改善的IgG4 类抗体的制作方法
【专利摘要】本发明提供了IgG4类抗体，其包含至少一个含有CH1结构域和铰链区的重链，其中在每一个重链中：a.所述CH1结构域中根据Kabat编号系统编号的位置127上的链间半胱氨酸被另一种氨基酸置换；并且，b.位于上铰链区中的一个或多个氨基酸被半胱氨酸置换。
【专利说明】改善的lgG4类抗体
[00011 本申请是申请日为2011年8月19日、申请号为201180040277.1、发明名称为"改善 的IgG4类抗体"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 本发明涉及与野生型抗体相比较具有改变的二硫键排列的改善的抗体和产生所 述改善的抗体的方法。
[0003] 包括重组蛋白质、单克隆抗体(mAb)和基于核酸的药物的生物药剂工业正在快速 发展。抗体工程已导致抗体片段或替代形式的设计和产生。当选择基于抗体的蛋白质作为 治疗剂时，要考虑优选的分子形式以及其它方面例如产品得率(production yield)、蛋白 质质量和贮存稳定性。
[0004] 所有免疫球蛋白（Ig)分子的基本结构包含，通过二硫键偶联的两个相同的重链 (HC)和两个相同的轻链(LC)。每一个LC由可变结构域(V l)和恒定结构域(Cl)组成。基于HC，5 个主要的Ig种类公认为：IgG、IgA、IgD、IgE和IgM。对于IgG，HC由一个可变结构域(V H)和三 个恒定结构域(CHl-3)组成。CH2和CH3结构域形成了负责刺激效应子功能的分子的Fc部分， 并且通过赋予IgG分子柔性的铰链区连接至Fab片段(VhVl和ChCl)。两个抗原识别位点位于V l 和Vh结构域的末端。I gG还被细分成4个不同的同种型：I gGI、I gG2、I gG3和I gG4。
[0005] Fe-介导的效应子功能，即抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性 (CDC)，是同种型依赖性的。每一个同种型已进化来进行体内的特定功能。IgGl同种型因其 延长的半衰期、增强的ADCC激活和补体激活而目前被最广泛地用作治疗剂。取决于靶和期 望的作用，其它同种型也被当作治疗剂。例如，当仅中和靶抗原并且效应子功能不太重要 时，可使用替代性同种型例如IgG2和IgG4。或者，可考虑具有再工程化的Fe/效应子功能的 IgG0
[0006] IgG2也具有最小的相关效应子功能，且易于二聚化(这尚未被完全理解）。由于其 相对缺乏效应子功能的诱导，因此IgG4仍然是有用的同种型。然而，IgG4还具有一些固有的 使用难题，即其形成半抗体的倾向、其交换半分子的能力及其较短的血清半衰期。
[0007] 在体外，IgG4分子符合典型的IgG结构，但在体内已观察到，它们形成各自包含单 个轻链和单个重链的半分子(通过在铰链区内形成重链内二硫键而引起）。已观察到大百分 比的循环IgG4是双特异性的，但功能上是单价的。这是因为半分子可与其它IgG4半分子形 成IgG4(Schuurman,J·,Van Ree,R.,Perdok,G.J.,Van Doorn,H.R.,Tan,K.Y.,Aalberse, R.C.,1999.Normal human immunoglobulin G4is bispecific: it has two different antigen-combining sites. Immunology 97,693-698)。
[0008] 可通过在铰链中的位置241(根据Kabat编号系统编号的）上引入Ser至Pro的突变 来减少 IgG4 半分子的形成（Angal ,S.等人，1993.A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4)antibody.Mol Tmmunol 30,105-108)。此外，该点突变不影响IgG4的紧凑结构，从而使得IgG4能够保留其减弱的激 活补体的能力。
[0009] 在发现S241P突变后，已研究了 IgG4的其它突变，以理解IgG4抗体的重链间相互作 用，减弱IgG4的效应子功能并且增加结构稳定性。在Schuurman等人（Schuurman ,J等人， 2001.The inter-heavy chain disulphide bonds of IgG4are in equilibrium with intra-chain disulphide bonds .Molecular Immunology 38,1-8)中，使用IgG4突变体研 究了观察到的IgG4的重链间二硫键的不稳定性。在突变体Ml中，参与重链-轻链间（a-c H1) 二硫键的Cy s 131 (根据EU编号系统编号的或根据Kabat编号系统的Cy s 127)被丝氨酸替 代，并且发现该突变体导致轻链二聚体和重链二聚体的形成。在突变体M2中，参与铰链中的 重链间二硫键的半胱氨酸226(根据EU编号系统编号的226或根据Kabat编号系统的239)被 丝氨酸替代，并且发现该突变体与IgG4相比较具有更稳定的重链间连接并且阻止重链内二 硫键的形成。
[0010 ]为了减少I gG4抗体的聚集物的形成，还已研究了 I gG4抗体的CH2和CH3结构域中的 突变。US 2008/0063635Takahashi等人已研究了这样的IgG4突变体，其中CH3结构域中的位 置409(根据EU编号系统编号的409或根据Kabat编号系统编号的440)上的精氨酸被赖氨酸、 苏氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸置换，以在低PH下抑制聚集物形成。为了减弱CDC活性，还教导了 L235、D265、D270、K322、P329和P331(根据EU编号系统编号的L235、D265、D270、K322、P329和 P331或根据Kabat编号系统编号的1^248、0278、0283、1(341、？348和？350)上的其它突变。 TO2008/145142Van de Winkel等人公开了，即使在铰链区中的S228P(根据EU编号系统编号 的S228或根据Kabat编号系统编号的S241)突变不存在的情况下，通过置换位置409上的精 氨酸残基、位置405上的Phe残基或位置370上的Lys残基(根据EU编号系统编号的409、F405 和K370或根据Kabat编号系统编号的R440、F436和K393)，具有减弱的进行Fab-臂交换的能 力的稳定的I gG4抗体。
[0011]先前已研究了存在于抗体的铰链区中的半胱氨酸残基的数目的改变。US 5677425B〇dmer等人公开了，为了有利于使用半胱氨酸巯基连接效应子或报道分子，可增加 铰链区中半胱氨酸残基的数目。US 5677425还教导，为了有利于装配抗体分子，可将铰链区 中的半胱氨酸残基的数目减少至1个（由于其仅是形成单个二硫键所必需的），这将为将铰 链区连接至另一个铰链区或至效应子或报道分子提供特异性靶。
[0012]然而，仍然需要提供具有使得它们甚至更适合用作治疗剂的改良的性质的新型抗 体。本发明提供了与野生型抗体相比较具有有利性质(包括改善的生物物理性质）的新的突 变型抗体。特别地，已令人惊讶地发现，对与轻链中的半胱氨酸形成二硫键的IgG4抗体重链 中的半胱氨酸残基位置的修饰提供了，与野生型IgG4抗体相比较，具有提高的稳定性的 IgG4抗体。
[0013] 发明概述
[0014] 在一个方面，本发明提供了 IgG4类抗体，所述抗体包含至少一个含有ChI结构域 和铰链区的重链，其中在每一个重链中：
[0015] a.ChI结构域中根据Kabat编号系统编号的位置127上的链间半胱氨酸被另一个氨 基酸置换;和
[0016] b.位于上铰链区（upper hinge region)中的一个或多个氨基酸被半胱氨酸置换。
[0017] 与轻链中的半胱氨酸形成链间二硫键的ChI结构域中的半胱氨酸为根据Kabat编 号系统编号的位置127上的半胱氨酸，且示于图Ib中。
[0018] 改变IgG4恒定区中的二硫键的位置导致，对于Fab结构域观察到更高的TmjO%的 蛋白质解折叠时的温度被指定为Tm。根据实验，Tm被测定为例如荧光-对-温度曲线的拐点 (即，荧光-对-温度曲线最陡峭时的温度）。
[0019] 因此，更高的Tm反映出更高的热稳定性。因此，本公开内容的分子具有更高的热稳 定性。
[0020] 然而，不希望受理论束缚，这可以是因为所获得的二硫键或多肽分子的应力（s train)或内部张力的减小。
[0021] 还可通过将其它修饰引入I gG4恒定区来获得热稳定性的进一步提高。
[0022] 位于上铰链区中的被半胱氨酸置换的一个或多个氨基酸可选自根据Kabat编号系 统编号的226、227、228、229、230、237和238，如图113中显示的（上铰链区中以下划线标示的 氨基酸）。
[0023] 在优选实施方案中，位于上铰链区中的被半胱氨酸置换的一个或多个氨基酸为选 自根据Kabat编号系统编号的227、228、229和230的位置上的氨基酸中的一个或多个，如图 Ib和2a中显示的。在该较后的排列中，随后形成的链间（轻链-重链)二硫键的位置与IgGl恒 定区中发现的二硫键类似。
[0024]本发明人已确定，IgGl在Fab和Fc结构域中具有比IgG4分子更高的热稳定性。然 而，本公开内容使得能够提供不具有ADCC效应子功能但具有如IgGl分子的热稳定性和/或 其它有利性质的IgG4分子。
[0025]显示存在影响形成的IgG4分子中的Fab结构域的稳定性的3个一般方面。第一个 方面是二硫桥的位置。第二个方面是靠近二硫桥的环境，即二硫键周围的残基的性质，第三 个方面是上铰链区的长度。
[0026]因此，本发明还提供了，包含具有上铰链、核心和下铰链（Iower hinge)的重链的 IgG4抗体，并且其中重链或每一个重链中的所述上铰链和核心在长度上为13至17个，例如 15个氨基酸。
[0027]在一个实施方案中，IgG4抗体具有长度为15个氨基酸的上铰链和核心。
[0028]在一个实施方案中，上铰链和核心包含在IgG4铰链中发现的天然12个氨基酸和3 个其它的氨基酸，例如3个丙氨酸残基或3个甘氨酸残基或其组合。
[0029]在一个实施方案中，铰链具有下列序列之一： ESKyGPPAAACTSCP SEQiD No: 72 ESKYGPPGGGCTSCP SEQlD No: 73 FSKYGPPTHTCPSCP SFQ ID No: 74 ESKYGDKTHTCPSCP SEQ ID No: 75 EPSKYGPPAAACPSCP SEQ ID No: 76 EPSKVGPPGCiGCF'SCT SEQID No: 77
[0030] EPSKVGPPTH IX PSCP SEQ ID No: 78 FPSKYGDKTHTCPSCP SFQ ID No: 79 ESKSYCjPPAAACPSCP SEQ ID'No: 80 CSKSYGPPGGGCPSCP SCQ ID No: 8i ESKSYGPPTHTCPSCP SEQ ID No: 82 tSKSYGDKI H l CPSCP SHQiD No: 83 FSKYGPPAAACPPCP SFQID No: 84 ESKYGPPGGGCPPCP SEQ ID No: 85
[SKYGmtncmiP seq idn0： 86 ESKYGDKTHTCTPCP SEQ ID No: 87 EPSKYGPPAAACPPCP SEQ ID No: 88 EPSKYGPPGGGCPPCP SEQ iDNo: 89
[0031] EPSKYGPPTIITCPPCP SEQ IDNo: 90 EPSKYGDKTHTCPPCP SEQ ID No: 91 ESKSYGPPAAACPPCP SEQ IDNo: 92 HSKSYGFPCiGGt'PPCP SEQ iDNo: 93 ESKSYGPPTHTCPPCP SEQ IDNo: 94 F.SKSYGDKTHTCPPCP SEQ IDNo: 95
[0032] 在一个实施方案中，本公开内容的IgG4分子中的上铰链和核心由天然IgGl铰链 (即EPKSCDKTHTCPPC SEQ ID No:96)或其衍生物组成，所述衍生物例如： EPi^CDKAAACPPGP SEQ ID No: 97 EPKSCDKGGGCPPCP SEQ ID No: 98 EPKSCDKTHTSPPCP SEQ ID No: 99 EPKSCDKTHTC PPSP SEQ ID No: 100 EPKSCDKTHTSiiPSP SEQ ID No: 10!
