用于同时检测聚合酶链式反应溶液中的dna标靶扩增子的非电动化的光学复用
【专利摘要】本发明提供了一种复用聚合酶链式反应(PCR)DNA检测系统以及一种用于在所述PCR系统内检测DNA的方法。所述PCR DNA检测系统包括彩色电荷耦合器件(CCD)相机、荧光团?猝灭剂探针和成像室。所述荧光团?猝灭剂探针被选择响应于由所述荧光团?猝灭剂探针所猝灭的对应于三种选定的原色和所述CCD相机的峰值通道响应的荧光团，使得所述荧光团的发射谱基本上匹配这三种选定的原色，并且所述荧光团的峰值发射谱对应于所述CCD相机的峰值RGB通道响应。DNA样品和所述荧光团?猝灭剂探针位于所述成像室内。所述彩色CCD相机聚焦于所述成像室以便从所述DNA样品和所述荧光团?猝灭剂探针的荧光同时检测最多三个标靶。
【专利说明】用于同时检测聚合酶链式反应溶液中的DNA标靶扩増子的非 电动化的光学复用
[00011优先权声明
[0002]本申请要求2013年10月14日提交的新加坡专利申请号201307650-0的优先权。
技术领域
[0003] 本发明涉及聚合酶链式反应(PCR)生物分析。具体来说，其涉及用于同时检测PCR 溶液中的DNA标靶扩增子的非电动化的光学复用。
【背景技术】
[0004] 近三十年来，聚合酶链式反应(PCR)已经成为实验室和临床环境两者中广泛使用 的生物测定。随后，实时PCR的出现实现了扩增步骤和检测步骤这两者的自动化。已经开发 了具有高通量和复用特征的多种台式实时PCR装置。最近还开发了覆盖样品制备、DNA提取、 PCR扩增和检测的全自动系统。这些装置能够对细菌和病毒病原体的宿主进行快速、精确和 特异性的诊断。
[0005] 然而，在缺少中心化实验室的发展中国家对于此类床旁(point-of-care，P0C)诊 断存在迫切但尚未满足的需求。便携性是PCR装置的关键P0C特征并且将会影响用于此类系 统的光学模块的设计。便携式系统需要光学模块(i)具有不可移动的组件，（ii)占据较小的 空间，（iii)由电池供电，（iv)具有充分的检测灵敏度，和(v)提供适度的通量和复用。
[0006] 针对中心化实验室所设计的台式PCR装置通常使用可移动的光学组件，使得检测 器(例如电荷耦合器件(CCD)、光电倍增管(PMT)、光电二极管)和激发光源可以使用x-y马达 在96孔板或384孔板的不同区域上自动定位。台式PCR装置还使用电动化的激发、二向色性 和发射滤光轮以使特定光谱带宽的多种探针的检测实现自动化。
[0007] 然而，不存在X-y马达则意味着光电检测器具有与96孔板或384孔板一样大的视 野。另外，激发光需要被大面积投射，并且因此每单位面积的光强度必须足够高，高到可以 检测荧光探针。这需要使用高功率钨灯或汞灯，这与开发便携式P〇C PCR装置的目标产生了 偏离。随着在紫外线(UV)和可见波长范围两者内的高功率(大于5瓦）、高亮度和紧凑型发光 二极管(LED)光源的出现，已经提出了一种对于常规光源的有效且由电池供电（大约12伏） 的替代物。
[0008] 此外，已经在非电动化的光学检测系统的开发中实施了不同的策略。举例来说，单 一蓝色LED已被用于通过荧光共振能量传递(FRET)同时激发具有530nm、640nm和705nm的发 射波长的荧光共辄探针。然后通过三个对应的光电二极管，经由发射带通滤光片和分束器 的级联收集发射光谱。虽然这种光学方案比较便宜，但是由于传输损失，所发射信号的收集 效率被限定在约40-50 %。
[0009] -种常规的解决方案提议使用分光计来检测和解析荧光共辄DNA探针的发射波 长。使用分光计的好处在于，其提供在复用PCR环境中很重要的极佳波长解析。然而，其缺乏 空间解析，并且这需要使用电动化的圆盘传送带在连接到分光计的光学纤维的直观视图中 依序定位DNA样品。备选地，需要并入1维或2维扫描仪以实现空间解析。
