一种超疏水微坑阵列芯片及其制备方法与应用

一种超疏水微坑阵列芯片及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一种超疏水微坑阵列芯片及其制备方法与应用。该超疏水微坑阵列芯片包括微坑阵列层，所述微坑阵列层上除微坑或微坑底部以外的表面为超疏水表面。所述超疏水微坑阵列芯片可为：1)微坑以外的表面为超疏水表面，超疏水微坑阵列芯片包括微坑阵列层和贴合在微坑阵列层表面上的超疏水层；2)微坑底部以外的表面为超疏水面，微坑阵列层包括基底层和贴合在基底表面的微孔阵列层，微孔阵列层是由超疏水材料制作的。本发明微坑阵列芯片在构建细胞微阵列过程中可以很低的成本实现细胞微阵列间的完全隔绝，避免细胞阵列之间交叉污染的发生，并且还保证了很好的生物相容性，对各种细胞的正常生长没有明显的影响，适宜于高通量细胞检测和分析。
【专利说明】
一种超疏水微坑阵列芯片及其制备方法与应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种超疏水微坑阵列芯片及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]细胞实验是生物学研究最基本的研究手段之一。很多生物学研究，例如高通量药物筛选，干细胞组合式筛选等，涉及大量的细胞学实验，通过大量的，过程往往极为相似的细胞处理过程实现某些条件或结果的优化;传统实验操作多是由人工手动在多孔板中完成这些细胞实验，费时费力，试剂耗用量很大，研究成本较高。
[0003]细胞微阵列(cell microarray)是通过化学、物理分离方式形成的微小细胞阵列。这样的细胞微阵列因为通量高，试剂消耗量小，成本较低等优势在生物学研究中越来越受到重视。化学方式分离细胞多是通过表面修饰实现，通过对表面做差异化修饰，使细胞只能在特定的阵列位置处生长而形成的细胞点阵。物理分离方式可以通过形成微坑的形式，将细胞阻隔开，多通过注塑成型，或者软光刻(soft lithography)的方式制备。也有同时采用化学物理方法分离的细胞微阵列平台。
[0004]细胞微阵列及实现细胞微阵列的细胞微阵列平台在高通量药物筛选、细胞转染、干细胞分化等研究中具有重要作用。
[0005](I)高通量药物筛选
[0006]药物筛选是一个广义的概念，包含了药物筛选的很多方面。第一，传统意义上新型药物分子的筛选。由于合成方法的进步，以及天然有机分子不断被发现，药物分子库一直在不断扩大，给药靶点也越来越多，药物筛选的工作量急剧地增加。利用高通量细胞微阵列进行高通量药物筛选化合物分子消耗量很小，极大降低了药物筛选的成本。第二，药物筛选还包括针对个人的个体化治疗方案筛选。对于每一个个体，病情的发展以及适用的药物不尽相同，为了进一步提高临床治疗的效果，并且及时有效地遏制病情，我们需要针对个体的情况做初步的药物筛选。这种个性化治疗方案在癌症或其他疑难杂症的治疗中具有非常重要的意义。通常情况下，我们能够得到的病人原代细胞是非常有限的，此时，高通量细胞阵列的意义将会凸显。因为如果能够使用很少量的细胞形成高通量微阵列，那么我们就能够利用少量的原代细胞进行高通量的药物筛选。所以在这种情况下，高通量细胞微阵列平台的作用几乎是无可替代的。
[0007](2)研究细胞基因与表型的关联、探索基因的功能是细胞学研究的重要内容，通过上调、下调或者敲除某个基因，观察细胞的表型，我们有可能能够确定某些基因的功能。高通量的细胞微阵列为这样的研究提供了很好的平台。高通量逆转染、慢病毒转录研究都已经证实细胞微阵列在基因功能研究中的巨大潜力。
[0008](3)干细胞由于它自身独特的全能性和增殖性，在临床的再生医学方面具有非常重要的潜在价值。但是由于干细胞的分化调节是一个多因子影响的过程，干细胞的定向分化增殖是干细胞走向临床治疗的关键障碍。干细胞分化的影响因素包括细胞基质材料、弹性，可溶性/不可溶性因子，基质形貌等等。为了有效分拆这些影响因素，探索干细胞定向分化的微环境，高通量的细胞微阵列是重要的平台。干细胞，尤其是胚胎干细胞，与原代细胞类似，通常能够获得的量是很少的，这种微阵列形式在实际研究中具有很大的吸引力。通过调节、组合各类影响因子，我们可以在细胞微阵列平台上实现高通量的筛选，有效地促进干细胞分化研究。
[0009](4)高通量细胞微阵列在研究细胞分泌物方面也有重要的意义。它在筛选分泌针对特定抗原的单克隆抗体的细胞具有非常明显的优势，相对于传统的有限稀释法，高通量细胞微阵列能够显著提高筛选效率。
[0010](5)在光学超分辨成像领域，随机光学重构显微镜(STORM)是当前分辨率最高的光学显微镜之一。超高分辨成像对生物学的研究具有十分重要的意义。很多亚细胞结构都在微米到纳米尺度，衍射极限的存在限制了我们使用光学显微镜观察这些生物样品。比如细胞的骨架蛋白微丝非常密集，在荧光显微镜下其图像非常模糊，无法看到细节，而电子显微镜的分辨率可以达到Inm左右，非常清楚地呈现了细胞骨架的细节。然而电子显微镜几乎不能做活的样品，特异性也没有荧光显微镜好。超高分辨率荧光显微技术已经逐步发展成熟，但是操作步骤往往较为冗长繁琐，检测效率不高，因此利用高通量细胞微阵列实现高通量超高分辨成像对于加快这一领域的研究和发展具有非常重要的意义。
[0011]总之，高通量细胞微阵列实验平台是具有重要价值的研究平台，无论是在基础研究还是在实际应用中都有非常重要的价值和意义。