[0033] EPKSCDKAAASPPCP SEQ ID No: 102 EPKSCDKAAACPPSP SBQ ID No: 103 HPKSC'DKAAASPPSl5 SliQ ID No: 104
[?PKSC'DKGGiiSPF^'P S1：：Q ID No: 105 EPKSCDKGGGCPPSP SEQ ID No: 106 F.PKSCDKGGGSPPSP SEQ ID No: 107
[0034] 在其它方面，本发明提供了 IgG4类抗体，所述抗体包含至少一个含有ChI结构域和 铰链区的重链，其中在每一个重链中：
[0035] ChI结构域中根据Kabat编号系统编号的位置127上的链间半胱氨酸被另一个氨基 酸置换;和
[0036]其中的重链或每一个重链中的铰链的长度为15个氨基酸。
[0037]上文中描述了适当的铰链。
[0038]在其它方面，本发明还提供了 IgG4类抗体，所述抗体包含至少一个含有ChI结构域 和铰链区的重链，其中在每一个重链中：
[0039] a.根据Kabat编号系统编号的位置127上的半胱氨酸被另一个氨基酸置换;和 [0040] b.根据Kabat编号系统编号的位置239上的半胱氨酸或位置242上的半胱氨酸被另 一个氨基酸置换。
[0041 ]在根据本发明的后一方面的一个实施方案中，IgG4分子还在铰链区中包含22个氨 基酸，例如如上文中所描述的。
[0042]本发明提供的抗体与野生型IgG4抗体相比较具有有利的性质。已令人惊讶地发 现，本发明的抗体与野生型IgG4抗体相比较，显示提高的热稳定性，特别地Fab结构域的提 尚的热稳定性。
[0043] 在其它方面，本发明还提供了 IgG3类抗体，其包含至少一个含有ChI结构域和铰链 区的重链，其中在每一个重链中：
[0044] a. ChI结构域中的与轻链中的半胱氨酸形成链间二硫键的半胱氨酸被另一个氨基 酸置换;和
[0045] b.位于上铰链区中的一个或多个氨基酸被半胱氨酸置换。
[0046] 在其它方面，本发明提供了IgM类抗体，其包含至少一个含有ChI结构域和Ch2结构 域的重链，其中在每一个重链中：
[0047] a. ChI结构域中的与轻链中的半胱氨酸形成链间二硫键的半胱氨酸被另一个氨基 酸置换;和
[0048] b.位于ChI结构域或Ch2结构域中的一个或多个氨基酸被半胱氨酸置换。
[0049] 在其它方面，本发明提供了 IgD类抗体，其包含至少一个含有ChI结构域和铰链区 的重链，其中在每一个重链中：
[0050] a. ChI结构域中的与轻链中的半胱氨酸形成链间二硫键的半胱氨酸被另一个氨基 酸置换;和
[0051 ] b.位于铰链区中的一个或多个氨基酸被半胱氨酸置换。
[0052] 本发明还提供了包含编码本发明的抗体的序列的表达载体和包含所述表达载体 的宿主细胞。
[0053] 本发明还提供了如上定义的抗体，其用于治疗疾病或障碍。还提供了用于治疗疾 病或障碍的方法，其包括施用治疗有效量的如上定义的抗体。
[0054] 在一个实施方案中，所述抗体用于治疗除癌症外的疾病。
[0055] 附图概述
[0056]图Ia显示IgGl野生型和IgG4野生型的人ChI和铰链序列（其中铰链残基以下划线 标示)和κ轻链恒定序列。
[0057] 图Ib显示：
[0058] 标出了形成链间α-CHl二硫键的半胱氨酸（以下划线标示)的人K轻链恒定序列；
[0059] 人IgGl、2、3和4重链N-末端ChI残基和铰链区序列，其中标出了形成链间Cl-ChI二 硫键的半胱氨酸位置(在IgGl的上铰链中和在IgG2、3和4的N末端ChI中）（以下划线标示）；
[0060] 人IgD重链N-末端ChI残基和部分铰链区序列，其中显示了N-末端ChI序列中形成链 间a-cHi二硫键的半胱氨酸位置(以下划线标示）；
[0061 ] 人IgM重链N末端ChI、C末端ChI残基和选择的N末端Ch2残基，其中显示了N末端ChI 中形成链间a-cHi二硫键的半胱氨酸位置(以下划线标示）；和
[0062] I gG3和I gG4上铰链、I gD的铰链中和I gM的C末端ChI和Ch2中的残基，其中下划线标 示的残基表示其中一个或多个残基可被半胱氨酸置换的本发明抗体中的位置。
[0063] 图2a显示IgGl野生型、IgG4野生型的与轻链中的半胱氨酸形成链间二硫键的ChI 半胱氨酸残基(C127)和上铰链及核心铰链残基，以及在本发明的IgG4抗体中引入突变的位 置。
[0064]图2b显示了 IgG3野生型的与轻链中的半胱氨酸形成链间二硫键的ChI半胱氨酸残 基(C127)和其中在本发明的IgG3抗体中一个或多个残基被半胱氨酸置换的位置。
[0065]图2c显示了 I gM野生型的与轻链中的半胱氨酸形成链间二硫键的ChI半胱氨酸残 基(C127)和选择的ChI和Ch2残基，以及其中在本发明的IgM抗体中一个或多个残基被半胱氨 酸置换的位置。
[0066]图2d显示了 IgD野生型的与轻链中的半胱氨酸形成链间二硫键的ChI半胱氨酸残 基(Cl28)和铰链残基，以及其中在本发明的IgD抗体中一个或多个残基被半胱氨酸置换的 位置。
[0067]图3a显示引入根据本发明的IgG4抗体的突变。
[0068]图3b显示图3a中显示的IgG4抗体的突变的重链的残基的位置和可与轻链(LC)或 与另一个突变的重链(HC)中的半胱氨酸形成的预测的二硫键的位置。其中半胱氨酸可与LC 或HC中的半胱氨酸键合，下划线标示的链为预测的占优势的二硫键排列。
[0069]图4a显示引入根据本发明的IgG4抗体的突变。
[0070]图4b显示图4a中显示的IgG4抗体的半胱氨酸残基的位置和可与轻链(LC)或重链 (HC)中的半胱氨酸形成的预测的二硫键的位置。其中半胱氨酸可与LC或HC中的半胱氨酸键 合，下划线标示的链是预测的占优势的二硫键排列。
[0071]图5显示根据本发明的IgG4抗体的ChI和铰链区的序列。
[0072]图6显示根据本发明的IgG4抗体的ChI、铰链区、Ch2和Ch3的序列。
[0073]图7显示根据本发明的抗体的Wes tern印迹分析，其中顶部凝胶显示使用抗-人Fc 抗体的结果，底部凝胶显示使用抗-K抗体的结果。
[0074]图8显示根据本发明的抗体的Western印迹分析，其中顶部凝胶显示使用抗-人Fc 抗体的结果，底部凝胶显示使用抗人κ抗体的结果。
[0075]图9显示根据本发明的抗体的Western印迹分析，其中顶部凝胶显示使用抗-人Fc 抗体的结果，底部凝胶显示使用抗人κ抗体的结果。
[0076]图10显示根据本发明的抗体的Western印迹分析，其中顶部凝胶显示使用抗-人Fc 抗体的结果，底部凝胶显示使用抗-人κ抗体的结果。
[0077]图11显示本发明的抗体的Thermof Iuor分析的结果，其显示Fab和Ch2结构域的热 稳定性。
[0078]图12显示本发明的抗体的Thermof Iuor分析的结果，其显示Fab和Ch2结构域的热 稳定性。
[0079]图13显示本发明的抗体的Thermof Iuor分析的结果，其显示Fab和Ch2结构域的热 定性。
[0080]图14显示本发明的抗体的Thermof Iuor分析的结果，其显示Fab和Ch2结构域的热 定性。
[0081 ]图15显示本发明的选择的抗体的热稳定性的评级。
[0082]图16显示本发明的选择的抗体和对照抗体的亲和测定的结果。
[0083]图17显示本发明的选择的抗体的HPLC分析的结果。
[0084]图18显示根据本发明的具有不同连接体的抗体的Western印迹分析。
[0085 ]图19显示根据本发明的具体不同连接体的抗体的We s tern印迹分析。
[0086]图20至24根据本发明的具有各种突变的抗体的Western印迹分析。
[0087]图25和26显示各种抗体(包括根据本发明的某些抗体)的ADCC效应子功能。
[0088]图27显示根据本发明的各种抗体的表达。
[0089] 图28显示抗体赫赛汀(Herceptin)的各种突变的Western印迹。
[0090] 图29显不抗体Tysabri的各种突变的Wes tern印迹。
[0091 ] 图30显不抗体Actemra的各种突变的Western印迹。
[0092 ]图31至34显示根据本发明的各种抗体的Thermof Iuor分析的结果。
[0093] 序列概述
[0094] SEQ ID NO: 1显示IgGl野生型抗体的CHl和铰链区序列。
[0095] SEQ ID NO:2显示IgG4野生型抗体的CHl和铰链区序列。
[0096] SEQ ID NO:3显示人野生型κ轻链的恒定区的部分。
[0097] SEQ ID N0:4显示人IgGl抗体的CHl结构域的N端序列的部分。
[0098] SEQ ID NO:5显示人IgGl抗体的铰链区。
[0099] SEQ ID N0:6显示人IgG2抗体的CHl结构域的N端序列的部分。
[0100] SEQ ID NO:7显示人IgG2抗体的铰链区。
[0101] SEQ ID N0:8显示人IgG3抗体的CHl结构域的N端序列的部分。
[0102] SEQ ID NO:9显示人IgG3抗体的铰链区。
[0103] SEQ ID NO: 10显示人IgG4抗体的CHl结构域的N端序列的部分。
[0104] SEQ ID NO: 11显示人IgG4抗体的铰链区。
[0105] SEQ ID 吣8:12至37分别显示抗体6、7、8、15、16、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、44、45、46、47、2、3、48、28P 和 44P 的 CHl结构域和铰链区序列。
[0106] SEQ ID N0s:38至63分别显示抗体6、7、8、15、16、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、44、45、46、47、2、3、48、28?和44?的011结构域、铰链区、012结构域和013结构域序 列。
[0107] SEQ ID从):64显示野生型1864012和(：!13结构域序列。
[0108] SEQ ID从):65显示野生型1864012和野生型1861013结构域序列。
[0109] SEQ ID NO:66显示人野生型κ轻链的恒定区序列。
[0110] SEQ ID N0:67显示人Ig⑶抗体的CHl结构域的N端序列的部分。
[0111] SEQ ID N0:68显示人IgGD抗体的铰链区的部分。
[0112] SEQ ID N0:69显示人IgGM抗体的CHl结构域的N端序列的部分。
[0113] SEQ ID N0:70显示人IgGM抗体的CHl结构域的C端序列的部分。
[0114] SEQ ID N0:71显示人IgGM抗体的CH2结构域的部分。
[0115] SEQ ID NO:72至295显示各种铰链区。
[0116] 本发明的优选实施方案的详述
[0117] 现将更详细地描述本发明。
[0118] 除非上下文中另有所指，否则术语"蛋白质"和"多肽"在本文中可互换使用。"肽" 意指10个或更少的氨基酸。
[0119] 除非上下文中另有所指，否则术语"多核苷酸"包括基因、DNA、cDNA、RNA、mRNA等。
[0120] 如本文中所使用的，在本说明书的上下文中术语"包含"应当解释为"包括"。
[0121] 在本发明的上下文中，术语"野生型"意指，不包含任何遗传工程突变的、如其可天 然存在或可从环境分离的抗体。
[0122] 本文中的置换突变体的名称由字母后跟数字后跟字母组成。第一个字母表示野 生型蛋白质中的氨基酸。数字是指其中进行氨基酸置换的氨基酸位置，第二个字母表示用 于替代野生型氨基酸的氨基酸。
[0123] 抗体可变和恒定结构域中的残基按照Kabat等人设计的系统常规地进行编号。该 系统不于Kabat等人，1987，Sequences of Proteins of Immunological Interest ,US Department of Health and Human Services,NIH,USA(在下文中缩写为"Kabat等人（同 上)"）中。
[0124] Kabat残基命名并不总是直接对应于氨基酸残基的线性编号。实际的线性氨基酸 序列可包含比严格Kabat编号更少或更多的氨基酸，对应于结构组件(无论是基本可变结构 域结构的构架区还是互补决定区（CDR))的缩短或至其内的插入。可通过将抗体序列与"标 准" Kabat编号的序列中具有同源性的残基进行比对来确定给定的抗体的残基的正确Kabat 编号。
[0125] 或者，氨基酸残基的编号可通过EU-索引或EU编号系统（也描述于Kabat等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5片反.Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda,MD. (1991)中）来进行。
[0126] 抗体中的氨基酸残基的其它编号系统为IMGT编号系统（Lefranc，M.-P.等人， Dev. Comp.Tmmunol·，29，185-203(2005))。
[0127] 除非其中另外指出使用EU编号系统或IMGT编号系统，否则将Kabat编号系统用于 本说明书。
[0128] 在4个IgG4同种型之间，重链与轻链中的链内二硫键排列相似，然而，链间二硫键 排列对于每一种同种型是独特的[由（Wypych，J.，Li，M.，Guo，A.，Zhang，Z.，Martinez，T.， Allen,M.J.,Fodor,S.,Kelner,D.N.,Flynn,G.C.,Liu,Y.D.,Bondarenko,P.V.,Ricci, M.S·,Dilion,T·Μ·,Balland,A·,2008·Human IgG2antibodies display disulphide-mediated structural isoforms.J Biol Chem.283,16194-16205)综述]。
[0129] 如图lb中所示，4个IgG4同种型的铰链区序列存在差异。完整或起源的（genetic) 铰链区通常由残基226至251(基于Kabat编号系统编号的）组成。图Ib显示4个IgG4同种型 的铰链区的上部分、核心部分和下部分。对于IgGl同种型，上铰链区为残基226至238,核心 铰链区为残基239至243以及下铰链区为残基244至251。对于IgG4同种型，上铰链区为残基 226至238，核心铰链区为残基239至243，以及下铰链区为残基244至251。
[0130]因此，IgGl中包含上铰链、核心和下铰链的铰链的长度为23个氨基酸，如图Ia中显 示的。上铰链为10个氨基酸。核心为5个氨基酸，下铰链为8个氨基酸，参见例如图lb。
[0131] IgG4中包含上铰链、核心和下铰链的铰链的长度为20个氨基酸，如图Ia中显示的。 上铰链为7个氨基酸。核心为5个氨基酸，下铰链为8个氨基酸，参见例如图Ib。
[0132] 已通过修饰IgG4内的链间二硫键排列，开发了根据本发明的新型突变型IgG4抗 体，具体地已修饰了轻链(LC)与重链(HC)之间的Cl-Ch 1链间二硫键排列。
[0133]图Ib显不了IgG 1-4同种型的人IgG重链和轻链序列的部分，标出了形成Cl-ChI链 间二硫键的半胱氨酸位置（以下划线标示）<JgGl的Cl-ChI间二硫键形成于LC C214(Kabat编 号系统）与正好在铰链区之前的HC的C233(Kabat编号系统)之间。相反地，IgG2、3和4的Gd-Cl二硫键形成于LC C214与HC的链内二硫键N端的C127之间。在图Ib中显示和比对了参与Cl-ChI二硫键形成的半胱氨酸残基周围的LC和HC序列。
[0134] 本发明已研究了，Cl-ChI二硫键如何影响IgG4抗体的性质，包括抗体的热稳定性、 结构稳定性、二硫键同种型异质性(disulphide isoform heterogeneity)及亲和力。
[0135] 通过用另一种氨基酸置换IgG4的Chi内位置127上的半胱氨酸残基以及用半胱氨酸 置换上铰链区内的一个或多个氨基酸，优选在选自根据Kabat编号系统编号的227、228、229 和230的位置上的氨基酸来产生IgG4的突变体。位置227、228、229或230位于IgGl半胱氨酸 233所处的等同结构位置上或其附近。