[0010] 另一种常规的解决方案提出了基于CCD的荧光计以用于实时PCR。使用470nm LED 作为激发光源，但是代替将发射滤光片级联起来，实施具有6个光学滤光片的旋转盘以提供 在530腦、56〇]1111、61〇11111、64〇11111、67〇111]1和71〇111]1的6个焚光检测通道。虽然解决了收集效率有 限的问题，但是由于需要使旋转盘电动化，因此这种设计更为复杂。
[0011] 另一种常规的装置利用紧凑型的模块化筒体系统，其包括PCR反应室、热循环模 块、4个LED激发光和对应的用于检测的光电二极管。然而，每一筒体仅处理一种患者样品并 且成本较高。此外，集成筒体使复用范围仅限于光学方面，而不是空间与光学复用的组合。
[0012] 另外的一种解决方案实施了实时PCR光学检测系统，其并入有激光器、滤光块、光 电检测器和1X4纤维光学开关，使得可以从4个不同的反应部位获得荧光信号。此类设计似 乎非常适合于便携式PCR系统，借此存在4个部位的空间复用并且整个系统不具有任何可移 动的部件。然而，不存在光学复用，因为激光器产生特定波长的激发，并且二向色镜和发射 滤光片两者都具有带通性质。
[0013]另一种系统利用使用巢式PCR的实时PCR装置，借此扩增后的DNA样品被递送到多 孔芯片上以用于第二轮实时PCR扩增。用特异性引物对和SYBR绿色插入染料预加载每个孔， 以便使用不可移动的基于CCD的荧光成像系统检测单一 DNA标靶。虽然这种系统提供高度的 空间复用，但是它仅具有单个光学通道以供检测之用。
[0014]因此，需要一种便携式系统，其光学模块（i)具有不可移动的组件，（ii)占据较小 的空间，（iii)由电池供电，（iv)具有充分的检测灵敏度，和(v)提供适度的通量和复用。此 外，其它期望的特征和特点将根据随后的【具体实施方式】和随附权利要求书，结合本公开的 附图和背景而变得显而易见。
【发明内容】
[0015] 根据【具体实施方式】，提供了一种复用聚合酶链式反应(PCR)DNA检测系统。所述PCR DNA检测系统包括彩色电荷耦合器件(CCD)相机、荧光团-猝灭剂探针和成像室。所述荧光 团-猝灭剂探针被选择响应于由所述荧光团-猝灭剂探针所猝灭的对应于三种选定的原色 和所述CCD相机的峰值通道响应的荧光团，使得所述荧光团的发射谱基本上匹配这三种选 定的原色，并且所述荧光团的峰值发射谱对应于所述CCD相机的峰值RGB通道响应。DNA样品 和所述荧光团-猝灭剂探针位于所述成像室内。所述彩色CCD相机聚焦于所述成像室以便从 所述DNA样品和所述荧光团-猝灭剂探针的荧光同时检测最多三个标靶。
[0016] 根据另一个方面，提供了一种用于在包括CCD相机的系统中进行PCR检测的方法。 所述方法包括用荧光团-猝灭剂探针光学复用最多三个标靶。所述荧光团-猝灭剂探针被选 择响应于由所述荧光团-猝灭剂探针所猝灭的对应于三种选定的原色和所述CCD相机的峰 值通道响应的荧光团，使得所述荧光团的发射谱基本上匹配这三种选定的原色，并且所述 荧光团的峰值发射谱对应于所述CCD相机的峰值RGB通道响应。
【附图说明】
[0017] 附图用于说明各种实施方案并且用于解释根据一个本发明的实施方案的各种原 则和优势，在附图中类似的参考数字是指遍及单独视图中的相同或功能类似的元件，并且 所述附图连同以下【具体实施方式】一起并入说明书中并且形成说明书的部分。
[0018] 图1示出了根据一个本发明的实施方案的聚合酶链式反应(PCR)系统。
[0019] 图2示出了根据本发明的该实施方案的图1的PCR系统中的发光二极管(LED)光源。
[0020] 图3示出了根据本发明的该实施方案的图1的PCR系统的激发光谱和发射光谱的图 表。
[0021] 图4示出了根据本发明的该实施方案的图1的PCR系统的彩色电荷耦合器件(CCD) 相机的红色、绿色和蓝色(RGB)多波段发射光谱和RGB响应的图表。