[0012]目前高通量细胞微阵列技术平台包括384或者1536孔板(包括相应的自动化机械平台)，高通量微流控生物微反应器，PDMS(Polydimethyl si loxane)/PEG(Polyethyleneglycol)微坑(以及各种其他材料制备的微坑)，以及表面微图案化处理后形成的细胞微阵列等，它们主要存在如下问题:
[0013](I)使用384/1536孔板进行物理分离、形成细胞微阵列用于高通量分析检测，一般都需要采用配套的机械手、或者自动化操作系统，而该操作系统的成本非常昂贵，普通的实验室或者小型药物研发公司根本无力承担。这在很大程度上限制了微孔板上高通量分析检测平台的使用。
[0014](2)近年来，微流控技术的发展为开发新型低成本的细胞检测平台积累了技术基础。通过复杂的栗阀设计，可以形成细胞微阵列，并且能够通过控制栗阀的开关将不同的药物分子特异性地加入不同细胞点阵，从而实现高通量的药物分析。但是这种微流控平台的构建相对复杂，不适于在生物学研究领域大规模推广使用。
[0015](3) PDMS微孔、PEG微孔或者其他各种材料制备的微坑等由于其制备方法简单，成本低廉也逐渐引起人们的重视，成为重要的细胞检测分析平台。但是由于所有的微孔均浸没在同一种培养基中，细胞阵列的微环境无法独立控制，例如，在高通量药物筛选中水溶性分子会发生溶解扩散，因而很难避免交叉污染，限制了这类平台的使用。因此，很多研究者致力于解决这个难题，但是结果并不理想，因为在解决交叉污染问题的同时又将引起其他的问题。例如，有研究者采用油封的方式隔绝微坑，虽然可以在一定程度上解决交叉污染，但是与此同时又带来操作不便等问题。还有研究者采用微柱封死微坑的方式解决交叉污染，这又将引起通气性不足的问题，通气不足将会使得细胞生长状态变差，或者使细胞表型发生异常变化。还有研究通过微接触印刷的方式在二维表面实现点阵化修饰，使得细胞只能够在修饰过的点阵上生长，从而形成细胞微阵列，但是这种方式同样由于生长环境不独立而很难避免点阵之间的交叉污染，并且由于微接触印刷修饰稳定性较差，随着细胞培养时间增长，原本形成的细胞阵列之间会发生重叠。
[0016]此外，目前开发出来的各种进行高通量细胞培养、检测和分析的微器件生物相容性往往较差，无法保证正常的细胞生长状态，限制了这些微器件在高通量细胞生物学实验中的应用。例如，微器件上培养的细胞的倍增时间往往远远大于多孔板中细胞增殖的速度；微器件上的细胞经过一段时间的培养后，细胞表型发生异常变化，如无法表达该细胞的特有蛋白等等。因此，绝大多数的微器件无法进行对环境非常敏感的原代细胞、干细胞的培养和分析，而恰恰原代细胞、干细胞高通量微阵列在个性化医疗，再生医疗的研究探索方面具有非常重要的意义。
[0017]在超分辨成像方面，STORM成像对样品的处理过程极为复杂，借助高通量细胞微阵列实验平台，可以单独控制每个微坑内的独立环境，进行大规模的STORM样品制备，相比于传统的STORM样品制备，效率提升显著，极大的提高了超分辨成像信息密度，降低实验成本。同时，目前尚没有能够有效用于高通量高分辨成像的平台，以往实验多通过逐个样品处理的方式来进行多个样品的高分辨成像，费时费力，效率低下，很大程度上限制了高分辨成像的发展。
[0018]最后，目前各种高通量细胞微阵列器件的操作大多过于复杂，例如需要逐个微坑进行加样或者换液操作，也对这些细胞微阵列器件的应用造成了很大的影响。

【发明内容】

[0019]本发明的目的是提供一种超疏水微坑阵列芯片及其制备方法与应用，该超疏水超微坑阵列芯片低成本、操作简单、能在保证细胞正常生长状态的情况下很好地避免交叉污染，同时可保证良好的生物相容性，极大地降低了高通量细胞分析的成本，并进一步推动了高通量细胞检测技术的推广使用，在高通量药物筛选、高通量超高分辨成像等应用中均发挥重要的作用。
[0020]本发明提供的一种超疏水微坑阵列芯片，它包括微坑阵列层，所述微坑阵列层上设有微坑的表面上除微坑或微坑底部以外的表面为超疏水表面。本发明中的超疏水表面是指与水(或水溶液)的接触角大于150°，滚动角小于10°的表面。
[0021]本发明超疏水微坑阵列芯片由于自身特殊的超疏水修饰，可以自动形成水溶液的微液滴阵列，从而保证微阵列存在物理隔绝，避免了阵列之间的交叉污染。
[0022]上述的超疏水微坑阵列芯片中，所述微坑阵列层的形状、尺寸、深度和加工方式等均不受限制。本发明超疏水微坑阵列芯片的实验通量高，在普通玻片大小(76mm*26mm)的芯片上可以构建1000个以上液滴阵列;试剂消耗量极小，每个微坑的体积约为50nL，极大降低了高通量检测分析的成本。
[0023]所述超疏水微坑阵列芯片可为下述(A)或(B):
[0024](A)所述微坑以外的表面为超疏水表面，所述超疏水微坑阵列芯片包括微坑阵列层和贴合在所述微坑阵列层表面上的超疏水层。
[0025]优选地，所述超疏水层的厚度可为10?150微米(如100微米)。
[0026]所述超疏水层的材质、制备方式不受限制，例如本发明列举了如下例子:将成分如下的超疏水预聚物溶液:24wt %丙基丙稀酸甲酯、16wt % 二甲基丙稀酸乙二醇酯、60wt %1_癸醇(l_decanol)和lwt% 2，2_二甲氧基_2_苯基苯乙酮充分混合后注入两片娃烧化的玻片之间，经紫外灯曝光，即可得到所述超疏水层;贴合在基底层的方法包括不限于本发明所述的方法。