[0136] 各个重链可包括其它突变，包括用另一种氨基酸置换IgG4铰链区的半胱氨酸残基 239和242之一或两者。在位置238与239之间使IgG4上铰链区延长3个氨基酸以与IgGl铰链 的长度相同的突变也包括在一些抗体中。S241P突变也被引入一些抗体中。
[0137] 已发现，根据本发明的突变型IgG4抗体显示有利的性质。
[0138] 在一个实施方案中，根据本发明的突变型IgG4抗体显示与野生型IgG4抗体相比较 增加的热稳定性。已令人惊讶地发现，已被突变以用另一种氨基酸替代ChI结构域中位置 127上的半胱氨酸并且其中已将半胱氨酸引入重链铰链区的位置227与230之间的突变型 IgG4抗体，与野生型IgG4抗体相比较显示改善的热稳定性。除去位置127上的半胱氨酸的突 变改变在重链与轻链之间（a-c H1)形成链间二硫键的位置，并且迫使轻链与在重链铰链区 中的位置227与230之间引入的半胱氨酸形成二硫键。因此，在一个实施方案中，提供了其中 半胱氨酸127被另一种氨基酸替代并且轻链的半胱氨酸通过二硫键连接至位置227、228、 229或230上的工程化半胱氨酸的IgG4抗体。
[0139]还令人惊讶地发现，通过将3个氨基酸添加至IgG4铰链区以延长IgG4铰链区进一 步提尚了热稳定性。
[0140]还已令人惊讶地发现，已被突变以用另一种氨基酸替代ChI结构域中的位置127上 的半胱氨酸且用另一种氨基酸替代重链铰链区中位置239或位置242上的半胱氨酸的突变 型IgG4抗体显示与野生型IgG4抗体相比较提高的热稳定性。
[0141]在一个实施方案中，本发明的抗体显示减少的所谓的半分子的形成。在C239上包 含突变但在C242上不具有突变的本发明的抗体通常显示减少的半分子形成。不希望受理论 束缚，据认为，这是因为位置239上的半胱氨酸的去除减少了重链中链内二硫键的形成，从 而与在C239或C242上不具有突变的抗体相比较减少了半分子的数目。在C242上具有突变但 在C239上不具有突变的抗体与在C239上具有突变但在C242上不具有突变的抗体相比较，显 示形成更多的半分子。不希望受理论束缚，据认为位置239上的半胱氨酸与位置242上的半 胱氨酸相比，更具反应性，并且能够与重链的铰链半胱氨酸或轻链半胱氨酸形成二硫键。
[0142] 在C239和C242上都具有突变的抗体因两个重链之间无链间二硫键形成而形成高 比例的半分子。然而，在C239和C242上都包含突变的抗体因经由非共价键的重链的键合而 仍然能够形成完整抗体分子。
[0143] 也在具有S241P突变的抗体中观察到减少的半分子形成。
[0144] 在一个实施方案中，上铰链和核心区域选自下列序列之一： ESKYGPPC'PSCP SEQ IFi No: 108 ESKYGDKCPSCP SEQ ID No: 109 EPSKYGPPCPSCP SEQ ID No: HO EPSKYGDKCPSCP SEQID No: III ESKSYGPPCPSCP SEQ ID No: 112 ESKSYGDKCPSCP SEQ ID No: 1.13 ESKYGPPAACPSCP SEQ IDNo; 114 HSKYCiPPCiGCPSCP SHQ ID No： 115 ESKYGPPHTCPSCP SEQ ID No: 116 ESKYGDKHTCPSCP SEQ ID .No: 117 EPSKYGPPAACPSCP SEQ ID No: 118 FJ>SKYGPPGGCPSC'i> SHQ ii) No: 119 EPSKYGPPIITCPSCP SEQ ID No: 120 EPSKYGDKHTCPSCP SEQ ：! D No: 121 ESKSYCiPPAAi'PSCP SbQ ID No: 122 ESKSYGPPGGCPSCP SEQ ID No: 123
[0145] ESKSYGPPHTCPSCP SEQ ID No: 124 ESKS Y GdkhtcfjSCp seq id n〇： 12.5 ESKYGPP ACPSCP SEQ ID No: 126 ESKYGPPGCPSCP SEQ ID No: 127 ESKYGPPTTCPSCP SEQ ID No: 128 BSKYCiDK rrCIiSOs SCQ ID No: 129 EPSKYGPPACPSCP SEQ ID No: 130 EPSKYGPPGCPSCP SEQ II) No: DI EPSKYGPPTTCPSC'P SEQ ID No: 132 EPSKYGDKTT'CPSCP SEQ ID No: 133 ESKSYGPPACPSCP SEQ ID No: 134 ESKSYGPPGCPSCP SEQ ID No: 135 KSKSYGPP Il CPSCP SHQ ID No: 136 ESKSYGDKTTC：PSCP SEQ ID No: 137 ESKYGPPTHCPSCP SBQ ID No: 138 ESKY<iDKTHCPSC：P SEQ! D No: 139 rPSKYCiPPTIK'PSC'P sj-Q TD No: 140 tPSKYGDK i'I iCPSt'P SEQ ID No: 141 FiSKSYGPPTRnsSCP SRQ ID No: 142 ESKSYGDKTHCPSCP SEQiDNo: 143 ESKYGPPHTCPSCP SEQ ID No: 144 ESKYGDKHTCPSCP SEQ ID No: 145 EPSKYGPPHTCPSCP SEQ ID No: 146 EPStCYGDKHTCPSCP SEQ ID No: 147 iiSKSYtiPPHTCPSCP SEQ ID No: 148 ESKSYGDKt I TCPSCP SBQ !D No: 149 ESKYGPPTCPSCP SBQIDNo: 150 ESKYGDKI'CPSCP SEQ ID No: 151 EPSKYGPPTCPSCP SEQ ID No: 152 EiiSKYGDKTCPSCP SEQ ID No: 153 ESKSYGPPTCPSCP SEQ ID No: 154 ESKSYGDKJCPSCP SEQ ID No: 155 L-SKYGPFIICPSCP SIiQ ID No; 156
[0146] HSKYGI)KHCPSCP SI,Q ID No: 15? EPSKYGPPHCPSCP SEQ ID No: 158 EPSKYGDKeCPSCP SEQ ID No: 159 ESKSYGPPHCPSC'P SEQ ID No: 160 ESKSYGDKHCPSCP SEQ ID No: 161 EPKSCDKAACPPCP SEQ ID No: 162 EPKSCDKGGCPPCP SEQ ID No: 163 HSCDKJ1TSPPCP S^QIDNo: 164 FPKSt DKHTC PPSP STQ ID No: 165 EPKSCDKHTSPPSP SEQ LD No: 166 EPKSCDKAASFPCP SEQ ID No; 167 EPK.SCDKAACPPSP SEQ ID No: 168 EPKSCDKAASPPSP SEQ ID No: 169 EPfCSCDKGGSPPCP SEQ ID No: 170 EPKSC：DKGCi(；PPSP SEQ ID No: 171 I^PKSC DKGGSPPSP SRQ ID No: 172 EPKSCDKACPPCP SEQ ID No: 173 EPKSCDKGCPPCP SEQ ID No： 174 EPKSCDBCrSPPCP SEQ ID No: 175 EPKSC'DKI CPPSP SEQ iD No: 176 EPKSCDKTSPPSP SEQ iD No: 177 EPKSCDKASPPCP SEQ !D No: 178 liPKSCDKACPPSP Si：：Q ID Ko: 179 EPKSCDKASPPSP SEQ ID No: 180 EPKSCDKCjSPPCP SEQID ISo: 181 EPKSCDKGCPPSP SEQ iDNo: 182 EPKSCDKGSPPSP SEQiDNo: 183 HPKSCDKC PPCP SHQ !D No: 184 EPKSCDKCPPCP SEQ ID No: 185 EFKSCDKSPPCP SEQ ID No: 186 EPKSCDtCCPPSP SEQ ID No: 187 EPK.SCDKSPPSP SFQ ID No: 188 LiPKSCDKSPPCP SHQ ID No: 189
[0147] RPKS( DKCPPSP SEQ iD No: 190 EPKSCDKSPPSP SEQ ID No: 191 EFKSCDKSPPCP SEQ ID No: 192 EPKSCDKCPPSP SEQ !.D No: 193 EPKSCDKSPPSP SEQ ID No: 194 FPKSCDKTl SPPC P SEQ ID No: 195 EFKSCDKTTCPPSP SEQ ID No: 196 EPKSCDKTTSPPSP SEQ ID No: 197 EPKSCDKTHSPPCP SEQ ID No; 198 EPK.SCDKTHCPPSP SEQ ID No: 199 EPKSC DKTHSPPSP SEQ !D No: 200 ESK.YGPPCPPCP SEQ ID No: 201 ESKYGPPCPPCP SEQ ID No: 202 ESKYGPPC'PPCP SEQ ID No: 203 ESKYGDKCPPCP SEQ ID No: 204 RPSKYGPPC'PPCP SFQ ID No: 205 EPSKYGPPCPPCP SBQ ID No: 206 LPSKYCrPPCPPC P SBQ ID No: 207 EPSKYGDKCPPCP SEQ ID Νυ: 208 ESKSYGPPCPPCP SEQ ID No: 209 IiSKSYGPPCIjPCF Si￡Q ID No: 210 ESKSYGPPCPPCP SEQ ID No: 211 ESKSYGDKCPPCP SEQ ID No: 212 !：；SKYCiPPAA(：；I>i>CP Sl：Q ID No: 21.? ESKYGPPGGCPPCP SEQ ID No: 214 ESKYGPPUTCPPCP SEQ ID No: 215
[SKY(H)KI ΙΤΠΨ(T Si：Q ID No: 216 EPSKYGPPAACPPCP SEQ IDT^o: 217 EPSKYCfPFGGCPPCP SEQ ID No: 218 FPSKYGPPIiTCPPCP SEQ ID No: 219 EPSK.YGDKHTCPPCP SEQ ID No: 220 ESKSYGPPAACPPCP SEQ ID No: 221 F.S!<SY(jPP(XK^PP('P SiiQ ID No: 222
[0148] ESKSYGPPHTCPPCP SEQ ID No: 223 ESKSYGDKi iTCPPCP SFiQ ID No: 224 RSKYGPPACPPCP SRQ TD No: 225 ESKYGPPGCPPCP SEQ ID No: 226 ESKYGPPTTCPPCP SEQ ID No: 227 ESK.YGDKTTCPPCP SEQ ID No: 228 EPSKYGPPACPPCP SEQ ID No: 229 EPSKYGPPGCPPC'P SEQ ID No: 230 EPSKYGPPTTCPPCP SEQ ID No: 231 EPSKYGDKTTCPPCP SEQ ID No: 232 ESKSYGPPACPPCP SEQ ID No: 233 ESKS'S GPFOCPPCP SEQ ID No: 234 ESKSYGPPTTCPPCP $F.Q ID Mr. 235 ESK&YGDK rrCPPCP SEQ ID No: 236 ESKYGPPTHCPPCP SEQ ID No: 237 ESKYGDKTHCPPCP SEQ ID No: 238 EPSKYtrPPTHCPPCT SEQ ID No: 239 !：；PSKYGDKTIICPP(T SEQ ID No: 240 ESKSYGPPTHCPPCP SEQID No: 241 ESKSYGDKTHCPPCP SEQ !DNo: 242 BSKYGIiPHrCIjPCij St；Q ID No: 24；i ESKYGDKmTPPCP SEQ !DNo: 244 EPSKYGPPHTCPPCP SEQ ID No: 245 EPSKYGDKH I CPijCF SEQ ID No: 246 ESKSYGPPHTCPPCP SEQ ID No: 247 ESKSYGDKHTCPPCP SEQ ID No: 248 HSKYGPFICPPCP SEQ ID No: 249 ESKYGDKTCPPCP SEQ ID No: 250 EPSKYGPPTCPPCP SEQ ID No: 251 EPSKYGDKTCPPCP SEQ ID No: 252 ESKSYGPPTCPPCP SEQ ID No: 253 ESKSYCiDKTCPPCP SEQ ID No: 254 ESKYGPPHCPPCP SEQ ID No: 255
[0149] ESK.YGDKHCPPCP SEQ ID No: 256 EPSKYGPPHCPPCP SEQ ID No: 25? EPSKYGDKHCPPCP SEQ ID No: 258 FSKSYGPPMCPPC P SEQ ID No: 259 ESKSYGDKHCPPCF SEQ iD No: 260 EPKSCDKTHTCFPCP SEQ ID No: 261 l；PKSC：DK I HK PS('P SHQ !i) No: 262 ESK.YCPPACPSCP SEQ ID No: 263 ESKYCPPAACPSCP SEQ ID No: 264 IiSKYCPPAAAt PSCI' Si：；Q ID No: 265 ESKYCPPAAASPSCP SEQ ID No: 266 ESKYCPPAAACPSSP SEQ ID No: 267 ESKCGPPAAACPSCP SEQ ID No: 268 ESKYCPPAAAACPSCP SEQ ID No: 269 ESK.YCPPAAAAACFSCP SEQ ID No: 270 ESKYCPPGGGCPSCP SEQ ID No: 271 ESKYCPPSSSCPSCP SEQ ID No: 272 ESKyCPPTCPSCP SEQ ID No: 273 EstcYCPPTHCFjSCP SEQ ID No: 274 ESKYCPPTHTCPSCP SEQ ID No: 275 ESKYC PKTHTCPSC'P SEQ ID No: 276 ESKYCDKTHTCFiSCP SEQ ID No: 277 ESKYCDKTHCPSCP SEQ ID No: 278 ESKYCDKTCPSCP SEQ ID No: 279 ESKYC'DKAAACPSCP SEQ ID No: 280 ESKYCDKCPSCP SEQ ID No: 281 ESKSCDKTHTCPS(T SEQ ID No: 282 EPKYCDKTHTCPSCP SEQ ID No: 2S3
[0150] EPKSCPPCPSrP SEQ ID No: 2M ESKSCPPCPSCP SEQ ID No: 285 EPK.YCPPCPSCP SEQ ID No: 286 CCKYGPPCPSCP SEQ ID No: 287 ECKYGPPSPSCP SEQ ID No: 288 FX'KYGPPrPSSP SEQ ID No: 289 ESCYGPPCPSCP SEQ ID No: 290 ESCYGPPSPSCP SEQ ID No: 291 ESCYGPPCPSSP SEQ ID No: 292 ESKCGPPCPSCP SEQ ID No: 293 ESKCGPPSPSCP SEQ ID No: 294 ESKCGPPCPSSP SEQ ID No: 295