[0022]图5示出了根据本发明的该实施方案的图1的PCR系统的多波段滤光片的激发光谱 和发射光谱以及荧光团的激发光谱和发射光谱的图表。
[0023]包括图6A和6B的图6示出了根据本发明的该实施方案的RGB荧光团，其中图6A示出 了采取线性探针构型的RGB荧光团，并且图6B示出了采取发夹探针构型的RGB荧光团。
[0024]包括图7A、7B和7C的图7示出了根据本发明的该实施方案的图1的PCR系统的光绝 缘体，其中图7A是光绝缘体的前视平面示意图，图7B是光绝缘体的俯视平面示意图，并且图 7C示出了并入有该光绝缘体的图1的PCR系统的光学系统。
[0025]包括图8A、8B、8C、8D和8E的图8根据本发明的该实施方案示出了亮黑表面的衬底 材料与铝板衬底材料之间关于来自DNA探针的荧光读出数的信噪比（SNR)的比较，其中图8A 描绘了被放置在亮黑表面上的多孔DNA芯片中的FAM探针，图8B描绘了被放置在铝板上的多 孔DNA芯片中的FAM探针，图8C描绘了被放置在亮黑表面和铝板上的DNA芯片中的每个孔的 荧光读出数的SNR的图表，图8D描绘了被放置在亮黑表面上的PCR反应管中的UV探针的连续 稀释液，并且图8E描绘了被放置在铝板上的PCR反应管中的UV探针。
[0026]包括图9A、9B、9C、9D和9E的图9示出了常规实时PCR系统与根据本发明的该实施方 案的图1的实时PCR系统的荧光读出数之间的相关性，其中图9A描绘了使用荧光素亚酰胺 (:1^111〇代8〇6；[11&111丨(1;^6)131111-!1111：(311；[1^8-(>)皿716探针（例如？4]\1-13现1探针）的3-磷酸甘油 醛脱氢酶(GAPDH)小鼠对照基因在35个循环之后的双重实时PCR荧光读出数，图9B描绘了使 用FAM-BHQ1探针的GATOH小鼠对照基因在25个循环之后的重复实时PCR荧光读出数，图9C描 绘了与常规实时PCR系统的每个循环的类似读出数相比，在使用图1的实时PCR系统的情况 下，图9A和9B的循环中的每个循环的双重读出数的PCR扩增结果的图表，图9D描绘了使用图 9B的探针的图1的实时PCR系统与常规PCR系统的归一化荧光读出数以及在25个循环后相关 联的条形图，并且图9E描绘了使用图9A的探针的两个PCR系统的归一化荧光读出数以及在 35个循环后相关联的条形图。
[0027] 包括图10A、10B、10C和10D的图10示出了在使用常规PCR系统和根据本发明的该实 施方案的图1的PCR系统的情况下，PCR溶液中的Cy3与Cy5荧光的解析，其中图10A描绘的图 表示出了利用常规PCR系统使用FAM共辄DNA探针、Cy3共辄DNA探针和Cy5共辄DNA探针的 GAPDHJ-肌动蛋白和B2M小鼠对照基因的三重实时PCR扩增，图10B描绘了 FAM-GAPDH、Cy3- β-肌动蛋白和Cy5-B2M的终点单重扩增结果，图10C描绘了终点双重扩增结果，并且图10D描 绘了图10C的扩增结果的RGB散点图。
[0028] 图11示出了根据本发明的该实施方案的图1的PCR系统中的光谱上不同的荧光团 的单重、双重和三重混合物。
[0029] 包括图12A和12B的图12示出了使用FAM、Cy5和Alexa 405探针的GAPDH、B2M和β-肌 动蛋白小鼠对照基因的终点PCR扩增结果，其中图12A描绘了FAM、Cy5和Alexa 405的单重反 应，并且图 12B描绘了FAM+Alexa 405、FAM+Cy5和Alexa 405+Cy5的双重反应。
[0030] 图13示出了利用根据本发明的该实施方案的图1的PCR系统，用于将复用PCR溶液 解析成其荧光团分量的基于颜色的去卷积法。
[0031] 本领域的技术人员将了解，示出图中的元件是为了简单和清楚的目的，并且这些 元件不是必需按比例描绘的。举例来说，图解、框图或流程图中的一些元件的尺寸相比其它 元件可以放大，以便帮助加强对本发明的实施方案的理解。
