中测量丁酸（最大1163 mg/L)和己酸(最大136 mg/L)的同时生产。与通过克氏梭菌生产丁酸平行，扬氏梭菌转化丁酸为丁醇至实验结束时 20 mg/L丁醇的最大浓度。
表2.实施例7的结果(n.d.=未检测到）。
[0117] 实施例8 扬氏梭菌和克氏梭菌在复合培养基中用含C0的气体的共培养 扬氏梭菌作为第一生物在复合培养基中自养培养以产生乙酸和乙醇。给定时间后，克 氏梭菌作为第二生物随后接种在相同反应器中用于转化乙酸和乙醇为丁酸和己酸。随后， 扬氏梭菌然后转化丁酸为丁醇并转化己酸为己醇。
[0118] 使用由以下组成的复合培养基用于共培养两种微生物：1 g/L NH4C1，0.1 g/L KC1, 0.2 g/L MgSCk x 7 H2O，0.8 g/L NaCl，0.1 g/L KH2PO4，20 mg/L CaCl2 x 2 H2O，20 g/L MES，1 g/L酵母提取物，0.4 g/L L-盐酸半胱氨酸，0.4 g/L Na2S x 9 H2O，20 mg/L次氮基三乙酸，10 mg/L MnSCk x H2O，8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H2O，2 mg/L C0CI2 x 6 H2O, 2 mg/L ZnS04 x 7 H2O, 0.2 mg/L CuCl2 x 2 H2O, 0.2 mg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O，0.2 mg/L NiCl2 x 6 H2O，0.2 mg/L Na2Se〇4, 0.2 mg/L Na2W〇4 x 2 H20, 20 yg/L生物素，20 yg/L叶酸，100 yg/L盐酸吡哆醇，50 yg/L盐酸硫胺素x H20， 50 yg/L核黄素，50 yg/L烟酸，50 yg/L泛酸妈，1 yg/L维生素B12, 50 yg/L对氨基苯 甲酸，50 yg/L硫辛酸。
[0119] 自养培养在500 mL复合培养基中于1 L血清瓶中进行，所述血清瓶持续用由5 % H2、25 % C02、25 % C0和45% N2组成的合成气以~12 L/h U〇.5ppm)的速率通气。通过具有 10 ym的孔径的微气泡分散器将气体引入液相中。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放式水浴Innova 3100中在37 °C和120 mirf1的摇动速率下持续摇动。在该 实验过程中不控制pH。
[0120] 在实验开始时，将扬氏梭菌以0.1的0D6QQ用自养生长的细胞接种。因此，扬氏梭菌 在具有500 mL复合培养基的1L血清瓶中在用由67%出和33% C02组成的合成气以3 L/h的速 率持续通气下生长于上述复合培养基中。通过具有10 ym的孔径的微气泡分散器将气体引 入液相中。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放式水浴Innova 3100中在37 °C 和150 mirT1的摇动速率下持续摇动。在0D6(x)为0.51的晚对数期且pH为5.04时通过厌氧离心 (4500 min-\ 4300 g，20°C，10 min)收获细胞。弃去上清液并将沉淀重悬于10 mL上述确 定成分培养基中。该细胞悬浮液随后用于接种共培养实验。
[0121] 与此平行，将克氏梭菌异养生长于500 mL血清瓶中的200 mL复合培养基中乙酸和 乙醇上。使用由以下组成的复合培养基:0.25 g/L NH4C1，0.2 g/L MgSCk x 7 H20, 0.31 g/L K2HPO4, 0.23 g/L KH2PO4, 2.5 g/L NaHCOs, 1 g/L酵母提取物，10 g/L乙酸钾，20 g/1乙醇，0.25 g/L L-盐酸半胱氨酸，1.5 mg/L FeCb x 4 H2O，70 yg/L ZnCl2 x 7 H2O，100 yg/L MnCl2 x 4 H2O，6 yg/L硼酸，190 yg/L C0CI2 x 6 H2O，2 yg/L C11CI2 x 6 H2O，24 yg/L NiCl2 x 6 H2O，36 yg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O，3 yg/L Na2Se003 x 5 H2O，4 yg/L Na2W〇4 x 2 H2O，100 yg/L 维生素B12, 80 yg/ L对氨基苯甲酸，20 yg/L生物素，200 yg/L烟酸，100 yg/L泛酸钙，300 yg/L盐酸吡哆 醇，200 yg/L盐酸硫胺素x H2O。