[0151] 与野生型IgG4抗体相比较，根据本发明的抗体还显示相当的对靶抗原的亲和力。
[0152] 现更详细地描述对本发明的抗体的突变。用于置换氨基酸的方法在分子生物学领 域是公知的。此类方法包括例如，使用方法例如PCR以缺失和/或置换氨基酸的定点诱变或 合成序列的从头设计。
[0153] 图2a显示IgGl野生型、IgG4野生型的铰链残基和其中在本发明的抗体中引入突变 的位置。编号基于Kabat编号系统。
[0154] 根据本发明的抗体包括位置127(C127)上的突变，其中半胱氨酸残基被另一种氨 基酸，优选不包含巯基的氨基酸替代。关于替代或置换，我们意指，另一种氨基酸在通常可 见于抗体重链中的链间半胱氨酸127的位置上取代半胱氨酸。C127上的突变可以是将氨基 酸残基从半胱氨酸改变成另一种适当的氨基酸的对编码位置127上的氨基酸的核苷酸中的 1、2或3个核苷酸的任何适当突变。适当的氨基酸的实例包括丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甘氨 酸或任何极性氨基酸。特别优选的氨基酸为丝氨酸。
[0155] 用另一种氨基酸对位置127上的半胱氨酸的置换除去了 ChI结构域中通常与野生 型I gG4轻链中的半胱氨酸形成二硫键的半胱氨酸。因此，为了通过链间二硫键形成轻链和 重链配对，轻链必须与位于重链的铰链区中的半胱氨酸形成二硫键。
[0156] 在本发明的第一方面，根据本发明的抗体包含重链，其中选自根据Kabat编号系统 编号的227、228、229和230的位置上的一个或多个氨基酸被半胱氨酸置换。因此，根据本发 明的抗体可具有下列突变的一个或多个：
[0157] · S227C
[0158] . K228C
[0159] · Y229C
[0160] . G230C
[0161] 优选地，仅有一个选自227、228、229和230的残基被半胱氨酸残基置换。
[0162] 本发明的特别优选的抗体具有突变Y229C或G230C。
[0163] 在重链的铰链区的选自227、228、229和230的位置上包含半胱氨酸残基提供了用 于在重链与轻链之间形成链间二硫键的新位置。本发明人已发现，该新的链间二硫键排列 提供了，与野生型IgG4抗体相比较具有提高的热稳定性的IgG4抗体。
[0164] 可将其它突变引入本发明的该方面的抗体。在一个实施方案中，重链中根据Kabat 编号系统编号的位置239上的半胱氨酸(C239)和/或位置242上的半胱氨酸(C242)被另一种 氨基酸，优选不包含巯基的氨基酸置换。关于替代或置换，我们意指，另一种氨基酸在通常 可在抗体重链中见到半胱氨酸239和/或半胱氨酸242的位置上取代半胱氨酸。C239和/或 C242上的突变可以是，将氨基酸残基从半胱氨酸改变成另一种适当的氨基酸的对编码氨基 酸的核苷酸中的1、2或3个核苷酸的任何适当的突变。适当的氨基酸的实例包括丝氨酸、苏 氨酸、丙氨酸、甘氨酸或任何极性氨基酸。特别优选的氨基酸为丝氨酸。
[0165] 在一个实施方案中，重链的位置239上的半胱氨酸被另一个氨基酸置换，并且重链 的位置242上的半胱氨酸被另一个氨基酸置换。在该实施方案中，C239和C242上的置换除去 了重链的铰链区中通常与另一个重链中的相应半胱氨酸形成重链间二硫键的两个半胱氨 酸残基。所得的半分子可通过两个重链之间的非共价键合形成完整抗体分子。
[0166] 在备选实施方案中，重链的位置239上的半胱氨酸被另一种氨基酸置换。在该实施 方案中，位置242上的半胱氨酸不被另一种氨基酸置换。
[0167] 在其它备选实施方案中，重链的位置242上的半胱氨酸被另一种氨基酸置换。在该 实施方案中，位置239上的半胱氨酸不被另一种氨基酸置换。
[0168] C239或C242之一的置换在重链中留下一个半胱氨酸，其能够与另一个重链中的半 胱氨酸形成重链间二硫键。不希望受理论束缚，据认为铰链区中的一个半胱氨酸的置换，特 别地C239的置换减少了铰链区的链内二硫键的形成，从而减少了半抗体分子的形成。
[0169] 在其中位置227上的丝氨酸被半胱氨酸置换的本发明的一个实施方案中，抗体优 选不包含位置C239和C242上的突变。在其中位置227上的丝氨酸被半胱氨酸置换的另一个 实施方案中，重链的位置239上的半胱氨酸优选被另一种氨基酸置换，但位置242上的半胱 氨酸不被另一种氨基酸置换。
[0170] 在一个实施方案中，本发明的抗体包含经突变在氨基酸226与243之间插入一个或 多个氨基酸的IgG4重链。插入的氨基酸的数目可以为1至10,1至5,1至3个氨基酸，优选插入 1、2、3或4个氨基酸。优选在氨基酸238与239之间插入氨基酸。可将任何适当的氨基酸插入 铰链区，例如丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸及其组合。优选插入3个丙氨酸(AAA)、3个甘 氨酸(GGG)、3个丝氨酸(SSS)或3个苏氨酸(TTT)，或苏氨酸、组氨酸和另一个苏氨酸(THT)。 已发现包含经突变在铰链区中插入了 3个氨基酸的IgG4重链的本发明的抗体显示提高的热 稳定性。
[0171]可被引入根据本发明的抗体的其它突变为突变S241P。先前已显示，该突变减少半 分子的形成（Angal，S ·等人，1993 .A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4)antibody.Mol Immunol 30,105-108)〇
[0172] 根据本发明的抗体可在铰链区中包含一个或多个其它突变。例如，抗体还可包含 下列突变的一个或多个:S227P、Y229S、P237D和P238K。
[0173] 在一个实施方案中，根据本发明的抗体有效地包含残基226至243的IgGl铰链区 (上铰链和核心铰链）。因此，本发明的抗体包含铰链区，其中位置230上的甘氨酸被半胱氨 酸置换，位置227上的丝氨酸被脯氨酸置换，位置229上的酪氨酸被丝氨酸置换，位置237上 的脯氨酸被天冬氨酸置换，位置238上的脯氨酸被赖氨酸置换，氨基酸序列苏氨酸-组氨酸-苏氨酸被插入在位置238与239之间，位置241上的丝氨酸被脯氨酸置换。这些突变还可书写 为5227?、￥2295、6230^2370、？2381(1'!11'和5241?，如图23中所示。已发现这些其他突变至 IgG4铰链区的引入提供了具有提高的热稳定性的抗体。
[0174] 根据本发明的抗体优选具有从残基244至251的IgG4下铰链(APEFLGGP)。不受理论 束缚，据认为IgG4下铰链区促成了 IgG4抗体的效应子功能的不存在。
[0175] 在本发明的第二方面，抗体包含重链，其中位置127上的半胱氨酸被另一种氨基酸 置换，如上文中所描述的，并且重链中根据Kabat编号系统编号的位置239上的半胱氨酸或 位置242上的半胱氨酸被另一种氨基酸置换。在该第二方面，位置227、228、229和230上的残 基都未被半胱氨酸残基置换。
[0176] 已令人惊讶地发现，根据本发明第二方面的抗体具有与野生型IgG4抗体相比较提 尚的热稳定性。
[0177] 在本发明的第二方面，抗体可包含一个或多个其它突变。在一个实施方案中，抗 体包含经突变在氨基酸226与243之间，优选氨基酸238与239之间插入了3个氨基酸的IgG4 重链，如上文中所描述的。在其它实施方案中，抗体包含突变S241P。在其它实施方案中，抗 体还可包含下列突变的一个或多个:3227?、￥2293、？2370和?2381(。
[0178] 下面的表1列出了本发明的示例性抗体和与IgG4野生型序列相比较被引入的突 变。表1还包括野生型I gG 1和I gG4抗体以及对照抗体。
[0179] 表1:
[0182] 图3a和4a还显示了引入根据本发明的IgG4抗体的突变。图3b和4b显示了本发明的 IgG4抗体中的半胱氨酸残基的位置并且还显示了半胱氨酸与轻链(LC)或另一个重链(HC) 中的半胱氨酸的预测的键合。对于显示的半胱氨酸残基(LC或HC)，所述半胱氨酸能够结合 轻链或重链中的半胱氨酸，但据认为二硫键主要存在于以下划线标示的LC或HC之处。
[0183] 在优选实施方案中，本发明提供了包含至少一个重链的抗体，其中每一个重链包 含ChI结构域和铰链区并且每一个重链包含选自2、3、6、7、8、15、16、28、28P、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、44、44?、45、46、47和48的抗体的突变，如表1中显示的。因此，本发 明提供了包含至少一个重链的抗体，其中每一个重链包含ChI结构域和铰链区并且每一个 重链包含下列序列之一：SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:25、SEQ ID N0:26、SEQ ID N0:27、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29、SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32、SEQ ID N0:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37。
[0184] 在优选实施方案中，本发明的抗体包含至少一个重链，其中每一个重链包含ChI结 构域和铰链区，并且包含下列序列之一：SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:25、SEQ ID N0:26、SEQ ID N0:29、SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32、SEQ ID N0:35、SEQ ID N0:36和 SEQ ID N0:37。更优选，本发明的抗体包含至少一个重链，其中每一个重链包含ChI结构域 和铰链区并且每一个重链包含下列序列之一：SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:29、SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32、SEQ ID N0:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37。
[0185] 在其它优选实施方案中，本发明提供了包含至少一个重链的抗体，其中每一个重 链包含ChI结构域、铰链区、Ch2结构域和Ch3结构域并且每一个重链包含选自2、3、6、7、8、15、 16、28、28卩、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、44、44卩、45、46、47和48的抗体的突变，如 表1中显示的。因此，本发明提供了包含至少一个重链的抗体，其中每一个重链包含ChI结构 域、铰链区、Ch2结构域和Ch3结构域并且每一个重链包含下列序列之一:SEQ ID NO:38、SEQ ID N0:39、SEQ ID N0:40、SEQ ID N0:41、SEQ ID N0:42、SEQ ID N0:43、SEQ ID N0:44、SEQ ID N0:45、SEQ ID N0:46、SEQ ID N0:47、SEQ ID N0:48、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:50、SEQ ID N0:51、SEQ ID N0:52、SEQ ID N0:53、SEQ ID N0:54、SEQ ID N0:55、SEQ ID N0:56、SEQ ID N0:57、 SEQ ID N0:58、SEQ ID N0:59、SEQ ID N0:60、SEQ ID N0:61、SEQ ID N0:62和 SEQ ID NO :63〇
[0186] 本发明的特别优选的抗体包含至少一个含有ChI结构域和铰链区的重链，其中重 链包含SEQ ID N0:36(抗体28P)、SEQ ID N0:37(抗体44P)或SEQ ID N0:35(抗体48)。本发 明的其它特别优选的抗体包括至少一个包含ChI结构域、铰链区、Ch2结构域和Ch3结构域的 重链，其中重链包含SEQ ID N0:62(抗体28P)、SEQ ID N0:63(抗体44P)或SEQ ID N0:61(抗 体48)。抗体28P、44P和48是特别优选的，因为它们显示显著提高的热稳定性并且还显示减 少的半分子形成。
[0187]已显示抗体2、3和8形成大量的所谓的半分子(HL)。此类突变体可在非变性条件下 在体外形成完整抗体分子(H2L2)，但在非还原性SDS-PAGE条件下除去重链之间和/或重链 与轻链之间的任何非共价结合。虽然通常教导期望减少半分子的形成，然而具有增加的形 成半分子的倾向的抗体对于某些用途可能是有利的。因抗体重链不能与另一个重链形成共 价或非共价结合而形成稳定的半分子(HL)和几乎不形成或不形成完整抗体(H2L2)的抗体 具有特殊的益处。形成稳定的半分子的抗体对于产生单价抗体是有利的。形成半分子的抗 体还可通过从具有不同特异性的半分子形成完整抗体而提供产生双特异性抗体的有用方 法，其中完整抗体是双特异性的并且对于每一种抗原是单价的。
[0188] 抗体3保留铰链区中的C239,但显示不能形成铰链间重链二硫键(推测因 C末端轻 链半胱氨酸与铰链C239之间的二硫键的高效形成）。抗体2与3的比较显示，轻链的C末端半 胱氨酸'延伸'的程度，因为轻链与铰链区中的C239比与C242更有效地形成二硫键。此外，抗 体3显示与抗体2相比较增加的稳定性。
[0189] 虽然在上文中描述了相对于IgG4同种型的根据本发明的突变的抗体，但是本领域 技术人员将理解，还可将针对IgG4抗体产生的突变用于具有与IgG4抗体相同的二硫键排列 的其它抗体同种型或种类，以提供改善的抗体。具有与I gG4抗体相同的二硫键排列的抗体 的具体实例为I gG3抗体、I gM抗体和I gD抗体。如图I b中显示的，I gG3和I gM在Ch 1结构域的 位置127上具有半胱氨酸，IgD在ChI结构域的位置128(其等同于IgG4的ChI结构域的C127)上 具有半胱氨酸，所述半胱氨酸与轻链中的半胱氨酸形成链间二硫键。此外，还可从图Ib中看 至Ij，IgG3和IgD的上铰链区以及IgM的ChI结构域的C端区域和Ch2结构域的N端区域不包含与 IgGl的上铰链区的残基等同的半胱氨酸残基。因此，本发明还提供了 IgG3抗体、IgD抗体和 IgM抗体，其中ChI结构域中的与轻链中的半胱氨酸形成链间二硫键的半胱氨酸被另一种氨 基酸置换，并且其中位于结构上类似于IgGl或IgG4的上铰链区的位置中的一个或多个氨基 酸被半胱氨酸置换。
[0190] 因此，本发明还提供了IgG3类抗体，其包含至少一个含有ChI结构域和铰链区的重 链，其中在每一个重链中：
[0191] a.ChI结构域中与轻链中的半胱氨酸形成链间二硫键的半胱氨酸被另一种氨基酸 置换;和
[0192] b.位于上铰链区中的一个或多个氨基酸被半胱氨酸置换。
[0193] 在本发明的I gG3抗体方面的优选实施方案中，ChI结构域中与轻链中的半胱氨酸 形成链间二硫键的半胱氨酸是根据Kabat编号系统编号的位置127上的半胱氨酸，如图Ib和 2b中显示的。
[0194] 在本发明的IgG3抗体方面的优选实施方案中，位于上铰链区中的可被半胱氨酸置 换的一个或多个氨基酸为，选自根据Kabat编号系统编号的226、227、228、229、230、232和 233的位置上的氨基酸中的一个或多个氨基酸，如图Ib和2b中显示的。
[0195] 本发明还提供IgM类抗体，其包含至少一个含有ChI结构域和Ch2结构域的重链，其 中在每一个重链中：
[0196] a. ChI结构域中的与轻链中的半胱氨酸形成链间二硫键的半胱氨酸被另一种氨基 酸置换;和
[0197] b.位于ChI结构域或Ch2结构域中的一个或多个氨基酸被半胱氨酸置换。
[0198] 在本发明的IgM抗体方面的优选实施方案中，ChI结构域中的与轻链中的半胱氨酸 形成链间二硫键的半胱氨酸为根据Kabat编号系统编号的位置127上的半胱氨酸，如图Ib 和2c中显示的。