【具体实施方式】
[0032]以下【具体实施方式】在本质上仅仅是示例性的，并且不旨在限制本发明或本发明的 应用和用途。此外，也不打算受本发明的先前背景或以下【具体实施方式】中所提出的任何理 论束缚。本发明的实施方案旨在呈现一种用于实时PCR的完全静态的光学检测系统，其提供 在缺少中心化实验室的发展中国家供诊断之用的便携式床旁(POC)PCR系统。便携式实时 PCR系统有利地具有特征如下的光学模块：（i)具有不可移动的组件，（ii)占据较小空间， (iii)由电池供电，（iv)具有充分的检测灵敏度，和(v)提供适度的通量和复用。此外，所述 定时PCR系统是复用DNA检测系统，其包括彩色电荷耦合器件(CCD)相机、荧光团-猝灭剂探 针和成像室。荧光团-猝灭剂探针被选择响应于由荧光团-猝灭剂探针所猝灭的对应于三种 选定的原色和CCD相机的峰值通道响应的荧光团，使得荧光团的发射谱基本上匹配这三种 选定的原色，并且荧光团的峰值发射谱对应于CCD相机的峰值RGB通道响应。DNA样品和荧光 团-猝灭剂探针位于成像室内，并且彩色CCD相机聚焦于成像室以便从DNA样品和荧光团-猝 灭剂探针的荧光同时检测最多三个标靶。
[0033]参考图1，根据一个本发明的实施方案的PCR系统100包括彩色CCD相机102、完全多 波段激发滤光片104、完全多波段发射滤光片106、具有二向色镜109的完全多波段二向色滤 光块108、光源110、准直透镜112和聚焦透镜114、不透光的成像室116和计算机118。计算机 118通过缆线120例如火线缆线与彩色CCD相机102耦合，并且包括专用图像处理软件。光源 110是宽带UV-可见(例如在380-700nm波长范围内可见)光源，其可以使用汞灯或发光二极 管(LED)以光纤缆线实施。
[0034] 彩色(XD相机102覆盖相当大的视野(例如大约15cmX 15cm)，而多波段滤光片104、 106、108能够对来自成像室116中的荧光团标记DNA探针的三原色进行复用检测。用相机102 捕获荧光图像。然后通过计算机118中的软件对PCR反应中的像素实施基于颜色的去卷积， 以将来自两个或更多个DNA标靶的混合物的荧光解析成其荧光团分量。
[0035]对荧光团进行选择，使得其发射谱几乎匹配三原色红、绿和蓝(RGB)。根据本发明 的该实施方案，DNA荧光探针可以选自Alexa 405、级联蓝（Cascade Blue)或太平洋蓝 (Pacific Blue)以用于蓝光发射谱，选自Alexa 488、荧光素亚酰胺(FAM)或异硫氰酸荧光 素(FITC)以用于绿光发射谱，以及选自德克萨斯红(Texas Red)、Cy5或Alexa 647。优选地， 根据本发明的该实施方案的DNA荧光探针是Alexa 405、Alexa 488和德克萨斯红。非电动化 的光学复用是如下实施的：使用这些DNA荧光探针，利用UV-可见光源110相应地激发这些荧 光团，并经由火线缆线120,通过计算机118上的定制图像分析软件，利用完全三波段滤光装 置(激发滤光片104、发射滤光片106和二向色滤光块108)以及实时控制的RGB相机102来进 行检测。
[0036] 光学系统100可以被广泛地分成4个模块：（i)UV_可见宽带汞光源或LED光源110， (ii)激发滤光片104、发射滤光片106和二向色滤光片108(例如由Rochester，New York, U.S.A.的Semrock公司销售的滤光片），其各自具有兼容的三波长带，（iii)基于CCD的RGB相 机 102和透镜 112(例如由Richmond,British Columbia,Canada的Point Grey Research公 司销售的具有25mm聚焦透镜的Grasshopper2牌基于CCD的RGB相机），和（iv)在计算机118上 执行的用于分析来自相机102的图像的定制图像分析软件（例如使用由Natick， Massachusetts,U.S.A.的The Mathworks公司销售/许可的Matlab Image Acquisition Toolbox所开发的软件）。