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放式水浴 Innova 3100中在37 °C和100 mirT1的摇动速率下持续摇动。在0D6(x)为0.54的晚对数期且pH 为6.60时通过厌氧离心（4500 min-\ 4300 g，20°C，10 min)收获细胞。弃去上清液并将 沉淀重悬于10 mL上述确定成分培养基中。运行实验240小时后，随后将该细胞悬浮液用于 接种共培养实验。
[0122] 在实验过程中，取5 mL样品用于测定0D6Q()、pH和产物浓度。后者通过定量1H-NMR-光谱学来测定。
[0123] 接种扬氏梭菌后，细胞开始生长并持续产生乙酸至71小时后~3 g/L的浓度并产 生乙醇至71小时后~0.5 g/L的浓度。在实验的随后时间过程中，乙酸在240小时后完全转化 为乙醇直至4.8 g/L的浓度。在240小时的处理时间时，将克氏梭菌随后接种入反应器。由于 该生物除乙醇外还需要乙酸作为底物，因此接种克氏梭菌的同时，将大约3 g/L的乙酸（以 乙酸钠的形式)厌氧加入反应器。在实验的随后时间过程中，测量丁酸和己酸的产生直至各 自1.6 g/L的浓度。与通过克氏梭菌生产丁酸和己酸平行，扬氏梭菌转化丁酸为丁醇至690 mg/L丁醇的最大浓度并转化己酸至己醇至1478 mg/L己醇的最大浓度。
表3.实施例8的结果(n.d.=未检测到）。
[0124] 实施例9 通过Clostridium carboxidivorans在具有0.05%氧气的合成气上生长和生产乙酸及 其他化合物 对于生物转化氢气和二氧化碳为乙酸和其他化合物，在具有氧气的合成气上培养同型 产乙酸菌Clostridium carboxidivorans。所有培养步骤在厌氧条件下在可以用丁基橡胶 塞气密封闭的耐压玻璃瓶中进行。
[0125] 对于预培养，用5 mL扬氏梭菌的冰冻的冷冻原种接种具有额外400 mg/L L-盐酸 半胱氨酸和400 mg/L Na2S x 9 出0的500 ml培养基(ATCC1754培养基：pH 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L酵母提取物，0.8 g/L NaCl，1 g/L NH4CI，0.1 g/L KC1，0.1 g/L KH2PO4， 0.2 g/L MgS〇4 x 7 H2O; 0.02 g/L CaCl2 X 2H2O; 20 mg/L次氮基三乙酸 10 mg/L MnSCk x H2O; 8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H2O; 2 mg/L C0CI2 x 6 H2O; 2 mg/L ZnS〇4 x 7 H20; 0.2 mg/L CuCl2 x 2 H20; 0.2 mg/L Na2Mo04 x 2 H20; 0.2 mg/L NiCl2 x 6 H20; 0.2 mg/L Na2Se〇4; 0.2 mg/L Na2W04 x 2 H2O; 20 yg/L d-生物素，20 yg/L 叶酸，100 yg/L盐酸吡咳醇；50 yg/L盐酸硫胺素X H2〇; 50 yg/L核黄素；50 yg/L烟酸，50 yg/ !^泛酸|丐；1此凡维生素1312;50此凡对氨基苯甲酸；50狀凡硫辛酸，约67.5 11^/ L NaOH)。化能自养培养在1L耐压玻璃瓶中在37°C、100 rpm下和3 L/h的通气速率用具有 60%出、20% C〇2和20% C0的预混气体在开放水浴摇床中进行71小时。将气体经具有10 ym的 孔径的分布器排放至培养基中，所述分布器固定在反应器的中央。培养在无pH控制下进行。