[0027]所述微坑阵列层的材质包括但不限于聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA，PolymethyI methacrylate)，聚碳酸酯(PC，Polycarbonate)、不锈钢、玻璃等。
[0028]为了满足超分辨成像的独特需求，所述微坑阵列层包括基底层和贴合在所述基底表面的微孔阵列层，所述基底层可为超高分辨成像专用光学玻片。该超高分辨成像专用超疏水微坑阵列芯片可满足超高分辨成像时100倍物镜工作距离，并能够实现自动化高通量成像。
[0029](B)所述微坑底部以外的表面为超疏水面，所述微坑阵列层包括基底层和贴合在所述基底表面的微孔阵列层，所述微孔阵列层是由超疏水材料制作的。本发明中的超疏水材料是指可制成超疏水表面的任何材料。
[0030]制备所述基底层的材质包括但不限于聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA，PolymethyI methacrylate)，聚碳酸酯(PC，Polycarbonate)、不锈钢、玻璃等。
[0031]本发明进一步提供了一种上述超疏水微坑阵列芯片的制作方法，它包括将所述微坑阵列层上除微坑或微坑底部以外的表面制作成超疏水表面的步骤。
[0032]所述方法可为下述方法I)或方法2):
[0033]I)将所述微坑阵列层上除微坑以外的表面制作成超疏水表面，它包括如下步骤如下:
[0034]1-a)在所述微坑阵列层中设有微坑的表面粘附一层胶；
[0035]Ι-b)将粘附胶的微坑阵列层按压在超疏水层的表面，静置后揭下微坑阵列层，SP可得到上述微坑以外的表面为超疏水表面的微坑阵列芯片；
[0036]具体地，为了满足超分辨成像的独特需求，制备所述微坑阵列层的方法包括如下步骤:在微孔阵列层的表面粘附一层胶，然后贴合在基底层的表面上，即可得到所述超高分辨成像专用微坑阵列芯片。
[0037]该方法可以实现最小至200微米的精细化修饰，修饰方法可以适用于各种形状的图案化修饰，并且这种修饰方法对于基底微坑芯片材料几乎没有选择性，可以适用于各种材料微坑芯片的超疏水修饰。
[0038]2)将所述微坑阵列层上除微坑底部以外的表面制作成超疏水表面，它包括如下步骤:
[0039]2-a)在基底上建立微柱阵列;所述微柱阵列具体可为负胶微柱阵列，通过曝光显影制的。
[0040]2-b)取另一基底，与步骤2-a)中所述微柱阵列对齐并固定在一起;在两个基底中间的空隙中灌注超疏水预聚物，经固化后分离，即可得到上述除微坑底部以外的表面为超疏水表面的超疏水微坑阵列芯片。
[0041]上述的超疏水微坑阵列芯片在下述1)-8)中任一项中的应用或在制备具有下述1)-8)中任一项所述的功能的产品中的应用，也在本发明的保护范围内。
[0042]I)构建高通量细胞微阵列；
[0043]2)高通量细胞培养；
[0044]3)高通量细胞分析检测；
[0045]4)高通量细胞转染；
[0046]5)高通量药物筛选；
[0047]6)高通量干细胞微环境的组合式筛选；
[0048]7)高通量超分辨成像；
[0049]8)高通量STORM超分辨成像样品制备。
[0050]本发明在上述应用的基础上，进一步提供了一种利用上述的超疏水微坑阵列芯片培养细胞的方法，它包括下述步骤a)_步骤c)中的至少一种:
[0051 ] a)加液步骤，它包括如下步骤:将溶液在所述超疏水微坑阵列芯片上方悬空逐滴滴下，即可完成所述加液步骤；
[0052]b)加细胞的步骤，它为下述b-Ι)或b-2):
[0053]b-1)在所述超疏水微坑阵列芯片中的微坑被液滴充满后，将所述超疏水微坑阵列芯片浸没，然后加入细胞悬液，待细胞自然沉降后即可将完成所述加细胞的步骤；
[0054]b-2)在形成液滴阵列的超疏水微坑中，逐个加入细胞，即可完场所述加细胞的步骤；
[0055]c)换液的步骤，它包括如下步骤:
[0056]c-1)将所述超疏水微坑阵列芯片中加入新鲜的培养液并浸没所述超疏水微坑阵列芯片，通过静置完成新旧培养基的交换；
[0057]c-2)抽走多余的培养液，至重新形成液滴阵列，即可完成所述换液的步骤。
[0058]本发明具有如下有益效果:
[0059](I)由于所述芯片自身独特的超疏水修饰，超疏水微坑阵列可以自动在微坑中形成微液滴阵列，这相对于传统的384孔板中通过机械臂逐孔加入细胞的方式要方便得多。同时，这种微坑阵列上的液滴之间完全是物理隔绝，可以很好地避免交叉污染的发生，因此非常适用于传统高通量平台很难实现的可溶性因子的高通量筛选，例如高通量水溶性药物分子的筛选。
[0060](2)本发明超疏水微坑阵列中细胞微阵列的培养和维持很方便，最突出的优势在于换液非常简单，只需要将原有的液滴阵列浸没于新鲜培养基中静置，等待其充分扩散置换后即可再次形成液滴阵列进行进一步的培养和观察，而无需传统孔板技术逐一进行换液的操作。
