一株钻井废弃泥浆复合物降解细菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了一株钻井废弃泥浆复合物降解细菌，所述细菌分类名为Sinobaca bifengensis JH2，其保藏编号为CCTCC NO：M 2015519，于2015年9月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉)。本发明同时公开了该细菌在降解钻井废弃泥浆中的应用。该细菌能很好地去除钻井废弃泥浆中的COD和柴油，适应不同钻井泥浆环境能力强，可作为优良降解菌用于废弃泥浆污染生物处理。该细菌在与植物联合修复钻井废弃液的现场处理试验中，能有效降解泥浆中的污染物，处理后环境样品浸出液COD、柴油、硫化物和pH等指标都能达到国家标准。CCTCC NO：M 201551920150910
【专利说明】
一株钻井废弃泥浆复合物降解细菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物菌种及其应用，具体涉及一株钻井废弃泥浆复合物降解细菌 Sinobaca bifengensis JH2及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着我国经济快速发展，对石油、天然气等化石能源需求量日益增大，而石油天然 气钻探过程中所产生的钻井废弃物数量庞大，按所钻井深度（1000~7000m)的不同，可产生 500~4000m 3废水、300~2000m3的废弃渣泥、废弃钻肩和废弃泥浆等难降解物质。这些废弃 泥浆浓缩富集了钻井废水中的所有污染物质成份，以及所有钻井作业过程中所用的30~50 种不同的无机和有机泥浆处理添加剂，具有色度高、有机物污染物含量高、难降解、环境危 害性大等特点。
[0003] 传统的物理化学处理技术大多昂贵且会造成二次污染，目前以微生物、植物处理 为代表的生物处理技术具有很大的应用潜力，在国外已得到广泛应用。例如授权公开号为 CN 101798162B的中国专利文献公开了一种利用植物-微生物联合作用处理油气田然气勘 探钻井作业废弃渣泥的方法，将大多有机物降解为简单的无机物，使得渣泥中的C0D和油类 物质被有效降解，实现钻井废弃物的无害化处理。到目前为止，已分离到能降解有机污染物 的微生物共100余属，200多个种，包括细菌、放线菌、霉菌、酵母菌乃至藻类，这些微生物大 多具有耐盐、降解卤代有机化合物和还原金属的能力。不同微生物利用底物的能力不同，对 有机污染物的代谢机理及代谢途径存在差异，因而有必要从不同环境条件下分离出具有降 解能力的菌种资源，以强化对钻井废弃泥浆中有机污染物的降解效果。
【发明内容】
[0004] 为了促进废弃泥浆生物处理技术的发展，本发明筛选出了一株降解钻井废弃泥浆 复合污染物的细菌，开发出了该细菌的应用方式。该细菌按5 %接种，在中性环境(pH7.0)和 碱性环境(PH9.5)条件下均能很好地去除钻井废弃泥浆中的C0D和柴油，可以适应不同的钻 井泥浆环境，证明该细菌可以作为优良降解菌应用于废弃泥浆污染的生物处理。在该细菌 与植物联合处理钻井废弃液的现场处理试验中，处理后的土壤+泥浆混合体系浸出液C0D、 柴油、硫化物含量和pH等指标与自然土壤接近，联合处理体系表现出了良好的废弃泥浆污 染物处理效果。
[0005] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是开发出了一株钻井废弃泥浆复合物 降解细菌JH2,于2015年9月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，武 汉大学，登记编号为CCTCC Ν0:Μ 2015519,菌株的分类名为Sinobaca bifengensis JH2〇
[0006] 该菌株来源于四川省雅安市碧峰镇的油气田钻井废弃泥浆，经富集培养、分离纯 化得到。该菌属于厚壁菌门，芽孢杆菌科，Sinobaca属，革兰氏阳性，菌落圆形，橘黄色，光滑 不透明，表面湿润，边缘整齐，不产芽孢。能在10-45Γ生长，最适生长温度为28-37Γ;在盐 浓度为1%_20%范围内都能生长，在盐浓度为10%时生长最好;在pH6.0-11.0范围都能生 长，当pH为8.0-9.0时生长最佳。
[0007] 该菌的16S rRNA基因序列SEQ ID(见说明书)所示，将该细菌的16S rRNA基因序列 在GenBank中比对，获得相近代表菌株16S rDNA序列，应用MEGA6.0构建系统发育树，结果表 明该菌株与Sinobaca qinghaiensis处于同一系统发育分支（图2);应用EzTaxon server对 菌株的16S rDNA序列进行比较，相似性最高的菌株为Sinobaca qinghaiensis YIM 70212'相似度为98.9%。