[0126] 预培养后，将细胞悬浮液离心（10 min，4200 rpm)并将沉淀用新鲜培养基重悬。 对于主要培养物，将必需数量的来自预培养物的细胞以0.2的0D_nm转移至200 mL复合培养 基(ATCC1754)和平行转移至200 mL矿物培养基(DM4-培养基：pH = 6.00，0.5 g/L MgCl2 X 6 H20，0.2 g/L CaCl2 X 2 H20，15 mg/L FeCh X 4 H20，2 g/L (NH4)H2P〇4，0.2 g/L NaCl, 0.15 g/L KC1, 3 mg/L H3BO3, 2 mg/L C0CI2 x 6 H2O, 1 mg/L ZnS04 x 7 H2O, 300 yg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O, 300 yg/L MnS04 x H2O, 200 yg/L NiCl2 x 6 H2O, 100 yg/ L CuCl2 x 2 H20, 100 yg/L Na2Se03, 106 yg/L d-生物素，5 yg/L 叶酸，2.5 yg/L盐 酸P比咳醇，266 yg/L盐酸硫胺素，12.5 yg/L核黄素，12.5 yg/L烟酸，413 yg/L泛酸 钙，12.5 yg/L维生素B12，12.5 yg/L对氨基苯甲酸，15.0 yg/L硫辛酸，约1.3 g/L KOH)，所述培养基各自具有额外400 mg/L L-盐酸半胱氨酸。化能自养培养在1 L耐压玻璃 瓶中在37°C、150 rpm下和1 L/h的通气速率用具有66.95% H2、33% C02、和0.05% 02的预混 气体在开放水浴摇床中进行40小时。将气体经具有10 ym的孔径的分布器排放至顶空，所述 分布器固定在反应器的中央。培养在无pH控制下进行。培养过程中，取若干5 mL样品来测定 OD6QQnm、pH和产物形成。产物浓度的测定通过半定量1H-WR光谱学进行。三甲基甲硅烷基丙 酸钠（T(M)SP)用作内部定量标准品。还通过氧气浸入探头（具有0xy4Trace的PSt6， Presens，Germany)在线测量培养基中的溶解氧。
[0127] 在培养期过程中，通过OD6Q()nJA〇.20增加至0.36观察到复合培养基中细胞生长，其 与y = 0.015 h <的生长速率相关。在矿物培养基中，0D6Q()nmW0.20降低至0.19。在复合培 养基中，乙酸浓度从29 mg/L增加至280 mg/L，乙醇浓度从3 mg/L增加至82 mg/L，丁酸浓度 从0 mg/L增加至29 mg/L且丁醇浓度从0 mg/L增加至10 mg/L。在矿物培养基中，乙酸浓度 从25 mg/L增加至110 mg/L，乙醇浓度从3 mg/L增加至5 mg/L，且丁酸浓度从0 mg/L增加至 2 mg/L。在整个培养期，两种培养物中溶解氧浓度均为0.00 mg/L。在具有相同参数(培养基 组成、体积、瓶、气体、通气速率、温度、摇动频率）的相似技术设定(但培养基中无细胞）中， 在两种培养基中测量到〇. 01 mg/L的溶解氧浓度。
[0128] 实施例10 通过产乙醇梭菌在具有0.05%氧气的合成气上生长和生产乙酸及乙醇 对于生物转化氢气和二氧化碳为乙酸和乙醇，在具有氧气的合成气上培养同型产乙酸 菌产乙醇梭菌。所有培养步骤在厌氧条件下在可以用丁基橡胶塞气密封闭的耐压玻璃瓶中 进行。
[0129] 对于预培养，用5 mL产乙醇梭菌的冰冻的冷冻原种接种具有额外400 mg/L L-盐 酸半胱氨酸和400 mg/L Na2S x 9 H20的500 ml培养基(ATCC1754培养基：pH 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L酵母提取物，0.8 g/L NaCl, 1 g/L NH4CI，0.1 g/L KC1，0.1 g/L KH2P〇4， 0.2 g/L MgS〇4 x 7 H2O; 0.02 g/L CaCl2 X 2H20; 20 mg/L次氮基三乙酸 10 mg/L MnS〇4 x H2O; 8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H2O; 2 mg/L C0CI2 x 6 H2O; 2 mg/L ZnS〇4 x 7 H2O; 0.2 mg/L CuCh x 2 H2O; 0.2 mg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O; 0.2 mg/L NiCh x 6 H2O; 0.2 mg/L Na2Se〇4; 0.2 mg/L Na2W〇4 x 2 H2O; 20 yg/L d-生物素，20 yg/L 叶酸，100 yg/L盐酸吡咳醇；50 yg/L盐酸硫胺素X H2〇; 50 yg/L核黄素；50 yg/L烟酸，50 yg/ !