[0061](3)本发明超疏水微坑阵列生物相容性极好，完全避免了之前高通量细胞微装置的各种问题:超疏水微坑芯片上的细胞微阵列能够进行超过六天液滴式培养，而之前的微器件上的细胞培养最多只能持续96个小时，绝大部分仅能维持24小时以下;超疏水微坑芯片上细胞微阵列液滴培养的增殖速度与普通24孔板中基本一致，且保持正常的表型，之前的微器件上培养的细胞增殖速度往往显著低于普通孔板中细胞增殖速度;超疏水微坑阵列上可以用于原代细胞和干细胞微阵列的构建和培养，且能够很好地维持这些细胞的本来性质，这在已有的绝大多数的微器件上是不可能实现，在这些微器件上细胞可能无法维持原有的表型，使得微器件上的细胞检测结果失去可信度;超疏水微坑阵列上细胞微阵列经过72h小时的液滴式培养后存活率高于95%，与浸没式培养的结果相近，这表明本发明超疏水微坑阵列芯片培养对细胞生长存活无明显影响。此外，可通过点样加样的方式向不同微坑中加入不同功能分子。高通量细胞转染以及干细胞微环境组合式分析均证明超疏水微坑非常适于各种高通量检测分析。
[0062]总之，本发明超疏水微坑芯片构建细胞微阵列的最大优势在于它在构建细胞微阵列过程中完全不需要传统的384孔技术中使用的昂贵的机械手装置，因此它能够以很低的成本实现细胞微阵列间的完全隔绝，避免细胞阵列之间交叉污染的发生，并且与此同时它还保证了很好的生物相容性，对各种细胞(包括比较敏感的原代细胞和干细胞)的正常生长没有明显的影响，因而非常适宜于高通量细胞检测和分析。
【附图说明】
[0063]图1为实施例1中超疏水微坑阵列芯片的结构示意图。图1中各标记如下:I微坑阵列层、2超疏水层。
[0064]图2为实施例1中微嫁接制备超疏水微坑阵列芯片的流程图。
[0065]图3为实施例1中制备得到的超疏水微坑阵列芯片的照片、微坑SEM照片及接触角照片，其中图3(a)为超疏水微坑阵列芯片的照片，图3(b)为图3(a)中方框区域内的横向SEM照片，图3(c)为图3(b)中方框区域内超疏水层的接触角照片，图3(d)为图3(b)中方框区域内的纵向SEM照片。
[0066]图4为实施例1中制备得到的各种形状和尺寸的超疏水微坑阵列芯片的SEM照片。
[0067]图5为实施例2中超疏水微坑阵列芯片的结构示意图。图5中各标记如下:I基底层、2超疏水微孔阵列层。
[0068]图6为实施例2中原位合成制备超疏水微坑阵列芯片的流程图。
[0069 ]图7为实施例2中制备得到的超疏水微坑阵列芯片的照片。
[0070]图8为实施例3中制备超高分辨成像专用超疏水微坑阵列芯片的流程图。
[0071 ]图9为本发明超疏水微坑阵列芯片中自发的形成液滴阵列。
[0072]图10为使用涂胶棒轻轻扫过超疏水芯片液滴阵列表面的示意图及处理前后的液滴体积方差的实验结果及对应的SEM照片，其中图10(a)为使用涂胶棒轻轻扫过超疏水芯片液滴阵列表面的示意图，图10(b)为处理前后液滴体积方差的实验结果及对应的SEM照片。
[0073]图11为利用本发明超疏水微坑阵列芯片进行高通量细胞微阵列培养及检测分析的示意图。
[0074]图12为利用本发明超疏水微坑阵列芯片进行高通量细胞微阵列培养时所用的抑制液滴挥发的装置，其中，图12a为控制芯片在培养箱中培养时的湿度的装置的结构示意图，图12b为图12a的实物照片。
[0075]图13为利用本发明超疏水微坑阵列芯片进行液滴式培养的实验结果，其中图13a为仓鼠肾细胞BHK-21、人脐静脉血管上皮细胞HUVEC和人慢性髓原白血病细胞K562分别培养48小时、72小时和120小时后的显微照片及Calcein AM/PI染色后的显微照片，图13(b)为仓鼠肾细胞BHK-21、人脐静脉血管上皮细胞HUVEC分别进行液滴式培养和浸没式培养后的存活率，图13 (c)为仓鼠肾细胞BHK-21、人脐静脉血管上皮细胞HUVEC分别进行浸没式培养、液滴式培养和在普通24孔板中进行培养的细胞增殖速度。
[0076]图14为利用本发明超疏水微坑阵列对HUVEC进行培养72小时后的免疫荧光染色显微照片以及成血管化检测的结果，其中14a是CD 31蛋白免疫荧光染色的结果，14b是VE-cadherin蛋白免疫荧光染色的结果，14c是成血管化检测的结果。
[0077]图15为通过喷样技术本发明超疏水微坑阵列中加入不同的荧光染料分子进行高通量分析和检测的实验结果，其中图15a为加入不同荧光染料分子后的照片，图15b为加入不同浓度的荧光染料分子的照片，图15c为图15b对应的荧光强度与荧光染料分子的浓度的线性关系图。
【具体实施方式】
[0078]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0079]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0080]下述实施例中的超疏水聚合物预聚物溶液的成分包括:24wt%丙基丙烯酸甲酯(butyl methacrylate ,BMA)、16wt%:甲基丙稀酸乙二醇酯(ethylene dimethacrylate,EDMA)、60wt% 1-癸醇(l-decanol)和lwt% 2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酬(相对于单体质量总和而言)(2，2-dimethoxy-2-phenylacetophenone ,DMPAP)(全部购自 Sigma-Aldrich)。制备方法为将上述配比的原料在匀浆仪上充分混合Ih后备用。