[0008] 将供试菌株与标准菌株Sinobaca qinghaiensis DSM 17008进行DNA-DNA杂交，杂 交率为40.31%，结合生理生化实验结果，将贝2命名为3丨11(*&〇 &1^€6即6118丨8贝2。
[0009] 该细菌按5%接种，在中性环境(PH7.0)和碱性环境(PH9.5)条件下均能很好地去 除钻井废弃泥浆中的C0D和柴油，可以适应不同的钻井泥浆环境，证明菌株JH2可以作为优 良的降解细菌用于废弃泥浆污染的生物处理方面。
[0010]在该细菌与植物联合处理钻井废弃液的现场处理试验中，处理后的土壤+泥浆混 合体系浸出液C0D、柴油、硫化物含量和pH等指标与自然土壤接近，联合处理体系表现出了 良好的废弃泥浆污染物处理效果。
【附图说明】
[0011 ]图 1 为Sinobaca bifengensis JH2光学显微镜照片。
[0012] 图2为Sinobaca bifengensis JH2基于 16S rDNA的系统发育树。
[0013] 图3为Sinobaca bifengensis JH2对泥浆中C0D和柴油的去除率。
【具体实施方式】
[0014]下面结合附图和实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步描述。以下实施例仅 用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
[0015] 实施例1菌株的分离纯化及鉴定
[0016] 1.菌株分离
[0017] ⑴菌株驯化
[0018] 从钻井场周边环境采集农田土壤、林地腐殖质层土壤、以及钻井场附近农户农家 肥堆肥共20份，充分混匀。于广口瓶中装入150ml钻井废弃泥浆，加入50g已混合均匀的样 品，封好瓶口，28°C，150r/min振荡培养10天。随后，取20ml培养物转入另一瓶150ml同样的 废弃物体系中，同法培养7天，如此反复驯化4次。
[0019] ⑵菌株分离纯化
[0020] 取10g驯化的废弃泥浆混合物，加入90ml无菌水混匀制成菌液，取lml菌液加入9ml 无菌水稀释，逐级稀释到1〇_5梯度，分别取1〇_3-1〇_5菌悬液lml，倒入LB培养基混勾，28°C培 养至单菌落出现，挑取单菌落在LB培养基上划线纯化，显微镜镜检无杂菌后转接于牛肉膏 蛋白胨斜面培养基培养24-48h，4°C保存。
[0021] 所用培养基如下：
[0022] LB培养基：10g胰化蛋白胨(Tryptone)，5g酵母提取物(Yeast extract)，5g NaCl， 琼脂18g，调pH至7.4用去离子水定容至1L;
[0023] 普戈二号培养基：（NH4)2S〇4 2.64g，KH2P〇4 2.38，K2HP〇4 5.65g，MgS〇4 · 7H20 1.00g,CuS〇4 · 5H20 0.0064g,FeS04 · 7H20 0.0011g,MnCl2 · 7H20,ZnS04 · 7H20 0.0015g, 琼脂18g，调pH至7.4用去离子水定容至1L。
[0024] 2.菌株的鉴定
[0025] ⑴形态学特征
[0026] 将Sinobaca bifengensis JH2在LB平板划线培养36h，记录单菌落形态，包括菌落 大小、颜色、透明度、湿润度和边缘状态。同时在LB液体培养基中培养至对数生长期，菌株进 行简单染色和革兰氏染色，观察Sinobaca bifengensis JH2菌体形态及革兰氏反应。
[0027] Sinobaca bifengensis JH2在LB固体培养基平板上培养36h后，菌落形态为圆形， 光滑不透明，湿润，橘黄色，边缘整齐，菌落直径1.0-1.2毫米。形态学观察表明，该菌株为球 菌，革兰氏阳性，不产芽孢，菌体直径为0.8-1.0μπι(图1)。
[0028] ⑵生理生化特征分析
[0029]参照《常见细菌系统鉴定手册》，测定菌株的生长pH范围，生长盐浓度范围，生长温 度范围，唯一碳氮源利用情况以及其它生理生化特征。
[0030] Sinobaca bifengensis JH2生长温度范围10-45Γ，最适生长温度为28-37Γ;在 盐浓度为1 % -20 %范围内都能生长，在盐浓度为10 %时生长最好;在pH6.0-11.0都能生 长，在pH8.0-9.0内生长最佳。菌株能够利用棉子糖、D-甘露醇、D-甘露糖、鹿糖、D-木糖、果 糖、甘露醇、麦芽糖、葡萄糖、半乳糖、L-鼠李糖作为唯一碳源生长，不能利用L-阿拉伯糖、L-山梨醇、肌醇、D-阿拉伯糖、纤维二糖、肌糖、肌酸作为唯一碳源生长;氧化酶还原反应、硝酸 盐还原反应、水解淀粉、水解明胶均为阴性，不产H 2S和氨气；过氧化氢酶、葡萄糖产酸、脲 酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶均为阴性。