[0037] 光源110可以使用萊光源(例如由Wetzlar,Germany的Leica Microsystems销售的 EL6000汞灯）实施。图2示出了一种替代性的光源配置200。在光源配置200中，使用UV LED 202与暖白光可见LED 204的组合作为光源110。额定功率大于5瓦的LED 202、204可以有利 地提供具有380-700nm的宽带UV光谱的光学系统100。根据本发明的该实施方案，光源配置 200是便携式的，因为其可以由12伏电池供电并且有利地配备有散热器和微型风扇（例如5 伏的微型风扇）以用于有效散热。
[0038]滤光块108中的二向色镜109反射来自UV LED 202的光，并且透射来自可见白色 LED 204的光，使得UV可见光束206入射到成像室116中的DNA样品上，光束206是波长范围为 390nm到700nm的UV-可见宽带光束。凸透镜208、210减小来自这两个LED 202、204的光的发 散角，使得光可以有效地耦合入滤光块108中。
[0039]多波段滤光片已经被用于荧光显微术以及荧光原位杂交(FISH)应用中，但是在本 发明的该实施方案之前尚未在实时PCR环境中实施。多波段滤光片的使用产生了特定问题， 例如（i)难以从被杂交到PCR溶液中的对应DNA标靶上的两个或更多个基于荧光的DNA探针 的均质混合物解析每一荧光团分量的相对荧光单位(RFU)，（ ii)CCD偏好500nm到550nm的光 谱带宽，对于450nm以下和600nm以上的波长的灵敏度逐渐降低，（iii)由于单一激发带宽而 导致可能激发两个或更多个荧光团，这是因为所有荧光团都被同时激发并且对应的发射光 谱被同时收集，以及（iv)在两个(或更多个)荧光团之间存在显著的光谱重叠，使得这些荧 光团的混合物可能难以解析。
[0040]本发明的该实施方案解决并且有利地克服了这些问题。参考图3,描绘了根据本发 明的该实施方案的PCR系统100的激发光谱和发射光谱的图表300。沿X轴302对光波长绘图， 并且沿y轴304对透射率百分比绘图。宽带UV-可见光在通过激发滤光片104之后产生透射光 谱306。这个光谱306也被称为激发光谱306并且由二向色镜109反射，因为其不与镜子的透 射光谱308重叠。激发光谱306入射到成像室116中的DNA样品上，并且目的荧光团将发射出 发射光谱310。发射光谱310将通过二向色镜109透射到(XD相机102中，这是因为该CCD相机 被完全容纳在镜子109的透射光谱308中。因此，由用于激发、发射和二向色目的的兼容的三 波段滤光片104、106、108组成的多波段滤光装置检测1号波段312、2号波段314和3号波段 316中的每一个，这些波段312、314、316与目的特定荧光团匹配。根据本发明的该实施方案， 有利地选择三波段滤光片104、106、108以将复用限定在用于最佳荧光团发射区分的三种颜 色，因为在更高阶多波段滤光片中普遍存在的光谱重叠阻碍实时PCR系统中的荧光团分量 的精确解析。
[0041 ]此外，三波段滤光片的发射光谱310与RGB C⑶相机102中的红色、绿色和蓝色通道 的峰值光谱响应重叠，如图4所示。图表400示出了红色、绿色和蓝色(RGB)多波段发射光谱 310和CCD相机102的RGB响应。沿X轴402对光波长绘图，并且沿y轴404对透射率百分比绘图。 多波段发射光谱310的蓝色312、绿色314和红色316分量与彩色CCD相机102的蓝色通道响应 406、绿色通道响应408和红色通道响应410-起绘图。可以从图表400观察到，蓝色406、绿色 408和红色410通道的峰值响应接近于多波段发射光谱310的蓝色312、绿色314和红色316分 量。蓝色分量312主要与相机102的蓝色通道响应406重叠，而绿色分量314主要与绿色通道 响应408重叠，并且红色分量316主要与红色通道响应410重叠。