[0081]下述实施例中的玻片在使用之前均进行清洗和烷基化，清洗步骤为:使用98%浓硫酸和30 %双氧水混合物(体积比= 7:3)清洗玻片30min，再用去离子水清洗玻片三次，氮气彻底吹干备用。烷基化修饰的步骤为:使用20% (体积比)3-(三甲氧基硅基)丙基丙烯酸甲酯(3_(1:1'；[11161:11(?78；[171)口1'(^71 methacrylate)乙醇溶液对上述清洗后的玻片进行浸没即可完成硅烷化修饰，Ih后用丙酮清洗三次，氮气吹干备用。
[0082]实施例1、微嫁接制备超疏水微坑阵列芯片
[0083]超疏水微坑阵列芯片的结构示意图如图1所示，它包括微坑阵列层I和贴合在微坑阵列层表面上的超疏水层2，其中，超疏水层2的厚度为100微米。
[0084]如图1所示，利用微嫁接技术制备超疏水微坑阵列芯片，具体步骤如下:
[0085](a)匀胶:以Dow Corning 3140为例，以7000rpm的转速匀胶30s即可在PMMA层上得到很薄的一层黏胶。
[0086](b)PDMS微坑芯片制备:使用加工好的硅片SU-8模具(由博奥生物芯片公司定制加工生产)，用锡纸包好后作为倒模的容器备用。配制PDMS预聚物溶液，单体与催化剂的体积比为10:1(购自Dow Corning公司，目录号SylgardR 184)，玻璃棒充分搅拌混勾后放入真空烘箱中抽真空30min去除溶液中气泡。再将预聚物溶液倒在SU-8模具上，放入80 V烘箱聚合2h以上再从模具上揭下备用。
[0087](c)将上述PDMS微坑芯片轻轻按压在步骤(a)中得到的薄层黏胶后再揭下即可在微坑芯片的上表面粘附一层薄胶。
[0088](d)取两片硅烷化玻片，在一片玻片的两端贴上150微米后的双面胶条作为spacer，再将另一片玻片粘到上述玻片上，将配置好的超疏水预聚物溶液缓缓注入两片玻片的缝隙中，再置于紫外灯下(302]1111，0^-100000881;[111^1'，1^3)曝光15111；[11。
[0089](e)用刀片撬开两片玻片即可在下层玻片上得到一层ΙΟΟμπι的超疏水层。将该超疏水层浸没在乙醇中清洗三次，吹干后备用。
[0090](f)转移超疏水层:将步骤(c)得到的粘附了薄胶的微坑芯片按压在步骤(e)得到的超疏水层上，静置4h以上后揭下微坑芯片即可在微坑芯片的上层转移一层超疏水层，SP得超疏水微坑阵芯片。
[0091]本实施例制备得到的超疏水微坑阵列芯片的照片、微坑SEM照片及接触角照片，如图3所示。
[0092]本实施例中基于微嫁接技术的超疏水微坑阵列加工方法可以实现最小至200微米的精细化修饰，修饰方法可以适用于各种形状的图案化修饰(如图4所示)，并且这种修饰方法对于基底微坑芯片材料几乎没有选择性，可以适用于各种材料微坑芯片的超疏水修饰。
[0093]实施例2、原位合成制备超疏水微坑阵列芯片
[0094]超疏水微坑阵列芯片的结构示意图(侧面)如图5所示，它包括基底层I和贴合在基底表面的超疏水微孔阵列层2(微孔阵列层2是由超疏水材料制作的)。
[0095]如图6所示，利用原位合成技术制备超疏水微坑阵列芯片，具体步骤如下:
[0096](a)负胶微柱阵列制备:在该硅烷化后的玻片上匀ΙΟΟμπι厚负胶，曝光显影得到高度为ΙΟΟμπι，直径为500μηι，圆心距ΙΟΟΟμηι的微柱阵列。
[0097](b)超疏水层原位聚合:将具有微坑阵列的玻片与另一硅烷化的玻片对齐后使用夹具夹紧，向两玻片间的微柱阵列空隙中将配置好的超疏水预聚物溶液缓缓注入，再置于紫外灯下(302nm, CL-1000 Cross I inker ,UVP)曝光15min，最后用刀片撬开两片玻片即可在无微柱阵列的玻片上得到ΙΟΟμπι深微坑阵列，最后用乙醇清洗三次即可备用，即得超疏水微坑阵列芯片。
[0098]本实施例制备得到的超疏水微坑阵列芯片的照片如图7所示。
[0099 ]实施例3、超高分辨成像专用超疏水微坑阵列芯片
[0100]本实施例是基于超分辨成像的独特需求，对微坑基底阵列制备方式进行了相应调整，超疏水微坑阵列芯片的结构示意图与图1相同，包括微坑阵列层I和贴合在微坑阵列层表面上的超疏水层2，仅是微坑阵列层I由基底层(超高分辨成像专用光学玻片)和贴合在该基底上的微孔阵列层组成。
[0101 ]制作流程如图8所示，具体步骤如下:
[0102](a)匀胶:以Dow Corning 3140为例，以7000rpm的转速匀胶30s即可在PMMA层上得到很薄的一层黏胶。
[0103](b)光刻胶干膜微阵列制备:用100微米厚的光刻胶干膜经过前烘、曝光、后烘、显影等过程得到微孔阵列膜备用。
[0104](C)和(d)将光刻胶微孔阵列膜轻轻按压在该薄层黏胶后再揭下即可在微孔阵列膜上粘附一层薄胶。
[0105](e)贴附微孔阵列膜:将粘附了薄胶的微孔阵列膜按压在超高分辨成像专用光学玻片上，静置4h以上后即可将该膜贴附在光学玻片上。
[0106](f)和(g)制备超疏水层:制备步骤同实施例1中的步骤(c)和(d)。
[0107](h)再次匀胶:以Dow Corning 3140为例，以7000rpm的转速匀胶30sS卩可在PMMA层上得到很薄的一层黏胶。将贴附好的光刻胶微孔阵列膜轻轻按压在该薄层黏胶后再揭下即可在微孔阵列膜上粘附一层薄胶。
[0108](i)微坑阵列芯片的制备:将粘附了薄胶的微孔阵列按压在超疏水层上，静置4h以上后揭下微坑芯片即可在微孔阵列的上层转移一层超疏水层，即得超疏水微坑阵列芯片。
[0109]实施例4、本发明超疏水微坑阵列芯片的效果和用途