[0199] 在本发明的IgM抗体方面的优选实施方案中，位于ChI结构域的C末端或Ch2结构域 的N端的一个或多个氨基酸被半胱氨酸置换。位于ChI结构域的C末端中的可被半胱氨酸置 换的优选氨基酸为，选自根据Kabat编号系统编号的223、223A、223B和223C的位置上的氨基 酸中的一个或多个氨基酸，如图Ib和2c中显示的。位于Ch2结构域的N端中可被半胱氨酸置 换的优选氨基酸为，选自根据Kabat编号系统编号的243G、243H和2431的位置上的氨基酸中 的一个或多个氨基酸，如图Ib和2c中显示的。因此，氨基酸223至243的任一个或多个可被半 胱氨酸置换。
[0200] 本发明还提供了IgD类抗体，其包含至少一个含有ChI结构域和铰链区的重链，其 中在每一个重链中：
[0201] a.ChI结构域中与轻链中的半胱氨酸形成链间二硫键的半胱氨酸被另一种氨基酸 置换;和
[0202] b.位于铰链区中的一个或多个氨基酸被半胱氨酸置换。
[0203] 在本发明的IgD抗体方面的优选实施方案中，ChI结构域中与轻链中的半胱氨酸形 成链间二硫键的半胱氨酸为根据Kabat编号系统编号的位置128上的半胱氨酸，如图Ib和2d 中显示的。
[0204] IgD抗体的铰链区可被定义为根据Kabat编号系统的R224-P243。
[0205] 在本发明的IgD抗体方面的优选实施方案中，位于铰链区中的被半胱氨酸置换的 一个或多个氨基酸为，选自根据Kabat编号系统编号的227、228、229、230、231、232和233的 位置上的氨基酸中的一个或多个氨基酸，如图Ib和2d中显示的。
[0206] 本发明提供的I gG3、I gD或I gM抗体可包含一个或多个对铰链区的其它突变，如上 文中对于I gG4抗体所论述的。
[0207] 如本文中所使用的，术语'抗体'包括完好的（完整的)抗体和包含至少一个含有Vh 结构域、ChI结构域和铰链区的重链的功能活性片段。根据本发明的抗体优选包含至少一个 轻链。因此，在本发明中术语"抗体"包括二价、三价或四价抗体、Fab'和F(ab'） 2片段、半抗 体分子或包含单个轻链和重链配对的半分子，以及包含两个轻链和重链配对的完整抗体 分子。
[0208] 如本领域公知的，典型的Fab '分子包括重链与轻链对，其中重链包含可变区VH、恒 定结构域CHl和铰链区，轻链包含可变区VL和恒定结构域CL。
[0209] 在一个实施方案中，提供了根据本公开内容的Fab'的二聚体，例如可通过铰链进 行二聚化。
[0210] 在一个实施方案中，重链包括Ch2结构域和Ch3结构域，以及任选地Ch4结构域。在一 个实施方案中，抗体包括两个重链，其各自如上文在本发明的第一或第二方面中所定义。根 据本发明的抗体还优选包含两个轻链。在其中抗体包含两个重链的实施方案中，优选两个 重链序列都是相同的，如上文在本发明的第一或第二方面中所定义的。
[0211]在优选实施方案中，本发明的抗体是包含两个轻链和两个重链的完整抗体，其中 每一个重链包含，其中根据Kabat编号系统编号的位置127上的半胱氨酸被另一种氨基酸置 换的IgG4CHl、IgGl上和中铰链区、IgG4下铰链区、Ch2结构域和Ch3结构域。
[0212] IgG4抗体的完整铰链区通常由残基226至251 (基于Kabat编号系统编号的）组成。 然而，可根据需要缩短或延长铰链区。例如，根据本发明第一方面的抗体，野生型氨基酸在 位置227、228、229或230上被半胱氨酸残基置换，铰链区可在位置227、228、229或230上的新 的半胱氨酸残基后结束。根据本发明的抗体还可包含位于铰链区的N端和/或C端的一个或 多个其它氨基酸。此外，可控制铰链的其它特征，例如铰链半胱氨酸与轻链链间半胱氨酸的 距离、铰链的半胱氨酸之间的距离，以及铰链中可影响铰链的性质例如柔性的其它氨基酸 的组成，例如可将甘氨酸掺入铰链中以增加旋转柔性或可掺入脯氨酸以减少柔性。或者，可 将带电荷的或疏水残基的组合掺入铰链以赋予多聚化或纯化性质。其它修饰的铰链区可以 是完全合成的，且可被设计以具有期望的性质例如长度、组成和柔性。
[0213] 用于本发明的恒定区结构域(特另Ij地在Fc结构域中，当存在时)优选是IgG4同种 型的（当不需要抗体效应子功能时）。相应地每一个重链优选包含IgG4C H2结构域和Ch3结构 域，如SEQ ID NO:64中所示的。
[0214]应理解，还可使用Fc恒定区结构域的序列变体。
[0215] 在一个实施方案中，每一个重链包含IgG4CH2和Ch3结构域，其中用赖氨酸、苏氨酸、 甲硫氨酸或亮氨酸置换位置409(EU编号）上的精氨酸，以在低pH下抑制聚集体形成（US 2008/0063635Takahashi 等人）。还教导了 L235、D265、D270、K322、P331和P329(根据EU编号 系统编号的）上的突变以减弱CDC活性(US 2008/0063635Takahashi等人）。
[0216] 每一个重链可包含如W02008/145142Van de Winkel等人中教导的突变，Van de Winkel等人公开了稳定的IgG4抗体，所述抗体通过置换位置409上的精氨酸残基、位置405 的Phe残基或位置370上的Lys(根据EU编号系统编号的）而具有减少的进行Fab-臂交换的能 力。
[0217] 在一个实施方案中，每一个重链包含IgG4CH2结构域和IgGlCH3结构域，如SEQ ID NO: 65中显示的。
[0218] 在其中抗体为突变的IgG3、IgD或IgM抗体的本发明的实施方案中，每一个重链优 选包含Ch2结构域和Ch3结构域，和任选地Ch4结构域。在IgG3抗体中，每一个重链优选包含 IgG3CH2结构域和IgG3CH3结构域。在IgD抗体中，每一个重链优选包含IgD Ch2结构域和IgD Ch3结构域。在IgM抗体中，每一个重链优选包含IgM Ch2结构域、IgM Ch3结构域和IgM Ch4结 构域。
[0219] 在一个实施方案中，抗体是单克隆、完全人、人源化或嵌合抗体片段。在一个实施 方案中，抗体是完全人抗体或人源化抗体。
[0220] 可利用本领域中已知的任何方法例如杂交瘤技术(Kohler&Milstein ,Nature， 1975，256，495-497)、三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术（Kozbor等人，Immunology Today, 1983,4,72)和EBV-杂交瘤技术（Cole等人，"Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy"，pp · 77-96 ,Alan R· Liss，Inc ·，1985)制备单克隆抗体。
[0221] 用于本发明的抗体还可使用单淋巴细胞抗体法，通过克隆和表达免疫球蛋白可变 区 cDNA 来产生，所述 cDNA 利用例如 Babcook, J ·等人，Proc .Natl. AcacL Sci .USA, 1996,93 (15)，7843-7848，W0 92/02551 ,W02004/051268和W02004/106377描述的方法从被选择用于 产生特定抗体的单个淋巴细胞产生。
[0222] 人源化抗体为来自非人物种的抗体分子，其具有一个或多个来自非人物种的互补 决定区（CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区（其任选包含来自非人物种的一个或多个 供体残基）（参见例如，US 5,585,089)。
[0223] 用于本发明的抗体还可使用本领域已知的各种噬菌体展示法来产生，包括 Brinkman等人，J · Tmmunol .Methods ,1995,182,41-50 ;Ames等人，J · Tmmunol .Methods , 1995,184,177_186;Kettleborough等人Eur. J. Tmmunol · , 1994,24,952_958;Persic等人， Gene,1997187，9_18;和Burton等人，Advances in Immunology,1994,57,191-280;W0 90/ 02809;W0 91/10737;W0 92/01047;W0 92/18619;W0 93/11236;W0 95/15982;和TO 95/ 20401;和US 5,698,426;5,223,409;5,403,484;5,580,717;5,427,908;5,750,753;5,821， 047;5，571，698;5，427，908;5,516，637;5,780,225;5,658,727;5,733,743和5,969,108中 公开的那些。此外，转基因小鼠或其它生物，包括其它哺乳动物，可用于产生人源化抗体。
[0224] 完全人抗体是其中重链和轻链的可变区和恒定区（当存在时)全都是人来源的，或 与人来源的序列（不必来自相同抗体)大体上同一的那些抗体。完全人抗体的实例可包括， 例如通过上述噬菌体展示法产生的抗体和由这样的小鼠产生的抗体，在所述小鼠中鼠免疫 球蛋白可变区和/或恒定区基因已被它们的人对应物替代（例如，在EP0546073B1、US 5， 545,806、US 5,569,825、US 5,625，126、US 5,633,425、US 5,661，016、US 5,770,429、EP 0438474B1 和 EP0463151B1 中一般性描述的）。
[0225] 用于本发明的抗体起始材料可通过使用重组DNA技术(包括操作和再表达编码抗 体可变区和恒定区的DNA)来制备。需要时，可使用标准分子生物学技术来修饰、添加或缺失 氨基酸或结构域。对可变区或恒定区的任何改变仍然包括在本文使用的术语'可变'和'恒 定'区内。
[0226] 可从任何物种包括例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠、骆驼、骆马（llama)、山羊或人获得 抗体起始材料。抗体的部分可从超过一个物种获得，例如抗体可以是嵌合的。在一个实例 中，恒定区来自一个物种并且可变区来自另一个物种。还可修饰抗体起始材料。在另一个实 例中，已使用重组DNA工程技术产生抗体的可变区。此类工程化形式包括，例如通过在天然 抗体的氨基酸序列中进行插入、缺失或改变从天然抗体可变区产生的工程化形式。该类型 的具体实例包括，包含来自一种抗体的至少一个CDR和任选地一个或多个构架氨基酸并且 可变区结构域的其余部分来自第二抗体的那些工程化可变区结构域。用于产生和制备此类 抗体的方法在本领域是公知的（参见例如，Boss等人，US 4,816,397;Cabilly等人，US 6， 331,415; Shrader等人，WO 92/02551; Ward等人，1989 ,Nature ,341,544;Orlandi等人， 1989,Proc .Natl .Acad· Sci .USA,86，3833;Riechmann等人，1988 ,Nature，322，323;Bird等 人，1988 ,Science ,242,423;Queen等人，US 5,585,089;Adair ,W091/09967 !Mountain和 Adair ,1992, Biotechnol.Genet. Eng. Re v，10，1_142 ; Verma等人，1998，Journal of Immunological Methods，216，165-181)〇
[0227] 在一个实施方案中，抗体包含形成结合结构域的可变结构域对，所述可变结构域 对是同源对(cognate pair)。本文中使用的同源对意欲指天然的可变结构域对，即从单个 抗体或表达抗体的细胞分离的可变结构域对。
[0228] 可变结构域可以是已被优化和/或人源化的。
[0229] 来源于同源对的优化的/人源化的可变结构域在优化/人源化后仍被认为是同源 对。
[0230] 因此，本发明扩展至人、人源化或嵌合分子。
[0231] 在一个实施方案中，分子特异性结合靶抗原。本文中使用的特异性结合意欲指，分 子对于靶抗原(其所特异于的抗原)具有高亲和力并且以低或低得多的亲和力结合(或根本 不结合)其所不特异于的抗原。测量亲和力的方法是本领域技术人员已知的，并且包括测定 例如BI Acor e?。
[0232] 本发明的抗体分子适当地具有高结合亲和力(特别地纳摩尔或皮摩尔）。可使用本 领域已知的任何适当方法包括BIAcore?测量亲和力。在一个实施方案中，本发明的分子具 有约IOOpM或更好的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的分子具有约50pM或更好的结 合亲和力。在一个实施方案中，本发明的方法具有约40pM或更好的结合亲和力。在一个实施 方案中，本发明的分子具有约30pM或更好的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的分子 是完全人或人源化的，并且具有约IOOpM或更好的结合亲和力。
[0233] 本文中使用的天然存在的结构域的衍生物意欲指，其中已替代或缺失天然存在的 序列中的1、2、3、4或5个氨基酸，例如以优化结构域的性质（例如通过消除不期望的性质）， 但其中仍然保留结构域的特征性特征。
[0234] 在一个实施方案中，本发明的抗体分子包含一个或多个白蛋白结合肽。在体内，所 述肽结合白蛋白，这增加了分子的半衰期。
[0235] 可从分子的一个或多个可变区、铰链或C端或不干扰分子抗原结合性质的任何位 置附加白蛋白结合肽。
[0236]白蛋白结合肽的实例提供于WO 2007/106120中。
[0237] 本领域技术人员还理解，抗体可经历多种翻译后修饰。此类修饰的类型和程度通 常取决于用于表达分子的宿主细胞系以及培养条件。此类修饰可包括糖基化、甲硫氨酸氧 化、哌嗪二酮形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺的变化。常见的修饰是，因羧肽酶的 作用而导致的羧基末端碱性残基(例如赖氨酸或精氨酸）的丢失(如Harris,RJ.Journal of Chromatography 705:129-134,1995中所描述的）。
[0238] 必要时，可将用于本发明的分子缀合至一个或多个效应分子。应理解，效应分子可 包含单个效应分子或两个或多个如此连接以形成可连接至本发明的抗体分子的单个部分 的此类分子。当期望获得连接至效应分子的根据本发明的抗体时，其可通过标准化学或重 组DNA法来制备，在所述方法中将抗体直接或通过偶联剂连接至效应分子。用于将此类效应 分子缀合至抗体的技术是本领域公知的（参见，Hel Istrom等人，Controlled Drug Delivery，第2版，Robinson等人，eds ·，1987，pp · 623-53;Thorpe等人，1982，Tmmunol .Rev., 62:119-58和Dubowchik等人，1999，Pharmacology and Therapeutics,83,67-123)。具体 的化学方法包括例如WO 93/06231、W0 92/22583、W0 89/00195、W0 89/01476和W003031581 中描述的方法。或者，当效应分子为蛋白质或多肽时，可使用重组DNA法(例如WO 86/01533 和EP0392745中描述的方法)来实现连接。
[0239] 本文中使用的术语效应分子包括例如，抗肿瘤剂、药物、毒素、生物学活性蛋白质 例如酶、其它抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸及其片段例如DNA、RNA及其 片段、放射性核素特别地放射性碘化物、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒和报道基团例 如荧光化合物或可通过NMR或ESR光谱法检测的化合物。