[0031] (3)16S rRNA序列测定及系统发育分析
[0032] 将纯化后的菌株采用⑶TC法提取细菌总DNA，采用细菌通用引物27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'）和1492R(5'-CTACGG CTA CCT TGT TAC GA-3'）扩增16S rDNA片 段。PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测后送往上海生工测序。
[0033] 将测得的该细菌16S rRNA基因序列应用EzTaxon server对菌株的16S rDNA序列 进行比较，相似性最高的菌株为5：[11(^303 9；[1^1^丨6118丨8打1 702121'，相似度为98.01%。 在GenBank中比对，获得了相近代表菌株16S rDNA序列，应用MEGA6.0构建系统发育树，结果 表明该菌株与Sinobaca qinghaiensis YIM 70212τ处于同一系统发育分支（图2)。在形态 特征、生理生化特征差异较大，结合DNA同源性分析结果，本发明所分离获得的降解菌为新 的种群，命名为Sinobaca bifengensis JH20
[0034] 菌株Sinobaca bifengensis JH2已于2015年9月10日保藏于中国典型培养物保藏 中心(CCTCC)，地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2015519。
[0035] 实例2菌株Sinobaca bifengensis JH2利用废弃钻井液的能力
[0036] 1.菌悬液制备
[0037] 将纯化后的菌种Sinobaca bifengensis JH2接入10mL的LB液体培养基，28°C， 160r/min振荡培养至对数期，8000rpm离心10min收集菌体，用灭菌PBS洗菌3次后重悬，调节 0D600nm= 1 · 0-1 · 2作为菌种悬液备用。
[0038] 2.供试菌株利用聚磺泥浆情况
[0039] 在250mL三角瓶各装入50mL普戈二号液体培养基，分别添加5g/L、10g/L、15g/L、 30g/L和50g/L聚磺泥衆为唯一碳源，配制成培养液，灭菌冷却后按5% (v/v)分别接种 Sinobaca bifengensis JH2菌悬液，28°C、160r/min振荡培养72h，稀释平板法测定菌株数 量，分析菌株Sinobaca bifengensis JH2对聚磺泥衆利用情况。
[0040] 表1不同泥浆添加量对JH2数量影响
[0041]
[0042]表1结果显不，随着普戈二号培养基中聚磺泥衆添加量的增加 ，Sinobaca bifengensis JH2菌落数量逐渐增加，随着泥浆添加量的增加，菌落数量由1.73 X 108cfu/ mL上升至9.20 X 108cfu/mL;尤以添加50g聚磺体系泥衆作为碳源的处理中菌落数量最多。 这表明菌株Sinobaca bifengensis JH2能够以泥衆为惟一碳源生长，而且其长势与泥衆添 加量成正相关。
[0043] 实例3菌株Sinobaca bifengensis JH2对钻井废弃液降解效果实验
[0044]将供试菌株经LB液体培养基培养至对数生长期后，用0.9 %生理盐水洗涤菌体，调 整至浓度一致，按照5% (V/V)的接种量接种至60ml聚磺泥浆中振荡培养5d，每24h测定泥浆 中C0D值和柴油含量变化，重复3次。柴油含量用紫外分光光度法测定，C0D值用HH-5型智能 化学耗氧量测定仪测定。菌株降解率=(空白含量-接菌后含量)/空白含量X 100%。
[0045] 结果表明，菌株Sinobaca bifengensis JH2能够很好去除钻井废弃泥衆中的⑶D 和降解其中的柴油。泥浆原液C0D达6211 lmg/L，接种供试菌株培养5后天，泥浆C0D大大降 低，处理后泥浆⑶D为22370mg/L，⑶D去除率达68% (图3)。尽管泥浆原液中柴油含量较高 (1279mg/L)，接种菌株Sinobaca bifengensis JH2后第5天，废弃钻井废弃液中的柴油降解 率达50% (图3);说明菌株Sinobaca bifengensis JH2在处理钻井废弃泥浆方面具有很大 的应用潜力。
[0046] 实例4接种量和pH对Sinobaca bifengensis JH2降解效果的影响
[0047] 1 ·接种量对Sinobaca bifengensis JH2钻井废弃液降解效果的影响