[0110]—、自发形成液滴阵列及液滴的均一性
[0111]由于本发明超疏水微坑阵列芯片中的超疏水层对水溶液具有强烈的排斥作用，因此可以自发地形成液滴阵列。形成方式如下:首先将通过悬垂逐滴滴下液滴，利用重力冲击力使得水溶液进入微孔即可在超疏水微坑阵列中形成液滴阵列(如图9所示)；一旦形成液滴后可以将整张芯片浸没，再抽走多余的水溶液又能在微坑阵列中自发的形成液滴阵列，这个过程可以反复循环进行。因此在这个超疏水芯片上可以很方便地形成高通量细胞微阵列，而不需要通过机械臂点样的方式逐个微坑添加细胞形成细胞阵列，同时保证微坑阵列之间完全物理隔绝，基本上避免了交叉污染。
[0112]使用涂胶棒轻轻扫过超疏水芯片液滴阵列表面，可以显著提高液滴阵列的均一性，如图10所示，液滴体积的方差从11 %减小到I %。这说明超疏水微坑阵列可以进行定量检测分析。此外，本发明超疏水微坑阵列的液滴体积在50nL左右，相对于传统多孔板中微升级的体积显著降低了试剂的消耗量，大大减少了高通量细胞检测分析的成本。
[0113]二、本发明超疏水微坑阵列芯片在高通量细胞微阵列的形成、培养中的应用
[0114](D实验材料
[0115]DMEM basic(lX)培养基(货号:C11995500B7)，FBS(Fetal Bovine Serum,胎牛血清，货号:10099-141)，双抗(青霉素penicillin和链霉素streptomycin)(上述均购自Thermal Fisher) oPBS(phosphate buffer saline，磷酸盐缓冲液)pH 7.4basic(I X )(购自 Gibco ,Life technologies ,货号:C10010500BT)，Ca Ice in AM (I丐黄绿素，购自 ThermalFisher,货号C3100MP)，PI (溴化丙啶，购自Sigma Aldrich,货号25535)，福尔马林溶液(购自 Sigma Aldrich,货号252549)，Triton-X 100(购自 Sigma Aldrich，货号X100-500ML)，BSA(牛血清蛋白，Bovine Serum Albumin，购自 AMRES⑶，货号:0332_100g)，鼠抗人CD31 单抗(购自 Sigma，货号SAB4700463_100yg)，鼠抗人VE-cadherin单抗(购自 Santa CruzB1technology，货号:SC-9989)，山羊抗鼠二抗(Alexa Fluor 488 goat ant1-mouseantibody，购自Life Technologies，货号:A10667) ,Tween 20，DAPI(上述试剂均购自SigmaAldrich) ,Matrigel(购自BD公司，货号356231)，胰酶(HyClone Trypsin 0.25%(1 X )solut1nHealthcare Life Sciences,货号:SH30042.01)，仓鼠肾细胞BHK_21(购自英茂盛业生物科技有限公司)、人脐静脉血管上皮细胞HUVEC(购自南京科佰生物科技有限公司，品牌ATCC，产品目录号CBP60340)和人慢性髓原白血病细胞K562(购自南京科佰生物科技有限公司，品牌ATCC，产品目录号CBP60529)。
[0116]荧光倒置显微镜(1X83 ,Olympus)，真空栗(海门市其林贝尔仪器制造有限公司，61^-8028型)，培养箱(冊1^0611 150i J^lgThermal Scientific)
[0117](2)实验步骤:
[0118]A、本发明液滴式培养
[0119]如图11所示，利用本发明超疏水微坑阵列芯片实现高通量细胞微阵列的培养及检测分析，整个细胞微阵列操作主要包括超疏水微坑加液，加细胞，形成液滴，液滴式培养，换液等多个步骤，具体如下:
[0120]I)超疏水微坑加液:由于嫁接的超疏水层对水溶液具有强烈的排斥作用，因此细胞培养液并不能按照常规加液的方式加入，本发明采用悬滴砸入的方式向微坑中加液，即用1mL的吸量管吸取DMEM溶液(HyClone DMEM高糖液体培养基，购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司)后，在芯片上方悬空20cm逐滴滴下，液滴通过重力作用克服超疏水层的排斥进入微坑。
[0121]2)加细胞:目前有两种方式向微坑中加入细胞。第一种方式是当所有微坑中都被液滴充满后，将整张芯片浸没，然后加入细胞悬液，晃匀后使细胞自然沉降，即可将细胞加入各个微坑中。第二种方式是在超疏水微坑中形成液滴阵列后，通过手持加液枪逐个微坑地加入细胞，这样的加入方法所需的细胞数目非常少，可以有望在可获得数量极少的珍贵细胞样品的高通量检测中发挥重要的作用。
[0122]3)浸没式培养:将上述细胞溶液点阵再次用培养基(DMEM高糖培养基，10% FBS,100U/mL青霉素，和100yg/mL链霉素)浸没，逐孔拍照确定起始细胞数目，然后开始液滴式培养。
[0123]4)液滴形成:将浸没芯片的多余培养基完全抽走就可以自发地形成液滴阵列。
[0124]5)液滴式培养:为了抑制高通量细胞微阵列在培养箱中培养时的蒸发，采用套装培养皿放置超疏水芯片(如图12a，12b所示)，并在外层的培养皿中加入灭菌水，保证液滴阵列微环境的空气湿度达到饱和。