^泛酸|丐；1此凡维生素1312;50此凡对氨基苯甲酸；50狀凡硫辛酸，约67.5 11^/ L NaOH)。化能自养培养在1L耐压玻璃瓶中在37°C、100 rpm下和3 L/h的通气速率用具有 67% H2、33% C02的预混气体在开放水浴摇床中进行72小时。将气体经具有10 ym的孔径的分 布器排放至培养基中，所述分布器固定在反应器的中央。培养在无pH控制下进行。
[0130] 预培养后，将细胞悬浮液离心（10 min, 4200 rpm)并将沉淀用新鲜培养基重悬。 对于主要培养物，将必需数量的来自预培养物的细胞以0.1的〇D6QQnm转移至具有额外400 mg/L L-盐酸半胱氨酸的500 mL培养基。化能自养培养在1 L耐压玻璃瓶中在37°C、150 rpm 下和1 L/h的通气速率用具有66.95% H2、33% C02、和0.05% 02的预混气体在开放水浴摇床 中进行41小时。将气体经具有10 ym的孔径的分布器排放至培养基中，所述分布器固定在反 应器的中央。培养在无pH控制下进行。培养过程中，取若干5 mL样品来测定ODsoon^pH和产物 形成。产物浓度的测定通过半定量1H-NMR光谱学进行。三甲基甲硅烷基丙酸钠(T(M)SP)用 作内部定量标准品。还通过氧气浸入探头（具有0xy4Trace的PSt6, Presens, Germany)在 线测量培养基中的溶解氧。
[0131] 在培养期过程中，通过小时内从0.08增加至0.76观察到细胞生长，其与 y = 0.054 h 4的生长速率相关。乙酸浓度同时从37 mg/L增加至6600 mg/L且乙醇浓度从4 mg/L增加至120 mg/L。在整个培养期，溶解氧浓度为0.00 mg/L。
[0132] 在具有相同参数(培养基组成、体积、瓶、气体、通气速率、温度、摇动频率）的相似 技术设定(但培养基中无细胞)中，测量到〇.〇1 mg/L的溶解氧浓度。
[0133] 实施例11 通过扬氏梭菌在具有0.6%氧气的合成气上生长和乙酸产生 对于生物转化氢气和二氧化碳为乙酸，在具有氧气的合成气上培养同型产乙酸菌扬氏 梭菌。所有培养步骤在厌氧条件下在可以用丁基橡胶塞气密封闭的耐压玻璃瓶中进行。
[0134] 对于预培养，用5 mL扬氏梭菌的冰冻的冷冻原种接种具有额外400 mg/L L-盐酸 半胱氨酸和400 mg/L Na2S x 9 H20的500 ml培养基(ATCC1754培养基：pH 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L酵母提取物，0.8 g/L NaCl，1 g/L NH4CI，0.1 g/L KC1，0.1 g/L KH2P〇4， 0.2 g/L MgS〇4 x 7 H2O; 0.02 g/L CaCl2 X 2H20; 20 mg/L次氮基三乙酸 10 mg/L MnS〇4 x H2O; 8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H2O; 2 mg/L C0CI2 x 6 H2O; 2 mg/L ZnS〇4 x 7 H2O; 0.2 mg/L CuCh x 2 H2O; 0.2 mg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O; 0.2 mg/L NiCh x 6 H2O; 0.2 mg/L Na2Se〇4; 0.2 mg/L Na2W〇4 x 2 H2O; 20 yg/L d-生物素，20 yg/L 叶酸，100 yg/L盐酸吡咳醇；50 yg/L盐酸硫胺素X H2〇; 50 yg/L核黄素；50 yg/L烟酸，50 yg/ !^泛酸|丐；1此凡维生素1312;50此凡对氨基苯甲酸；50狀凡硫辛酸，约67.5 11^/ L NaOH)。化能自养培养在1L耐压玻璃瓶中在37°C、100 rpm下和3 L/h的通气速率用具有 67% H2、33% C02的预混气体在开放水浴摇床中进行72小时。将气体经具有10 ym的孔径的分 布器排放至培养基中，所述分布器固定在反应器的中央。培养在无pH控制下进行。