[0048]将活化的菌株接种于LB液体，28°C，160r/min振荡培养至对数期，同上洗涤后调整 菌液0D为0.6，分别按1.0 %、3.0 %、5.0 %接种量(V/V)接种于50ml钻井废弃液中，28°C， 160r/min振荡培养，每隔24h测定混合液中柴油含量和COD值，以不接菌为对照，重复3次。 [0049]在接种量分别为1.0%、3.0%、5.0%条件下，振荡培养5(1后，钻井废弃泥浆中的 〇30由初始的6230011^/1，降为2709011^/1、2519011^/1和1868011^/1，降解率分别为56.5%、 59 · 6 %和70 · 0% ;同时，柴油含量由初始的1228mg/L降为820mg/L、803mg/L和675mg/L，降解 率38.2%、39.5 %和49.2 %。可见，菌株接种量对钻井泥浆中COD去除和柴油降解影响较大， 随着接种量增加，C0D去除率和柴油降解率均逐渐增大。因此，实际应用中，菌株JH2的接种 量以5%为宜。
[0050] 2.pH对Sinobaca bifengensis JH2降解钻进废弃液效果的影响
[00511同上法，按5%(V/V)最佳接种量，于初始pH 7.0和pH 9.5的50ml钻井废弃液中接 种对数生长期Sinobaca bifengensis JH2菌株，28°C，160r/min振荡培养5d后，测定培养基 中柴油含量和C0D值，以不接菌为空白对照，3次重复。
[0052] 在两种pH条件下，菌株Sinobaca bifengensis JH2对COD的去除率和柴油降解率 无明显差异，在PH7.0和pH9.5条件下培养5d后，钻井废弃泥浆中的C0D由最初的65327mg/L 降为201901^/1和2057011^/1，降解率分别为69.1%和68.5%;对柴油的降解来看，柴油含量 由最初的1295mg/L降为690m g//L和678mg/L，降解率分别为46 · 7%和47 · 6%，可见菌株能在 较广泛的pH范围降解钻井废弃物。
[0053] 实例5 Sinobaca bifengensis JH2降解钻井废弃液的实际应用效果
[0054] 1.现场应用试验
[0055] 在室内先准备好的Sinobaca bifengensis JH2菌剂，使菌体浓度达到1 · 0 X 108cfu/g，细米糠为辅料。供试地点为重庆市壁山县大兴镇的井场，参照授权公开号为 CN101798162B提供的方法，开展天然气钻井废弃泥浆生物处理技术现场应用试验。
[0056] 具体检测步骤为：
[0057] (1)接种降解菌:将准备好的Sinobaca bifengensis JH2菌剂按5:100的重量比加 入至废弃泥浆中，混合均匀;并将自然土壤:泥浆按2:1的重量比加入至上述接种降解菌的 废弃泥浆中，混合均匀；
[0058] (2)表层覆土:将步骤(1)形成的处理层表面覆盖10-15cm的自然土壤；
[0059] (3)种植植物:在表面，栽种槐树，播撒黑麦草种子，形成植物处理层。
[0060] 2.降解效果检测
[0061]分别测定处理前后废弃泥浆、生物处理体系的浸提液C0D值及柴油含量，其含量均 较高;经过20个月处理，两个指标都得到大幅降解，C0D去除率和柴油降解率均达到95%以 上，检出值均已低于国家污水综合排放一级标准，硫化物含量和pH符合标准要求，井场含水 率也在土壤正常含水量范围内（表2)。本实施例说明Sinobaca bifengensis JH2在室外条 件下，与植物联合处理钻井废弃泥浆，效果显著，应用前景良好。
[0062]表2菌株JH2对钻井泥浆的处理效果
[0063]
[0064] 表2中的单位为mg/L，pH除外。
[0065] 本发明中米用的Sinobaca bifengensis JH2菌种的16S rRNA基因序列SEQ ID: KP241934
[0066]
[0067]
[0068] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一株钻井废弃泥浆复合物降解细菌，其特征在于，所述细菌的分类名为Sinobaca bifengensis JH2，GenBank序列登录号为KP241934,保藏编号为CCTCC N0:M 2015519,于 2015年9月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（中国武汉，武汉大学）。2. 如权利要求1所述的细菌在降解钻井废弃泥浆中的应用。
【文档编号】C02F11/02GK105907659SQ201610189170
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年3月29日
【发明人】陈强, 唐雪, 陈翠平, 刘汉军, 刘轶豪, 余秀梅, 赵珂, 徐开未, 廖德聪, 陈立荣, 黄敏, 张凌子, 冷学军
【申请人】四川农业大学