[0240] 效应分子的实例可包括，细胞毒素或细胞毒性剂，包括对细胞有害（例如杀伤细 胞)的任何试剂。实例包括考布他汀(combrestatins)、多拉司他汀、爱波喜龙、星形孢菌素、 美登素(maytansinoids)、海绵抑制素、根霉素(rhizoxin)、软海绵素、杆孢菌素、哈米特林 (hemiasterlins)、泰素(taxol)、细胞松弛素 B、短杆菌肽D、溴乙啶、依米丁、丝裂霉素、依托 泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮 (dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素 D、l_去氢睾酮、糖皮质激 素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同源物。
[0241] 效应分子还包括但不限于，抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、 阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪）、烷化剂(例如氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司 汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素 C和顺二 氯二胺铂（II)(DDP)顺铂）、蒽环类(例如柔红霉素(先前称为道诺霉素)和多柔比星）、抗生 素类(例如放线菌素 D(先前称为放线菌素）、博来霉素、光辉霉素、安曲霉素(AMC)、加利车霉 素 (caI icheamicins)或多卡米星)和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱）。
[0242] 其它效应分子可包括螯合放射性核素例如111In和9°Y、Lum、祕 213、锎252、铱192和 钨188/铼188;或药物例如但不限于烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶I抑制剂、紫杉烷和舒拉明。
[0243] 其它效应分子包括蛋白质、肽和酶。有益的酶包括但不限于蛋白水解酶、水解酶、 裂合酶、异构酶、转移酶。有益的蛋白质、多肽和肽包括但不限于免疫球蛋白、毒素例如相思 豆毒蛋白、蓖麻蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素、蛋白质例如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子或组织纤溶酶原激活物、血栓形成 剂或抗血管生成剂例如血管他丁或内皮他丁、或生物学应答修饰剂(biological response modifier)例如淋巴因子、白细胞介素 -I (IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、粒细胞-巨噬细胞集 落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子(NGF)或其它生长因子 和免疫球蛋白。
[0244] 其它效应分子可包括可用于例如诊断的可检测的物质。可检测的物质的实例包括 各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性核素、正电子发射金属（用于正电 子发射断层摄影术)和非放射性顺磁金属离子。关于可缀合至抗体（以用作诊断剂）的金属 离子，通常参见美国专利No . 4，741，900。适当的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半 乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶;适当的辅基包括链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和生物素;适 当的荧光材料包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪氨基荧光素、丹磺酰 氯和藻红蛋白；适当的发光材料包括鲁米诺;适当的生物发光材料包括萤光素酶、萤光素和 水母荧光素;适当的放射性核素包括 125I、131I、111In和"Tc。
[0245] 在另一个实例中，效应分子可在体内增加抗体的半衰期，和/或减小抗体的免疫原 性和/或增强抗体横穿上皮屏障至免疫系统的递送。该类型的适当效应分子的实例包括聚 合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物例如WO 05/117984中描述的那些。
[0246] 当效应分子是聚合物时，其通常可以是合成的或天然存在的聚合物，例如任选地 取代的直链或支链聚亚烷基(POlyalkyIene)、聚亚烯基(POlyalkenyIene)或聚氧亚烷基 (polyoxyalky Iene)聚合物或分支多糖或未分支多糖例如同多糖或杂多糖。
[0247] 可存在于上述合成的聚合物上的具体任选取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲 氧基。
[0248]合成的聚合物的具体实例包括任选地取代的直链或支链聚（乙二醇）、聚（丙二 醇）、聚（乙烯醇)或其衍生物，特别地任选地取代的聚（乙二醇)例如甲氧基聚（乙二醇)或其 衍生物。
[0249] 具体的天然存在的聚合物包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。
[0250] 如本文中使用的，"衍生物"意欲包括反应性衍生物，例如巯基选择性反应性基团 例如马来酰亚胺等。可将反应性基团直接或通过连接体区段连接至聚合物。应理解，此类基 团的残基在一些情况下将作为本公开内容的抗体与聚合物之间的连接基团而构成产物的 部分。
[0251] 可根据需要改变聚合物的大小，但其通常在500Da至50000Da，例如5000至40000Da 例如20000至40000Da的平均分子量范围内。可特别地基于产物的期望的用途例如定位至某 些组织例如肿瘤或延长循环半衰期的能力来选择聚合物的大小（关于综述，参见Chapman， 2002，Advanced Drug Delivery Reviews,54,531-545)。因此，例如，当期望产物离开循环 并且渗入组织（例如用于治疗肿瘤）时，可以有利地使用小分子量聚合物（例如具有约 5000Da的分子量）。对于其中产物保留在循环中的应用，可以有利地使用较高分子量的聚合 物(例如具有20000Da至40000Da的分子量）。
[0252]适当的聚合物包括聚亚烷基聚合物例如聚（乙二醇)或，特别地甲氧基聚（乙二醇） 或其衍生物，特别地具有约15000Da至约40000Da的分子量。
[0253]在一个实例中，将用于本发明的抗体连接至聚（乙二醇）(PEG)部分。在一个具体的 实例中，可通过位于抗体中的任何可获得的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团例如任何游离 氨基、亚胺基、巯基、羟基或羧基连接PEG分子。此类氨基酸可天然存在于抗体中或可使用重 组DNA法（参见例如US 5,219,996;US 5,667,425;W0 98/25971)工程化至抗体中。在一个实 例中，本发明的分子是修饰的抗体，其中修饰是将一个或多个氨基酸添加至其重链的C末 端以允许连接效应分子。可将多个位点用于连接两个或更多个PEG分子。
[0254] 在一个实施方案中，将PEG分子连接至轻链中的半胱氨酸171，例如参见W02008/ 038024(其通过引用并入本文）。
[0255] 适当地，通过位于抗体中的至少一个半胱氨酸残基的巯基共价连接PEG分子。可将 每一个连接至修饰的抗体的聚合物分子共价连接至位于抗体中的半胱氨酸残基的硫原子。 共价连接通常是二硫键或，特别地硫-碳键。当巯基用作连接点时，可使用适当地激活的效 应分子例如巯基选择性衍生物例如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。激活的聚合物可在上述 聚合物修饰的抗体的制备中用作起始材料。激活的聚合物可以是包含巯基反应性基团例如 α_卤代羧酸或酯例如碘乙酰胺、酰亚胺例如马来酰亚胺、乙烯基砜或二硫化物的任何聚合 物。此类起始材料可商购获得（例如来自Nektar，之前为Shearwater Polymers Inc., Huntsvi I Ie，AL，USA)或可使用常规化学法从商购可得的起始材料制备而来。具体的PEG分 子包括20K甲氧基-PEG-胺（可获自 Nektar，先前为Shearwater; Rapp Polymere;和SunBio) 和M_PEG_SPA(可获自 Nektar，先前为Shearwater)。
[0256] 本发明还提供了编码本文中描述的抗体分子的分离的DNA。
[0257] 在其它方面，提供了包含所述DNA的载体。
[0258] 可籍以构建载体的一般方法、转染法和培养法对于本领域技术人员来说是公知 的。在该方面，参考"Current Protocols in Molecular Biology"，1999，F.M.Ausubel (ed) ,Wiley Interscience，New York和由Cold Spring Harbor Publishing出版的 Maniatis Manual〇
[0259] 在其它方面，提供了包含所述载体和/或DNA的宿主细胞。
[0260] 任何适当的宿主细胞/载体系统可用于表达编码本发明的分子的DNA序列。可使用 细菌例如大肠杆菌(E. coli)和其它微生物系统或也可使用真核生物(例如哺乳动物)宿主 细胞表达系统。适当的哺乳动物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
[0261] 本发明还提供了用于产生本文中描述的抗体分子的方法，包括在适合于导致蛋 白质从编码本发明的抗体分子的DNA表达的条件下培养包含本发明的载体(和/或DNA)的宿 主细胞，和分尚抗体分子。
[0262] 为了产生包含重链和轻链的产物，可用两种载体转染细胞系，第一载体编码轻链 多肽，第二载体编码重链多肽。或者，可使用单个载体，所述载体包括编码轻链和重链多肽 的序列。
[0263] 根据本公开内容的抗体分子以适当的水平从宿主细胞表达，从而有助于它们进行 商业加工。
[0264] 抗体可以特异于任何靶抗原。抗原可以是细胞结合蛋白，例如细胞例如细菌细胞、 酵母细胞、T细胞、内皮细胞或肿瘤细胞上的细胞表面蛋白质，或其可以是可溶性蛋白质。目 标抗原还可以是任何医学相关蛋白质例如在疾病或感染期间被上调的那些蛋白质，例如受 体和/或其相应的配体。细胞表面蛋白质的具体实例包括，粘附分子例如整联蛋白例如m整 联蛋白，例如VLA-4、E-选择蛋白、P选择蛋白或L-选择蛋白、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、 CDlla、CDllb、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD45、CDW52、CD69、 CD134(0X40)、IC0S、BCMP7、CD137、CD27L、CDCP1、CSF1 或CSFl-受体、DPCRl、DPCRl、dudul in2、FU20584、FU40787、HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、LTK、 MAL2、MRP2、结合素-样 2、NKCC1、PTK7、RAIG1、TCAM1、SC6、BCMP101、BCMP84、BCMP11、DTD、癌 胚抗原（CEA)、人乳脂肪球蛋白（HMFG1和2)、MHCI类和MHCII类抗原、KDR和VEGF、PD-1、DC-3?^、1'1^、01?、11^-7受体厶，以及适当时，其受体。
[0265] 可溶性抗原包括，白细胞介素例如11^1、几-2、11^3、几-4、11^-5、几-6、11^-8、几-12、几-13、几-14、几-16或11^-17例如11^174和/或11^17?、病毒抗原例如呼吸道合胞病毒或巨 细胞病毒抗原、免疫球蛋白例如IgE、干扰素例如干扰素 α、干扰素 β或干扰素 γ、肿瘤坏死因 子TNF(先前称为肿瘤坏死因子-α，在本文中称为TNF或TNFa)、肿瘤坏死因子-β、集落刺激因 子例如G-CSF或GM-CSF以及血小板衍生生长因子例如PDGF-a和PDGF-KWISP-1，以及适当 时，其受体。其它抗原包括细菌细胞表面抗原、细菌毒素、病毒例如流感病毒、EBV、HepA、B 和C、生物恐怖试剂、放射性核素和重金属、以及蛇和蜘蛛毒液和毒性。
[0266] 在一个实施方案中，抗体可用于功能性改变目标抗原的活性。例如，抗体可直接或 间接中和、诘抗或激动(agoni se)所述抗原的活性。
[0267] 本发明的抗体分子可用于治疗和/或预防病理状态。
[0268] 因此，提供了根据本发明的抗体，其用于进行治疗(通过施用治疗有效量的其，例 如在药物制剂中）。在一个实施方案中，将根据本发明的抗体局部施用至肺，例如通过吸入。
[0269] 本发明提供的抗体可用于治疗疾病或障碍包括炎性疾病和障碍、免疫疾病和障 碍、纤维变性障碍和癌症。
[0270] 术语"炎性疾病"或"障碍"和"免疫疾病或障碍"包括类风湿性关节炎、银肩病关节 炎、斯蒂尔病、Muckle WelIs病、银肩病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、SLE(系统性红斑狼疮）、 哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、多发性硬化、血管炎、I型糖尿病、移植和移植物抗宿主病。 [0271 ]术语"纤维变性障碍"包括特发性肺纤维化(IPF)、系统性硬化症(或硬皮病）、肾纤 维化、糖尿病肾病、IgA肾病、高血压、终末期肾疾病、腹膜纤维变性(连续非卧床腹膜透析）、 肝硬化、年龄相关性黄斑变性(ARMD)、视网膜病变、心脏反应性纤维化(cardiac reactive fibrosis)、结症(scarring)、症痕瘰瘡(keloids)、烧伤、皮肤溃疡、血管成形术、冠状动脉 架桥外科手术、关节成形术和白内障手术。
[0272] 术语"癌症"包括从上皮产生的恶性新生物(malignant new growth)，见于皮肤或 更常见地身体器官(例如:乳腺、卵巢、前列腺、肺、肾、胰腺、胃、膀胱或肠)的内衬中。癌症倾 向于浸润入邻近组织中并且扩散(转移)至远处器官例如:至骨、肝、肺或脑。
[0273]本发明还提供了药物或诊断组合物，其包含与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或 载体中的一种或多种组合的本发明的抗体。因此，提供了本发明的抗体用于制造药剂的用 途。通常组合物提供为无菌药物组合物的部分，所述无菌药物组合物通常包括药学上可接 受的载体。本发明的药物组合物可额外地包含药学上可接受的佐剂。
[0274] 本发明还提供了用于制备药物或诊断组合物的方法，包括添加本发明的抗体并 且将其与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体中的一种或多种混合。
[0275] 本发明的抗体可以为药物或诊断组合物中的唯一活性成分或可伴随其它活性成 分，包括其它抗体成分例如抗-TNF、抗-IL-Ιβ、抗-T细胞、抗-IFN γ或抗-LPS抗体，或非抗体 成分例如黄嘌呤。其它适当的活性成分包括能够诱导耐受性的抗体例如抗CD3或抗CD4抗 体。
[0276] 在其它实施方案中，将根据本公开内容的抗体或组合物与其它药物活性剂例如皮 质类固醇(例如丙酸氟替卡松)和/或β-2-激动剂(例如沙丁胺醇(salbutamol)、沙美特罗或 福莫特罗)或细胞生长和增殖的抑制剂(例如雷帕霉素、环磷酰胺、甲氨蝶呤)或CD28和/或 CD40抑制剂组合使用。在一个实施方案中，抑制剂是小分子。在另一个实施方案中，抑制剂 是特异于靶的抗体。