[0135] 预培养后，将细胞悬浮液离心（10 min，4200 rpm)并将沉淀用10 ml培养基洗涤 并再次离心。对于主要培养物，将必需数量的来自预培养物的经洗涤的细胞以0.1的〇D600nm 转移至具有额外400 mg/L L-盐酸半胱氨酸的200 mL培养基。化能自养培养在250 mL耐压 玻璃瓶中在37°C、150 rpm下和1 L/h的通气速率用具有66.85% H2、33% C〇2、0.6%〇2的预混 气体在开放水浴摇床中进行91小时。将气体经具有10 ym的孔径的分布器排放至培养基中， 所述分布器固定在反应器的中央。培养在无pH控制下进行。培养过程中，取若干5 mL样品来 测定0D6QQnm、pH和产物形成。产物浓度的测定通过半定量1H-NMR光谱学进行。三甲基甲硅烷 基丙酸钠（T(M)SP)用作内部定量标准品。还通过氧气浸入探头（具有0xy4Trace的PSt6， Presens，Germany)在线测量培养基中的溶解氧。
[0136] 在培养期过程中，通过0D6QQnm从0.10增加至0.16观察到细胞生长，其与y = 5 x 10一3 h 4的生长速率相关。乙酸浓度从9 mg/L增加至476 mg/L且乙醇浓度从6 mg/L增加至 61 mg/L。在培养期过程中，溶解氧浓度为0.01-0.10 mg/L。
[0137] 在具有相同参数(培养基组成、体积、瓶、气体、通气速率、温度、摇动频率）的相似 技术设定(但培养基中无细胞)中，测量到〇. 15 mg/L的溶解氧浓度。
[0138] 实施例12 通过伍氏醋酸杆菌在具有氧气的合成气上生长和生产乙酸 对于生物转化氢气和二氧化碳为乙酸，在具有氧气的合成气上培养同型产乙酸菌伍氏 醋酸杆菌。所有培养步骤在厌氧条件下在可以用丁基橡胶塞气密封闭的耐压玻璃瓶中进 行。对于预培养，用5 mL伍氏醋酸杆菌的冰冻的冷冻原种接种具有额外400 mg/L L-盐酸半 胱氨酸和400 mg/L Na2S x 9 H20的500 ml培养基(ATCC1754培养基：pH 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L酵母提取物，0.8 g/L NaCl，1 g/L NH4CI，0.1 g/L KC1，0.1 g/L KH2P〇4， 0.2 g/L MgS〇4 x 7 H2O; 0.02 g/L CaCl2 X 2H20; 20 mg/L次氮基三乙酸 10 mg/L MnS〇4 x H2O; 8 mg/L (NH4)2Fe(S〇4)2 x 6 H2O; 2 mg/L C0CI2 x 6 H2O; 2 mg/L ZnS〇4 x 7 H2O; 0.2 mg/L CuCh x 2 H2O; 0.2 mg/L Na2Mo〇4 x 2 H2O; 0.2 mg/L NiCh x 6 H2O; 0.2 mg/L Na2Se〇4; 0.2 mg/L Na2W〇4 x 2 H2O; 20 yg/L d-生物素，20 yg/L 叶酸，100 yg/L盐酸吡咳醇；50 yg/L盐酸硫胺素X H2〇; 50 yg/L核黄素；50 yg/L烟酸，50 yg/ !^泛酸|丐；1此凡维生素1312;50此凡对氨基苯甲酸；50狀凡硫辛酸，约67.5 11^/ L NaOH)。化能自养培养在1L耐压玻璃瓶中在37°C、100 rpm下和3 L/h的通气速率用具有 67% H2、33% C02的预混气体在开放水浴摇床中进行72小时。将气体经具有10 ym的孔径的分 布器排放至培养基中，所述分布器固定在反应器的中央。培养在无pH控制下进行。