[0125]6)换液:经过12h液滴式培养后，加入新鲜培养基浸没超疏水芯片，静置1min，使新鲜培养基可以充分扩散进入超疏水微坑中，完成新旧培养基的交换。在浸没换液的同时逐孔对细胞进行拍照，统计细胞数目，以细胞相对增殖倍数的Ln值为纵坐标，以增殖时间为横坐标绘制细胞的增殖曲线。最后再将多余的培养基抽走，即可重新形成液滴阵列，以便进行进一步的液滴培养增殖。这个过程可以循环往复进行，因此本发明超疏水微坑阵列芯片可以进行高通量细胞微阵列长时间的液滴式培养。
[0126]7)细胞存活率分析:细胞液滴式培养结束后，加入5mL PBS溶液浸没细胞液滴阵列，同时加入50yL Calcein AM(100 X )溶液和5yL PI溶液(1000 X )，混匀后在37°C条件下孵育30min。显微镜下逐孔拍照，观察统计细胞液滴式培养后的存活率。Calcein AM能够在活细胞内酶的作用下水解为钙黄绿素，发出绿色荧光，故绿色荧光通道显示的为活细胞;PI能够穿透死细胞或者凋亡细胞的细胞膜，与细胞核内的DNA双链结合发出红色荧光，所以红色荧光通道显示死细胞或凋亡细胞。
[0127]8)免疫荧光染色实验:HUVEC细胞72h液滴式培养结束后，需要进行免疫荧光染色实验验证其是否能够特异性表达CD31和VE Cadherin两种蛋白。首先在液滴培养结束后用福尔马林溶液固定超疏水芯片上的HUVEC细胞10分钟，再将福尔马林吸去，用PBS洗三次(福尔马林溶液有毒，应收集在废液瓶里)。用封闭液(PBS+0.05% Triton-X 100+2% BSA)封闭2小时。吸去封闭液，用封闭液将抗人CD31抗体稀释100倍，加200uL于微孔上，4度孵育过夜(周围加一些液体，用封口膜封上，防止蒸发变干)。用清洗缓冲液(PBS+0.05% Tween20)洗三次，每次5分钟，缓慢震荡。再用封闭液将二抗稀释100倍，加200uL于微孔上，室温孵育2小时，注意避光。清洗缓冲液洗三次，每次5分钟。加DAPI染色液200uL于组织上，孵育10分钟，PBS洗三遍。注意避光。荧光显微镜观察。VE Cadherin的染色过程类似。
[0128]9)成血管化检测:72h液滴式培养结束后，用PBS溶液浸没液滴阵列，充分扩散交换清洗干净微孔内的培养基，然后将PBS抽走，加入胰酶溶液覆盖住微孔阵列，细胞消化Imin后将胰酶溶液抽走，再加入培养基将芯片浸没，用移液枪逐孔逐片吹打将细胞吹出，然后把细胞溶液转移至离心管中，离心后抽走多余上层清液，使得最终细胞大致浓度为1-3 X 10'5个细胞。与此同时，准备好Matrigel处理的培养皿，将消化得到的HUVEC细胞加到有Matrigel处理的培养皿中，继续培养观察，验证HUVEC细胞是否仍然具有成血管的潜力。
[0129]按照上述步骤对仓鼠肾细胞BHK-21、人脐静脉血管上皮细胞HUVEC和人慢性髓原白血病细胞K562进行液滴式培养，培养条件均如下:37°C，5% CO2培养箱。
[0130]B、对照一:浸没式培养
[0131 ]作为对照，同时将上述细胞进行浸没式培养，步骤如下:
[0132]I)超疏水微坑加液:由于嫁接的超疏水层对水溶液具有强烈的排斥作用，因此细胞培养液并不能按照常规加液的方式加入，这里我们采用悬滴砸入的方式向微坑中加液，即用1mL的吸量管吸取DMEM溶液(HyClone DMEM高糖液体培养基，购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司)后，在芯片上方悬空20cm逐滴滴下，液滴通过重力作用克服超疏水层的排斥进入微坑。
[0133]2)加细胞:第一种加细胞方式为直接浸没超疏水微坑芯片，再向芯片培养皿中加入4-6 X 10~4个细胞溶液。混匀后静置沉降1min抽走多余细胞溶液，即可形成细胞溶液点阵。第二种加细胞方式是在超疏水微坑中形成液滴阵列后，通过手持加液枪逐个微坑地加入细胞，这样的加入方法所需的细胞数目非常少，可以有望在可获得数量极少的珍贵细胞样品的高通量检测中发挥重要的作用。
[0134]3)浸没式培养:将上述细胞溶液点阵再次用培养基浸没，逐孔拍照确定起始细胞数目，然后开始浸没式培养，培养条件37 °C，5 % CO2培养箱。
[0135]4)换液:经过12h浸没式培养后，抽走原来的培养基，再加入新鲜培养基浸没超疏水芯片，然后逐孔对细胞进行拍照，统计细胞数目，以细胞相对增殖倍数的Ln值为纵坐标，以增殖时间为横坐标绘制细胞的增殖曲线。继续进行浸没式培养，每隔12h换一次液。
[0136]5)细胞存活率分析:细胞液滴式培养结束后，加入5mL PBS溶液浸没细胞液滴阵列，同时加入50yL Calcein AM(100 X )溶液和5yL PI溶液(1000 X )，混匀后在37°C条件下孵育30min。显微镜下逐孔拍照，观察统计细胞液滴式培养后的存活率。Calcein AM能够在活细胞内酶的作用下水解为钙黄绿素，发出绿色荧光，故绿色荧光通道显示的为活细胞;PI能够穿透死细胞或者凋亡细胞的细胞膜，与细胞核内的DNA双链结合发出红色荧光，所以红色荧光通道显示死细胞或凋亡细胞。
[0137]C、对照二:普通24孔板培养
[0138]作为对照，同时将上述细胞在普通24孔板中进行培养，步骤如下:
[0139]I)加细胞:直接向24孔板中加入细胞溶液，细胞起始密度与超疏水微孔阵列中细胞密度相当。