[0277] 药物组合物适当地包含治疗有效量的本发明的抗体。如本文中所使用的，术语"治 疗有效量"是指治疗、改善或预防目标疾病或病况或显示可检测的治疗或预防效果所需的 治疗剂的量。可在细胞培养测定中或在动物模型中（通常在啮齿类动物、兔、狗、猪或灵长类 动物中）初步估计治疗有效量。动物模型还可用于测定适当的浓度范围和施用途径。随后可 将这样的信息用于确定在人中施用的有用剂量和途径。
[0278] 用于人受试者的精确治疗有效量将取决于疾病状态的严重度、受试者的总体健康 状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、施用的时间和频率、药物组合、对治疗的反应灵敏 性和耐受性/应答。该量可通过常规实验来测定并且在临床医生的判断能力内。通常，治疗 有效量可为〇 · 〇lmg/kg至50mg/kg，例如0 · lmg/kg至20mg/kg。可以以包含预定量的本发明的 活性剂/剂的单位剂量形式方便地提供药物组合物。
[0279] 可将组合物单独地给患者施用或可将其与其它试剂、药物或激素组合施用（例如 同时、相继地或分开地）。
[0280]本发明抗体的施用剂量取决于待治疗的病况的性质，例如存在的疾病/炎症的程 度以及取决于分子被预防性使用还是用于治疗现有病况。
[0281] 给药的频率取决于抗体的半衰期和其作用的持续时间。如果抗体具有短的半衰 期(例如2至10小时），则可能必需每天提供1个或多个剂量。或者，如果抗体具有长的半衰期 (例如2至15天），则可能只需每天一次、每周一次或甚至每1或2个月一次给药。
[0282] 药学上可接受的载体本身应当不诱导对接收组合物的个体有害的抗体产生并且 应当不是有毒性的。适当的载体可以是大的缓慢代谢的大分子例如蛋白质、多肽、脂质体、 多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和无活性病毒颗粒。
[0283] 可使用药学上可接受的盐，例如矿物酸盐例如盐酸化物、氢溴化物、磷酸盐和硫酸 盐，或有机酸的盐例如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。
[0284] 治疗性组合物中的药学上可接受的载体可额外地包含液体例如水、盐水、甘油和 乙醇。此外，辅助物质例如湿润剂或乳化剂或PH缓冲物质可存在于此类组合物中。此类载体 使得药物组合物能够被配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆体和悬浮剂， 以用于患者摄入。
[0285] 施用的适当形式包括适用于胃肠外施用（例如通过注射或输注，例如通过弹丸注 射(bolus injection)或连续输注）的形式。当产物用于注射或输注时，其可采取于油性或 含水媒介物中的悬浮剂、溶液或乳剂的形式并且其可包含配制剂(formulatory agent)例 如混悬剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。或者，本公开内容的分子可以以干燥形式存在，其 在使用前用适当的无菌液体进行重建。
[0286] 配制后，可将本发明的组合物直接给受试者施用。待治疗的受试者可以是动物。然 而，在一个或多个实施方案中，组合物适合于给人受试者施用。
[0287] 适当地，在根据本公开内容的制剂中，终制剂的pH与抗体的等电点的值不相似，例 如如果制剂的pH为7,则8-9或以上的pi可以是适当的。然而不希望受理论束缚，据认为这可 最终提供具有提高的稳定性的终制剂，例如抗体保留在溶液中。
[0288] 可通过许多途径施用本发明的药物组合物，包括但不限于口服、静脉内、肌内、动 脉内、髓内、鞘内、心室内、经真皮、经皮(例如，参见W098/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、经肠、 局部、舌下、阴道内或直肠途径。皮下注射器(Hypospray)也可用于施用本发明的药物组合 物。通常，可将治疗组合物制备为可注射的液体溶液或悬浮液。还可制备适合于在注射之前 在液体媒介物中配制为溶液或悬浮液的固体形式。
[0289] 通常可通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射或递送至组织的间质间隙 (interstitial space)来实现组合物的直接递送。还可将组合物施用至损伤处。给药治疗 可以是单次给药方案或多次给药方案。
[0290] 应理解，组合物中的活性成分是抗体。因此，其易于在胃肠道中降解。因此，如果通 过使用胃肠道的途径施用组合物，则组合物将需要包含保护抗体免受降解但一旦其被胃肠 道吸收就立即释放抗体的试剂。
[0291 ] 药学上可接受的载体的详尽论述可见于Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company,N.J.1991)〇
[0292] 在一个实施方案中，以用于局部施用(包括吸入)的制剂的形式提供制剂。
[0293] 适当的可吸入制剂包括可吸入粉剂、包含喷射气体的计量气雾剂或不含喷射气体 的可吸入溶液。包含活性物质的根据本公开内容的可吸入粉剂可仅由上述活性物质组成或 由上述活性物质与生理上可接受的赋形剂的混合物组成。
[0294] 此类可吸入粉剂可包括单糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖）、二糖(例如乳糖、蔗糖、麦 芽糖）、寡糖和多糖(例如葡聚糖）、多元醇(例如山梨醇、甘露醇、木糖醇）、盐(例如氯化钠、 碳酸钙)或此类物质彼此的混合物。适当地，使用单糖或二糖，使用乳糖或葡萄糖(特别地但 非唯一地以其水合物的形式）。
[0295 ]用于在肺中沉积的颗粒需要小于10微米例如1 -9微米，例如0.1至5μηι，特别地1至5 μπι的粒度。活性成分(例如抗体)的粒度是非常重要的。
[0296] 可用于制备可吸入气雾剂的喷射气体在本领域是已知的。适当的喷射气体选自烃 类例如正丙烷、正丁烷或异丁烷，以及卤代烃例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷 的氯化和/或氟化衍生物。可单独使用上述喷射气体本身或其混合物。
[0297] 特别适合的喷射气体是选自TG 11、TG 12、TG 134a和TG227的卤代烷烃衍生物。在 上述卤代烃中，TG134a(l，I，1，2_四氟乙烷)和TG227(1，I，1，2，3，3，3_七氟丙烷)及其混合 物是特别适合的。
[0298] 包含喷射气体的可吸入气雾剂还可包含其它成分例如共溶剂、稳定剂、表面活性 试剂(表面活性剂）、抗氧化剂、润滑剂和用于调节pH的工具。所有这些成分在本领域是已知 的。
[0299] 根据本发明的包含喷射气体的可吸入气雾剂可包含高达按重量计5%的活性物 质。根据本发明的气雾剂包含例如按重量计〇 . 002至5 %，按重量计0.01至3 %，按重量计 0.015至2%，按重量计0.1至2%，按重量计0.5至2%或按重量计0.5至1 %的活性成分。
[0300] 或者，至肺的局部施用还可以是液体溶液或悬浮液制剂的施用，例如使用装置例 如喷雾器，例如与压缩机连接的喷雾器（例如，由Pari Respiratory Equipment, Inc.， Richmond，Va.制造的连接至Pari Mas ter(R)压缩机的Pari LC-Jet Plus(R)喷雾器）。
[0301] 可以递送例如以溶液或悬浮液的形式分散在溶剂中的本发明的抗体。可将其悬浮 在适当的生理学溶液例如盐水或其它药学上可接受的溶剂或缓冲溶液中。本领域已知的缓 冲溶液可包含〇 .〇5mg至0 · 15mg依地酸二钠、8 · Omg至9 · Omg NaCl、0 · 15mg至0 · 25mg聚山梨醇 酯、0 · 25mg至0 · 30mg无水梓檬酸和0 · 45mg至0 · 55mg梓檬酸钠/mL水，以获得约4 · 0至5 · 0的 pH。悬浮液可使用例如冻干的分子。
[0302] 治疗性悬浮液或溶液制剂还可包含一种或多种赋形剂。赋形剂在本领域是公知 的，包括缓冲剂(例如，柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂和碳酸氢盐缓冲剂）、 氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质（例如，血清白蛋白）、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露 醇、山梨醇和甘油。可将溶液或悬浮液封装在脂质体或生物可降解的微球体中。通常以大体 上无菌的形式(使用无菌制造法)提供制剂。
[0303] 这可包括生产和灭菌(通过过滤用于在无菌缓冲溶剂溶液中配制、无菌悬浮分子 的缓冲溶剂/溶液），以及利用本领域技术人员熟悉的方法将制剂分配至无菌容器中。
[0304] 可以例如以包装在箱包膜中的单个剂量单位(例如，密封的塑料容器或小瓶)的形 式提供根据本公开内容的可喷雾制剂(nebulizable formulation)。每一个小瓶在一定体 积例如2mL的溶剂/溶液缓冲液中包含单位剂量。
[0305] 本公开内容的抗体被认为特别适合于通过喷雾法递送。
[0306] 在本说明书的背景中，包含意欲表示包括。
[0307] 当技术上适当时，可组合本发明的实施方案。
[0308] 现参考下列实施例描述本发明，所述实施例仅仅是举例说明性的并且不应当以任 何方式解释为限制本发明的范围。 实施例
[0309] I. IgG4重链的诱变和产生突变的IgG4重链单基因载体
[0310] 使川Qui.ckchan.ge?Lightening Multi Site Directed Mutagenesis(SDM)试 剂盒或Qu i ckcha nge? π D SM试剂盒(获自S t r a t a g en6?)(目录号分别为21 ο 516和 200521 )，按照制造商的说明书进行氨基酸突变。
[0311] 通过DNA测序验证突变。产生下表中的至少抗体1 -47的I gG4重链：
[0314] 制备的其它抗体描述于上文表1中。
[0315] 利用PCR和限制性酶克隆产生抗体48的重链(序列ID NO 35)。利用编码IgGl上铰 链区和核心铰链区序列以及限制性位点BglII的正向寡核苷酸和编码限制性酶DraIII位点 的反向寡核苷酸产生PCR产物。随后利用上述酶降解PCR片段，将其连接入包含适当的可变 区的hG4单基因载体。
[0316] 2.突变的IgG4抗体的表达
[0317] 将所有突变体DNA转染进入CHOKl细胞或CHO-SXE细胞。将细胞（2xl08个细胞/ml) 重悬浮于Iml Earles Balance Salt Solution(Sigma)中并且与400yg的DNA(200yg重链 DNA和200ygK轻链DNA)混合。将800μ1等分试样转移至0.4cm小槽(Biorad)。对于500ml培养 物，在下列参数下对6个小槽进行电穿孔：Ims，9.6Amp; IOms，0Amp;40ms，3.2Amp。将转染的 细胞在37°C下于5^^02潮湿的环境中以HOrpm振荡温育24小时，并且从转染后第2天开始 在32°C下继续温育10-13天。在转染后第4天，将1.6ml IM丁酸钠添加至培养物。一旦细胞 达到40%的活力或直至第13天，收获上清液。以4000rpm离心培养物45分钟。将上清液通过 0·22μΜ Stericup过滤器(Millipore)以进行纯化。图28中的数据显示，当从CHO-Kl或CHO-SXE细胞产生蛋白质时，由工程化突变编码的IgG4热稳定性的改变是相同的。
[0318] 3.突变的IgG4抗体的纯化
[0319] 使用蛋白A 5ml HiTrap MabSelect SuRe柱子（GE Healthcare ,Amersham UK)纯 化上清液(200-500ml)。通过添加1/50上清液体积的2M Tris-HCl pH 8.5来制备样品。将样 品以Iml/分钟加载至柱子上。用PBS pH 7.4洗涤柱子。为了洗脱样品，将0.1 M柠檬酸钠 ，pH 3.4以lml/分钟运行通过柱子，收集0.5ml级分。通过将0.125ml的2M Tris-HCl pH8.5添加 至每一个级分来中和峰级分。将紫外检测设置在280nm。
[0320] 4.纯化的突变的IgG4抗体的表征
[0321] SDS PAGE分析：
[0322] 将粗制上清液以1200rpm离心5分钟，在OCTET上进行定量。通过添加适当量的抗 体、41上样缓冲液（1]1￥；[1：1'08611)和2以110011^[呢1来制备抗体样品（25-301^)。使用(1!120构 成20μ1的总体积。随后将样品在100°C下煮沸3分钟，将其加载至15孔1.5mm 4-20%Tris-甘 氨酸凝胶上。将凝胶在150V下于IX槽缓冲液(Tank buffer)中电泳1.5小时。使用iB1 0t干转 移系统将抗体转移至硝酸纤维素膜，进行8分钟。在振荡平台上将膜在室温(RT)下于PBS-TM 中温育1小时，随后用缀合有HRP的兔抗-人IgG Fc抗体(Jackson Immunoresearch)或缀合 有HRP的山羊抗-人κ轻链抗体(Bethyl)在RT下振荡温育1小时。之后用I 3BS-T洗涤3次，每次5 分钟。按照制造商的说明书(Pierce)，使用金属增强DAB底物试剂盒显现印迹。
[0323] Western印迹分析的结果示于图7、8、9和10中。在图7-10中，H代表重链，L代表轻 链，H2L2为包含两个重链和两个轻链的完整抗体分子，HL为包含一个重链和一个轻链的半 分子。
[0324] 图7显示抗体15、16、6、7、8、17、18、19、1、2、3、12和13的恥8七6?1印迹分析。从图7 中可以看到：除因铰链突变C239S和C242S的存在而未显示H2L2或显示极少的H2L2的抗体8 外，抗体显示良好的H2L2水平。然而，抗体8可通过重链间的非共价结合形成H2L2。突变体3 也显示极少的H2L2，该突变体保留C239，但推测因 C端轻链(LC)半胱氨酸与铰链C239之间的 二硫键的高效形成而不能在铰链中形成重链间二硫键。还可看到:包含突变C239S但不包含 C242S的抗体（抗体2、6和12)显示与不包含02393和02423的抗体或包含02423但不包含 C239S的抗体相比较减少的HL的形成。包含S241P突变的抗体16也显示减少的HL的形成。突 变体2与3的比较显示，与重链形成二硫键的轻链C端半胱氨酸的'延伸'的程度，轻链半胱氨 酸显示与重链中的C239比与C242更有效地键合。
[0325] 图8 显示 了抗体 15、6、7、8、28、29、30、31、17、19、32、33、33、34、35、36、37、38和39的 Western印迹分析。从图8可以看到：除因铰链区中存在突变C239S和C242S(从而在两个重链 之间无二硫键形成)而未显示H2L2或显示极少的H2L2的抗体8、31、35和39外，抗体显示良好 的H2L2水平。然而，抗体8、31、35和39可通过重链之间的非共价结合形成!121^。还可看到:包 含突变C239S但不包含C242S的抗体(抗体6、29、33和37)显示与不包含C239S和C242S的抗体 或包含C242S但不包含C239S的抗体相比较减少的HL的形成。突变体15能够形成在轻链与 CHl中的G230C之间的二硫键以及重链间二硫键，从而导致完全装配的二硫键键合的蛋白 质。此外，突变体 15(C127S G230C)、28(C127S Y229C)、32(C127S K228C)和36(C127S S227C)的比较显示：在上铰链中的这些位置引入半胱氨酸增加了 LC-HC间二硫键的形成。 G230和Y229是引入半胱氨酸的特别优选的位置。突变体28(C127S Y229C)显示低水平的HL 和H2,从而具有低二硫键异质性。
[0326] 图9显示抗体15、6、7、8、44、45、46、47、17和19的168七6?1印迹分析。从图9可以看 到:除因铰链区中存在突变C239S和C242S(从而在两个重链之间无二硫键形成）而未显示 H2L2或显示极少的H2L2的抗体8和47外，抗体显示良好的H2L2水平。然而，抗体8和47可通过 重链之间的非共价结合形成H2L2。还可看到：包含突变C239S但不包含C242S的抗体(抗体6 和45)显示与不包含C239S和C242S的抗体或包含C242S但不包含C239S的抗体相比较减少的 HL的形成。特别地，突变体44显示，3个氨基酸在上铰链区的插入也可减少HL和H2的形成，从 而具有比可比较的突变体15更低水平的二硫键异质性。