[0139] 预培养后，将细胞悬浮液离心（10 min, 4200 rpm)并将沉淀用新鲜培养基重悬。 对于主要培养物，将必需数量的来自预培养物的细胞以0.1的〇D6QQnm转移至具有额外400 mg/L L-盐酸半胱氨酸的500 mL培养基。化能自养培养在1 L耐压玻璃瓶中在37 °C、150 rpm 下和1 L/h的通气速率用具有66.95% H2、33% C02、0.05% 02的预混气体在开放水浴摇床中 进行41小时。将气体经具有10 ym的孔径的分布器排放至培养基中，所述分布器固定在反应 器的中央。培养在无pH控制下进行。培养过程中，取若干5 mL样品来测定ODsoo?、pH和产物形 成。产物浓度的测定通过半定量1H-匪R光谱学进行。三甲基甲硅烷基丙酸钠(T(M)SP)用作 内部定量标准品。还通过氧气浸入探头(具有0xy4Trace的PSt6, Presens，Germany)在线 测量培养基中的溶解氧。
[0140] 在培养期过程中，通过ODsoo?的增加观察到细胞生长。乙酸浓度也增加。
[0141 ]在具有相同参数(培养基组成、体积、瓶、气体、通气速率、温度、摇动频率）的相似 技术设定(但培养基中无细胞)中，测量到〇.〇1 mg/L的溶解氧浓度。
【主权项】
1. 反应混合物，其用于在好氧条件下从碳源生产乙醇和/或乙酸，其中所述混合物包含 -处于指数生长期的第一产乙酸微生物； -游离氧;和 -处于稳定期的第二产乙酸微生物 其中所述第一和第二产乙酸微生物能够转化碳源为乙酸和/或乙醇。2. 权利要求1的混合物，其中所述第一和第二微生物选自潮湿厌氧醋菌 (Acetoanaerobium notera)(ATCC 35199)、长醋丝菌（Acetonema longum) (DSM 6540)、甲 醇醋酸杆菌（Acetobacterium carbinolicum)(DSM 2925)、苹果酸醋酸杆菌 (Acetobacterium malicum) (DSM 4132)、醋酸杆菌属第446号种（Acetobacterium species no. 446)、威氏醋酸杆菌(Acetobacterium wieringae )(DSM 1911)、伍氏醋酸杆 菌(Acetobacterium woodii) (DSM 1030)、Alkalibaculum bacchi(DSM 22112)、闪烁古生 球菌（Archaeoglobus fulgidus) (DSM 4304)、Blautia producta (DSM 2950)、食甲基丁 酸杆菌（Butyribacterium methylotrophicum) (DSM 3468)、醋酸梭菌（Clostridium aceticum) (DSM 1496)、产乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum) (DSM 10061、DSM 19630和DSM 23693)、Clostridium carboxidivorans (DSM 15243)、Clostridium coskatii (ATCC编号 PTA-10522)、Clostridium drakei (ATCC BA-623)、蚁酸醋酸梭菌 (Clostridium formicoaceticum) (DSM 92)、乙二酉享梭菌（Clostridium glycolicum) (DSM 1288)、扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii) (DSM 13528)、扬氏梭菌C-01 (ATCC 55988)、扬氏梭菌ERI-2 (ATCC 55380)、扬氏梭菌0-52(ATCC 55989)、马犹姆贝梭菌 (Clostridium mayombei) (DSM 6539)^Clostridium methoxybenzovorans (DSM 12182)、 Clostridium ragsdalei (DSM 15248)、类味梭菌（Clostridium scatologenes) (DSM 757)、梭菌属种ATCC 29797、库氏脱硫肠状菌（Desulfotomaculum kuznetsovii) (DSM 6115)、热苯脱硫肠状菌thermosyntrophicum亚种（Desulfotomaculum