[0042]因此，根据本发明的该实施方案，每一多波段分量312、314、316在光谱上是不同 的，并且选择这三个荧光团共辄DNA探针以使得(a)荧光团的峰值发射谱对应于CCD相机的 峰值RGB通道响应和三波段发射滤光片的带宽这两者，和(b)荧光团的峰值激发谱对应于三 波段激发滤光片的带宽。参考图5,图表500示出了多波段滤光片104、106、108的激发光谱 306和发射光谱310以及为了在PCR系统100中最佳运转而选择的荧光团的激发光谱506、 508、510和发射光谱516、518、520。沿1轴502对光波长绘图，并且沿7轴504对透射率百分比 绘图。
[0043]可以从图表500看出，所选荧光团的激发光谱506、508、510不应彼此重叠，并且荧 光团的发射光谱516、518、520仅应彼此最小程度地重叠。此外，多波段滤光装置104、106、 108的激发光谱306应对应于荧光团的峰值激发响应506、508、510，并且多波段滤光装置 506、508、510的发射光谱310应覆盖荧光团的峰值发射光谱值516、518、520。
[0044]根据本发明的该实施方案，所选荧光团优选是具有激发光谱506和发射光谱516的 Alexa 405-ProbelSeq.-Dabcyl探针、具有激发光谱508和发射光谱518的Alexa 488- Probe2Seq.-BHQl探针、和具有激发光谱510和发射光谱520的德克萨斯红-Probe3Seq·- BHQ2探针。也符合本发明的该实施方案的标准并且可能潜在地使用的其它荧光团包括级联 蓝和太平洋蓝(代替Alexa 405)、FAM和FITC(代替Alexa 488)以及Cy5和Alexa 647(代替德 克萨斯红）。
[0045] 荧光团德克萨斯红或Cy5、Alexa 488或FAM以及Alexa 405统称为RGB荧光团，因为 它们响应于UV-可见宽带光激发而分别发射红色、绿色和蓝色荧光。参考图6,描绘了荧光团 德克萨斯红或Cy5 602、612、Alexa 488或FAM 604、614以及Alexa 405 606、616。图6A示出 了采取线性探针构型的RGB荧光团602、604、606，并且图68示出了采取发夹探针构型的1?? 焚光团612、614、616。
[0046]焚光团的发射强度由比尔-朗伯定律(Beer-Lambert Law)如下定义：
[0047] Iem=k(i>Iex(l-e-ebc) (1)
[0048] 其中Iem是发射光的强度，k是几何仪器因子，Φ是荧光量子产率，Iex是激发光的强 度，ε是摩尔消光系数，b是光程长度(光通过材料行进的距离），c是荧光团浓度。如果 0.05(其中b = lcm)，则等式1可以近似为等式2:
[0049] Iem=k<})Iexebc (2)
[0050] 假定Alexa 405、Alexa 488和德克萨斯红的消光系数分别是34,0001^011-^71, 000M-Vm-1和85，000M-Vm-1，那么所有三个荧光团都满足等式2实现近似的ebc彡0.05要求， 因为PCR反应中的未猝灭的荧光团的最大浓度被固定在200nM。等式2可以用矩阵表示法如 下表示。
[0052] 等式3可以如下简化：
[0057]如所属领域的技术人员将了解，算法被分成训练阶段和测试阶段，借此在训练阶 段期间通过实施非负矩阵分解(NMF)算法确定矩阵Q，并且其中所有三个矩阵的元都是非负 的。这是通过捕获已知浓度Ctrain的单一荧光团溶液的荧光图像来实现的，其中Itrain将代表 来自目的区域的η个RGB像素的矩阵。