[0327] 图10显示抗体48、17、18和19的Western印迹分析。从图10可以看到：抗体48显示良 好的H2L2水平和极少的HL。突变体48包含IgGl上铰链序列EPKSCDKTHT(替代IgG4上铰链序 列）和核心铰链S241P突变。因此，突变体48具有上铰链和核心铰链序列EPKSCDKTHTCPPCP。 突变体48显示，与野生型IgG4抗体17相比较更低水平的二硫键异质性，和与IgG4S241P突变 体18和野生型IgGl抗体19相比较大致相当的低水平的二硫键异质性。
[0328] Thermofluor 测定：
[0329] 使用S YPRO? Orange监测蛋白质的热解折叠过程以在thermof Iuor测定中分析纯 化的mAb的热稳定性。将5μ1的lmg/ml的mAb、5yl的30x染料和40μ1的PBS添加在一起。将10μ1 混合物以一式四份分配至PCR光学384孔板，并在7900ΗΤ Fast Real-Time PCR系统 (Agilent Technologies UK Ltd,Wokingham UK)上运行。该PCR系统包括用于精确温度控 制(设置在20°C至99°C)的加热装置;同时监测孔中的荧光变化的电荷耦合装置。
[0330] 图11、12、13、14和15显示IgG4抗体突变体的与野生型IgGl和IgG4抗体相比较的热 稳定性分析的结果。
[0331] 突变体15与野生型IgG4(突变体17)的比较显示，由于改变的二硫键排列，Fab Tm 增加。突变体15与28的比较显示，与包含G230C突变的突变体15相比较，包含Y229C突变的突 变体28的Fab Tm进一步增加。突变体15与44的比较显示，可通过在上铰链中插入3个氨基 酸来进一步增加 G230C突变体的Fab Tm。突变体17与18的比较显示，S241P中铰链突变不增 加 Fab Tm，即使其显著减少HL的形成。当与野生型IgG4(突变体17)和突变体15相比较时，突 变体48还显示显著升高的Fab Tm。
[0332] 图15显示选择的根据本发明的IgG4突变体的热稳定性的总体评级。突变体48、44、 44卩、46、45、6、29、30、28、28?、31、8、47和15全都显示，与野生型1 864(突变体17)和野生型 IgG4S241P(突变体18)相比较显著更高的Fab Tm值。
[0333]抗体亲和力：
[0334]利用Biacore?测量选择的本发明的突变体IgG4抗体对靶可溶性细胞因子的亲和 力。测定形式为，将IgG捕获在抗-Fe表面上，随后进行可溶性细胞因子的滴定。
[0335] 结果示于图16中，其中可看到：与对照IgGl和IgG4野生型抗体相比较，突变型抗体 显示相当的对可溶性细胞因子的亲和力。
[0336]术语〃 kdliT1)是指，抗体-抗原相互作用的解离速率常数。所述值也称为kQff值。
[0337] 如本文中所使用的，术语IaIiT1iT1)是指，抗体-抗原相互作用的结合速率常数。
[0338] 如本文中所使用的，术语〃Kd〃(M)或"KD"（pM)是指，抗体-抗原相互作用的解离平衡 常数。
[0339] 大小排阻（SEC)HPLC分析：
[0340] 使用S200柱在HPLC上运行约50ug纯化的抗体。将Ab 1至19用于该分析。结果显示， 尽管人IgG4分子的DSB排列发生了改变，但仍然形成非共价结合的H2L2。
[0341] HPLC分析的结果示于图17中。
[0342] 可选的上铰链间隔子长度
[0343]将长度为1至5个氨基酸的聚丙氨酸间隔子插入在PP与CPSP之间，即在用' ~ ' (ESKYCPP'CPSPA)标示的位置处。图18显示，任意长度的间隔子的插入足以减少突变体15中 H2或L2形成的量。然而，3个或更多个氨基酸的插入长度显示提供了最大的热稳定性的增 加。应指出，3个氨基酸的插入最近似地模拟IgGl与IgG4之间的上铰链长度的差异。
[0344] 可选的上铰链间隔子的氨基酸组成
[0345] 为了探究ESKYCPP'CPSPA上的三丙氨酸插入作为上铰链间隔子是否具有特殊性 质，测试两个其它的三氨基酸插入:GGG和THT。图19显示，GGG和THT可功能性地用作间隔子 区域，尽管结果显示它们并不相同。与AAA或THT相比较，GGG显示较不能减少H2和L2的形成。 对于GGG和THT观察到的热稳定性的增加不如对于AAA观察到的大。
[0346] 可选的上铰链间隔子的氨基酸长度和组成
[0347] IgG4在CHl链间半胱氨酸与第一核心铰链半胱氨酸之间具有2个氨基酸(PP)的'间 隔子'，而IgGl具有5个氨基酸(DKTHT)的间隔子。构建了4个突变体(68、67、66和56)以使得 能够与突变体15(ESKYCPPCPSCP)进行比较。首先，用在IgGl中发现的等长度(DK)间隔子替 换IgG4的PP间隔子(突变体68(ESKYCDKCPSCP));随后通过每次增加一个氨基酸来模拟IgGl 上铰链间隔子：
[0348] 突变体 67(ESKYCDKTCPSCP)
[0349] 突变体 66(ESKYCDKTHCPSCP)
[0350] 突变体 56(ESKYCDKTHTCPSCP)。
[0351] 图21中的数据表明，单个最重要的改变是从PP至DK，这导致与突变体15相比，H2、H 和L形成的减少。增加长度(插入另外的IgGl样间隔子(T、TH和THT))显示实现H2的最小增量 的减少，但可导致HL形成的额外增量的增加。由于突变体68、67、66和56包含CPSC核心铰链 序列，因此，HL形成的增加可以是间隔子在将LC-HC链间二硫键半胱氨酸与核心铰链半胱 氨酸分离(这因而易于形成分子内二硫键)中更有效的证据。
[0352] 图22中的数据表明，DK作为2个氨基酸的间隔子的选择在减少二硫键同种型异质 性方面优于PP，比较突变体15(ESKYCPPCPSCP)与68(ESKYCDKCPSCP)以及突变体55 (ESKYCPPTHTCPSCP)与56(ESKYCDKTHTCPSCP)。已知短的多聚脯氨酸基序例如PP能够编码一 定水平的螺旋转角潜能，这可导致LC-HC与核心铰链半胱氨酸的局部并置。该局部作用显示 被另外的AAA更好地克服，如在突变体44 (ESKYCPPAAACPSCP)中所观察到的。突变体68、55、 56、44或69都未显示具有显著不同的热稳定性。
[0353]非间隔子上铰链序列的组成的影响
[0354] 为了理解LC-HC CHl间半胱氨酸N端的上铰链序列的序列组成（IgG4中的ESKY和 IgGl中的EPKS)的影响，在突变体15(ESKYCPPCPSCP)的背景中产生突变体的所有排列。图23 中的数据显示，在PP间隔子的背景中，上铰链组成的排列均未显示显著影响二硫键同种型 的异质性。上文中显示的数据表明，该作用的不存在主要是因为蛋白质包含能够形成分子 内二硫键的核心铰链基序和短PP间隔子。然而，观察到热稳定性的显著差异。天然进化的序 列:ESKP(83.8°C)和EPKS(80.6°C)都比杂合序列:EPKY(76.3°C)和EPKS(79.0°C)更稳定。数 据显示，IgGlEPKS序列是最优选的。
[0355] 为了理解ESKY或EPKS上铰链基序在更优选的DKTHT间隔子区域的背景中的重要 性，产生所有排列。图24中的数据显示，天然IgG4ESKY基序（突变体56ESKYCDKTHTCPSCP)最 易于产生二硫键同种型异质性。数据24的数据确认，天然IgGl上铰链序列（突变体 65EPKSCDKTHTCPSCP)具有最小的二硫键同种型异质性的潜能和具有高的热稳定性。
[0356] 核心铰链Ser至Pro的替换的影响
[0357] 突变最优选的突变体48(EPKSCDKTHTCPPCP)以重新引入天然IgG4核心铰链Ser (Ser241，按照Kabat编号的），从而产生突变体65(EPKSCDKTHTCPSCP)。图20中的数据确认，突 变体48具有极显著降低水平的H2、HL、H和L(与突变体15(ESKYCPPCPSCP)相比较）以及具有 极显著增加的热稳定性。与突变体48相比，核心铰链Ser 241的再引入(突变体65)不影响热稳 定性，但确实导致显著水平的HL的再现。应指出，突变体65仍然具有比突变体15更少的H2、H 和L，这说明了上铰链序列的长度和组成在二硫键同种型同质性方面的重要性。
[0358] 利用细胞裂解的抗体效应子功能测定
[0359] 通过将表达细胞表面抗原的靶细胞与荧光增强配体MDTA-起温育来标记靶细胞 的细胞内内容物。BADTA在细胞内被转化成亲水性配体TDA。将标记的细胞与抗体和PBMC(外 周血单核细胞）（作为裂解剂)一起温育。在细胞裂解(在该实施例中通过ADCC裂解)后，TDA 被释放并且当将铕添加至细胞培养物中时形成荧光的和稳定的螯合物EuTDA。本质上，细胞 内容物的BADTA标记使得能够定量细胞裂解。细胞裂解反过来提供为IgG效应子功能的存在 的量度。图25和26尝试利用IgG4通过ADCC来裂解细胞。将赫赛汀抗体的类似物（曲妥珠单 抗)制备为IgGl野生型和IgG4野生型。在MCF7和SKBR3细胞上表达赫赛汀的Her-2抗原。还产 生了IgG赫赛汀类似物的突变体，纯化IgG以用于ADCC测定。已知IgG4具有极低的进行ADCC 的能力，如通过对照IgGl野生型(wt)与IgG4野生型(wt)之间的差异所确认的。该先天ADCC 潜能的缺乏不受4种测试的IgG4突变体的任一种的影响。值得注意地，此类突变体包括具有 改变的LC-HC链间二硫键排列的突变体28、44和48,最值得注意的是，包含IgGl上铰链和核 心铰链基序的突变体48(EPKS⑶KTHTCPPCP)。因此这些数据显示，描述的突变体并未因为使 用IgGl上铰链和核心铰链序列而获得效应子功能。
[0360]突变体对IgG4抗体的广泛适用性
[0361]到目前为止，所描述的所有数据是关于特定的UCB专有的IgG4抗体Ab 410的数 据。为了证明二硫键同种型同质性和热稳定性的改善并非是编码该IgG的结构/稳定性的可 变区所独有的，产生其它IgG4的试样。将公共可获得的序列信息用于产生3个工业相关IgG: 曲妥珠单抗(赫赛汀）、那他珠单抗(Tysabri)和托珠单抗(Actemra)的IgG4类似物。总的来 说，图28-33中显示的数据显示，IgG4的关键突变体的相对性能在二硫键同种型同质性和相 对热稳定性方面对于所有IgG4试样是高度相似的。每一种试样的绝对稳定性彼此有些不 同，如根据先前公开的关于IgG的不同固有稳定性的观察结果所预期的。这些数据表明，所 描述的突变体能够在所有IgG4分子中改善二硫键同种型同质性和增加热稳定性。
[0362] IgG4突变体对实际考虑因素:表达和宿主细胞的影响
[0363]所描述的突变体在IgG4分子的范围内改善了二硫键同种型同质性且增加了热稳 定性。图27中的数据显示，此类突变体未负面影响IgG4表达。所示的表达数据是，4个描述的 抗原特异性抗体(Ab410和曲妥珠单抗、那他珠单抗和托珠单抗的类似物）中的每一个抗体 的从CHO细胞瞬时表达的每一个突变体的平均表达。这些数据表明，Fab臂链间二硫键结构 以及上铰链和核心铰链序列不是CHO细胞的产率的主要决定因素。图31中的数据显示， Ab410的热稳定性相同，无论突变体是在CHO-Kl细胞中还是在CHO-SXE细胞中表达。这些数 据证实，对IgG Fab臂链间二硫键结构以及上铰链和核心铰链序列的突变是改善的热稳定 性的主要决定因素。
【主权项】
1. 一种IgG4类抗体，其包含至少一个含有CH1结构域和铰链区的重链，其中在每一个重 链中： a. 所述CH1结构域中的根据Kabat编号系统编号的位置127上的链间半胱氨酸被另一种 氨基酸置换;和 b. 位于上铰链区的一个或多个氨基酸被半胱氨酸置换。2. 权利要求1的抗体，其中位于上铰链区中的被半胱氨酸置换的一个或多个氨基酸选 自根据Kabat编号系统编号的227、228、229和230。3. 权利要求2的抗体，其中根据Kabat编号系统编号的位置230上的甘氨酸被半胱氨酸 置换。4. 权利要求2的抗体，其中根据Kabat编号系统编号的位置229上的酪氨酸被半胱氨酸 置换。5. 权利要求2的抗体，其中根据Kabat编号系统编号的位置228上的赖氨酸被半胱氨酸 置换。6. 权利要求2的抗体，其中根据Kabat编号系统编号的位置227上的丝氨酸被半胱氨酸 置换。7. 权利要求1至6的任一项的抗体，其中重链中根据Kabat编号系统编号的位置239上的 半胱氨酸和位置242上的半胱氨酸被另一种氨基酸置换。8. 权利要求1至6的任一项的抗体，其中重链中根据Kabat编号系统编号的位置239上的 半胱氨酸被另一种氨基酸置换。9. 权利要求1至6的任一项的抗体，其中重链中根据Kabat编号系统编号的位置242上的 半胱氨酸被另一种氨基酸置换。10. -种IgG4类抗体，其包含至少一个含有CH1结构域和铰链区的重链，其中在每一个重 链中： a. 根据Kabat编号系统编号的的位置127上的链间半胱氨酸被另一种氨基酸置换;和 b. 根据Kabat编号系统编号的位置239上的半胱氨酸或位置242上的半胱氨酸被另一种 氨基酸置换。11. 权利要求7至10的任一项的抗体，其中位置239上的半胱氨酸和/或位置242上的半 胱氨酸被不含巯基的氨基酸置换。12. 权利要求11的抗体，其中所述不含巯基的氨基酸是丝氨酸。13. 前述权利要求任一项的抗体，其中位置127上的半胱氨酸被不含巯基的氨基酸置 换。14. 权利要求13的抗体，其中所述不含巯基的氨基酸是丝氨酸。15. 前述权利要求任一项的抗体，其中所述重链经突变以在根据Kabat编号系统编号的 氨基酸226与243之间插入3个氨基酸。16. 权利要求15的抗体，其中所述重链经突变以在根据Kabat编号系统编号的位置238 与239之间插入3个氨基酸。17. 权利要求16的抗体，其中在根据Kabat编号系统编号的位置238与239之间插入3个 丙氨酸。18. 权利要求16的抗体，其中在根据Kabat编号系统编号的位置238与239之间插入苏氨 酸、组氨酸和另外的苏氨酸。19. 前述权利要求任一项的抗体，其中根据Kabat编号系统编号的位置241上的丝氨酸 被脯氨酸置换。20. 前述权利要求任一项的抗体，其中位置230上的甘氨酸被半胱氨酸置换，位置227上 的丝氨酸被脯氨酸置换，位置229上的酪氨酸被丝氨酸置换，位置237上的脯氨酸被天冬氨 酸置换，位置238上的脯氨酸被赖氨酸置换，氨基酸序列苏氨酸-组氨酸-苏氨酸被插入在位 置238与239之间，并且位置241上的丝氨酸被脯氨酸置换。21. 前述权利要求任一项的抗体，其中所述重链包含CH2结构域和CH3结构域。22. 前述权利要求任一项的抗体，其中所述抗体包含两条如先前任一权利要求中所定 义的重链。23. 权利要求22的抗体，其中所述重链是相同的。24. 权利要求1至23的任一项的抗体，其中所述重链或每一个重链包含长度为12至17个 氨基酸的上铰链区和核心区。25. 权利要求24的抗体，其中上铰链和核心区的长度为15个氨基酸。26. -种表达载体，其包含编码如权利要求1至25的任一项中所定义的抗体的序列。27. -种宿主细胞，其包含权利要求26中定义的载体。28. 权利要求1至25的任一项中定义的抗体，其用于治疗疾病或障碍。29. -种用于治疗疾病或障碍的方法，其包括施用治疗有效量的权利要求1至25任一项 中定义的抗体。30. -种包含重链的IgG4抗体，所述重链具有上铰链、核心和下铰链，并且其中所述重 链或每一个重链的所述上铰链和核心的长度为12至17个氨基酸，例如15个氨基酸。
【文档编号】A61P35/00GK105859876SQ201610285782
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2011年8月19日
【发明人】D·P·汉弗莱斯, S·J·彼得斯, R·亚当斯, J·黑兹
【申请人】Ucb医药有限公司