thermobezoicum subsp · thermosyntrophicum) (DSM 14055)、粘液真杆菌（Eubacterium limosum) (DSM 20543)、·乙酸甲焼八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)C2A (DSM 2834)、穆尔氏菌 属种HUC22_l(Moorella sp. HUC22-1)、热醋穆尔氏菌（Moorella thermoacetica) (DSM 521)、热自养穆尔氏菌（Moorella thermoautotrophica) (DSM 1974)、Oxobacter pfennigii (DSM 322)、Sporomusa aerivorans (DSM I3326)、卵形鼠抱菌（Sporomusa ovata)(DSM 2662)、Sporomusa silvacetica (DSM 10669)、球形鼠抱菌（Sporomusa sphaeroides) (DSM 2875)、白蚁鼠抱菌（Sporomusa termitida) (DSM 4440)和凯伍热厌 氧菌（Thermoanaerobacter kivui)(DSM 2030)〇3. 权利要求1或2的混合物，其中所述处于指数生长期的第一产乙酸微生物具有0.01-2 1Γ1的生长速率。4. 前述权利要求中任一项的混合物，其中所述处于指数生长期的第一产乙酸微生物具 有0.01-2的 OD6〇〇d5. 前述权利要求中任一项的混合物，其中所述好氧条件为氧气处于0.000005体积%-1 体积%的浓度的结果。6. 前述权利要求中任一项的混合物，其中所述反应混合物进一步包含 -能够进行乙醇羧酸发酵途径并转化乙酸和/或乙醇形成酸的第三微生物，且 其中所述第一和/或第二产乙酸微生物能够转化酸为相应的高级醇。7. 权利要求6的混合物，其中所述第三微生物表达选自E1至E11的至少一种酶，其中EiS 醇脱氢酶(adh)，E2为乙醛脱氢酶(ald)，E3为乙酰乙酰-CoA硫解酶(thl)，E4为3-羟基丁酰 基-CoA脱氢酶(hbd) 45为3_羟基丁酰基-CoA脱水酶(crt)，E6为丁酰基-CoA脱氢酶(bed)，E7 为电子转移黄素蛋白亚基(etf )，E8为辅酶A转移酶(cat)，E9为乙酸激酶(ack)，Eiq为磷酸转 乙酰酶(pta)且Ειι为转氢酶。8. 权利要求6或7的混合物，其中所述第三微生物选自克氏梭菌（Clostridium kluyveri)和C·Carboxidivorans 〇9. 权利要求6-8中任一项的混合物，其中所述第一和/或第二微生物为扬氏梭菌且所述 第三微生物为克氏梭菌。10. 前述权利要求中任一项的混合物，其中所述碳源包含C0。11. 权利要求6-11中任一项的混合物，其中所述高级醇可以选自1-丁醇、2-甲基-1-丁 醇、异丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、1-辛醇、1-戊醇、1-庚醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己 醇、5-甲基-1-庚醇、4-甲基-1-戊醇、5-甲基-1-己醇、6-甲基-1-庚醇及其组合。12. 在好氧条件下从碳源生产乙醇和/或乙酸的方法，其中所述方法包括 (a)接触反应混合物，所述反应混合物包含 一处于指数生长期的第一产乙酸微生物； 一游离氧;和 一处于稳定期的第二产乙酸微生物 其中所述第一和第二产乙酸微生物能够转化碳源为乙酸和/或乙醇。13. 权利要求12的方法，其中所述反应混合物为权利要求1-11中任一项的混合物。14. 在好氧条件下从碳源生产至少一种高级醇的方法，所述方法包括 (a)在好氧条件下使权利要求6-11中任一项的反应混合物与碳源接触。
【文档编号】C12P7/54GK105821084SQ201610054186
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年1月27日
【发明人】T.哈斯, T.比尔特, M.德姆勒, S.贝克
【申请人】赢创德固赛有限公司