[0140]2)培养:将24孔板置于37°C，5% CO2培养箱中培养12h。
[0141 ] 3)计数:经过12h培养后，同时取6个孔统计细胞密度，以细胞相对增殖倍数的Ln值为纵坐标，以增殖时间为横坐标绘制细胞的增殖曲线。
[0142]4)换液:除K562细胞外其他种类细胞均需进行换液操作，除已计数孔外，将其余各孔的培养液抽走，加入同等量的新鲜培养基，继续在37°C,5% CO2培养箱中培养12h，然后再取6个孔统计细胞密度，以细胞相对增殖倍数的Ln值为纵坐标，以增殖时间为横坐标绘制细胞的增殖曲线。
[0143](3)实验结果:
[0144]培养结果如图13所示。本发明超疏水微坑阵列的生物相容性非常好，可以进行超过6天的高通量细胞微阵列培养，可以进行大多数平台很难实现的高通量悬浮细胞微阵列式培养。本发明的超疏水微坑阵列能够进行原代细胞，干细胞的高通量微阵列式长时间培养(图13a所示)；经过数十小时的液滴式培养后，细胞也能够保持较高的存活率，只有不足5 %的细胞会发生凋亡或死亡，与浸没式培养的结果相当(图13b所示)；超疏水微坑芯片上的细胞微阵列培养的细胞增殖速度与普通24孔板中的增殖速度基本一致(图13c所示)。
[0145]本发明超疏水微坑阵列上原代细胞微阵列，以HUVEC为例，经过72h液滴式培养后也能够很好地特异性表达⑶31，VE-cadherin这两种蛋白，同时也维持着成血管化的功能(如图14所示)。
[0146]三、本发明超疏水微阵列芯片在高通量细胞微阵列的分析检测中的应用
[0147]本发明超疏水微坑阵列由于实现了液滴阵列的物理隔绝，因此可以很容易地通过喷样技术将红、绿两种颜色的荧光染料分子(罗丹明B和异硫氰酸荧光素)加入隔列加入不同的微坑中(如图15a所示)，从而实现对细胞微阵列的高通量检测和分析。图15a所示为通过喷样可以将不同颜色的染料加入不同列的微坑中，微坑间无交叉污染发生。此外，本发明还可以实现定量化地加入绿色荧光分子异硫氰酸荧光素，实现对化合物分子的浓度梯度加入(图15b和图15c所示)。
【主权项】
1.一种超疏水微坑阵列芯片，它包括微坑阵列层，其特征在于:所述微坑阵列层上设有微坑的表面上除微坑或微坑底部以外的表面为超疏水表面。2.根据权利要求1所述的超疏水微坑阵列芯片，其特征在于:所述微坑以外的表面为超疏水表面，所述超疏水微坑阵列芯片包括微坑阵列层和贴合在所述微坑阵列层表面上的超疏水层。3.根据权利要求2所述的超疏水微坑阵列芯片，其特征在于:所述超疏水层的厚度为10?200μπιο4.根据权利要求2或3所述的超疏水微坑阵列芯片，其特征在于:所述微坑阵列层包括基底层和贴合在所述基底表面的微孔阵列层，所述基底层为超高分辨成像专用光学玻片。5.根据权利要求1所述的超疏水微坑阵列芯片，其特征在于:所述微坑底部以外的表面为超疏水面，所述微坑阵列层包括基底层和贴合在所述基底表面的微孔阵列层，所述微孔阵列层是由超疏水材料制作的。6.权利要求1-5中任一项所述的超疏水微坑阵列芯片的制作方法，其特征在于:它包括将所述微坑阵列层上除微坑或微坑底部以外的表面制作成超疏水表面的步骤。7.根据权利要求6所述的制作方法，其特征在于:所述方法为下述I)或2): 1)将所述微坑阵列层上除微坑以外的表面制作成超疏水表面，步骤如下: l_a)在所述微坑阵列层中设有微坑的表面粘附一层胶；l_b)将粘附胶的微坑阵列层按压在超疏水层的表面，经静置后揭下微坑阵列层，即可得到权利要求2-4中任一项所述的微坑阵列芯片； 2)将所述微坑阵列层上除微坑底部以外的表面制作成超疏水表面，步骤如下: 2_a)在基底上建立微柱阵列；2-b)取另一基底，与步骤2-a)中所述微柱阵列对齐并固定在一起;在两个基底中间的空隙中灌注超疏水预聚物，经固化后分离，即得权利要求5所述的超疏水微坑阵列芯片。8.权利要求1-5中任一项所述的超疏水微坑阵列芯片在下述I)-8)中任一项或制备具有下述I) -8)中任一项功能的产品中的应用: 1)构建高通量细胞微阵列； 2)高通量细胞培养； 3)高通量细胞分析检测； 4)高通量细胞转染； 5)高通量药物筛选； 6)高通量干细胞微环境的组合式筛选； 7)高通量超分辨成像； 8)高通量STORM超分辨成像样品制备。9.一种利用权利要求1-5中任一项所述的超疏水微坑阵列芯片进行细胞培养的方法，它包括下述a)-c)中的至少一种: a)加液步骤，它包括如下步骤:将溶液在所述超疏水微坑阵列芯片上方悬空逐滴滴下，即可完成所述加液步骤； b)加细胞的步骤，它为下述b-1)或b-2): b_l)在所述超疏水微坑阵列芯片中的微坑被液滴充满后，将所述超疏水微坑阵列芯片浸没，然后加入细胞悬液，待细胞自然沉降后即可将完成所述加细胞的步骤； b-2)在形成液滴阵列的超疏水微坑中，逐个加入细胞，即可完场所述加细胞的步骤； c)换液的步骤，它包括如下步骤: c-1)将所述超疏水微坑阵列芯片中加入新鲜的培养液并浸没所述超疏水微坑阵列芯片，通过静置完成新旧培养基的交换； c-2)抽走多余的培养液至重新形成液滴阵列，即可完成所述换液的步骤。
【文档编号】C12M3/00GK105861309SQ201610232372
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月14日
【发明人】刘鹏, 张鹏飞, 张健雄, 边升太, 程淳, 程一淳
【申请人】清华大学