[0058]在测试阶段，如下确定矩阵C:
[0059] Ctest=ItestQ_1 (8)
[0060] 其中Itest代表新的一组η个RGB像素。
[0061] 包括图7A、7B和7C的图7示出了根据本发明的该实施方案的PCR系统100的光绝缘 体702。参考图7A和7B，前视平面示意图700和俯视平面示意图710示出了圆锥形的光绝缘体 702。光绝缘体702的目的是用于防止杂散光漏入光学检测系统中，如图7C所示。图7C示出了 PCR系统100的光学系统720,其并入有光绝缘体702。除了防止杂散光漏入光学检测系统720 之外，圆锥形的绝缘体702还能够使并入有相机102、多波段滤光块108和光源110的光学系 统720直接安装在它上面，例如经由C型安装接口。
[0062]关于绝缘体702,衬底材料的选择对于PCR系统100的运转是至关重要的。关键的 是，绝缘体702的内表面增强而不是抑制来自PCR反应的荧光读出数的信噪比（SNR)。包括图 8A、8B、8C、8D和8E的图8根据本发明的该实施方案示出了被放置在亮黑表面的衬底材料上 的加载有FAM探针的多孔DNA芯片与被放置在反射性铝板衬底材料上的多孔DNA芯片的荧光 读出数的SNR的比较。参考图8A和8B，视图800描绘了被放置在亮黑表面上的多孔DNA芯片中 的FAM探针，并且视图810描绘了被放置在铝板上的多孔DNA芯片中的类似FAM探针。图8C描 绘了来自DNA芯片中的每个孔的荧光读出数的SNR的图表820，其中沿X轴822对孔数绘图，并 且沿y轴对SNR绘图。如从图表820可以看出，对于每个孔来说，来自被放置在亮黑表面上的 DNA芯片中的多个孔的荧光读出数的SNR 826高于来自被放置在铝板上的DNA芯片中的多个 孔的荧光读出数的SNR 828。
[0063]虽然铝板衬底产生来自DNA芯片中的多个孔的荧光读出数的较低SNR，但是铝板的 反射率可能存在问题。举例来说，铝板在UV激发下反射蓝光，从而抑制从UV探针DAPI样品的 实际蓝光发射，如图8D和8E所示。图8D描绘了被放置在亮黑表面上的PCR反应管832中的UV 探针的连续稀释液的视图830,并且图8E描绘了被放置在铝板上的PCR反应管842中的UV探 针的视图840。因此，根据本发明的该实施方案，光绝缘体702是由黑色阳极化铝制造的，以 便对铝赋予亮黑修饰层，从而实现铝材料的SNR降低同时没有反射铝的缺点。
[0064]包括图9A、9B、9C、9D和9E的图9示出了常规实时PCR系统与根据本发明的该实施方 案的实时PCR系统100的荧光读出数之间的相关性。参考图9A，视图900描绘了在小鼠3-磷酸 甘油醛脱氢酶(GAPDH)特异性标靶扩增35个循环之后在两个相同反应中测量的FAM荧光团 的终点荧光读出数902、904。同样地，在图9B中，视图910描绘了同样在小鼠 GAPDH特异性标 靶扩增25个循环之后在两个相同反应中测量的FAM荧光团的终点荧光读出数912、914。
[0065] 图9C描绘了在使用常规实时PCR系统和实时PCR系统100的情况下的对应PCR扩增 结果的图表920,其中沿X轴922对循环数绘图并且沿y轴924对相对荧光单位(RFU)绘图。在 两种情况下（25个循环930、932和35个循环926、928)，结果针对使用常规非便携式实时PCR 系统的相同反应的终点RFU值进行比较。图9D描绘了在25个循环后相关联的PCR系统100的 归一化荧光读出数944、945和常规PCR系统的归一化荧光读出数946、947(沿y轴942绘图）的 条形图940,并且图9E描绘了在35个循环后相关联的PCR系统100的归一化荧光读出数954、 955和常规PCR系统的归一化荧光读出数956、957(沿y轴952绘图）的条形图950。因此，从图9 可以看出，便携式实时PCR系统100提供与非便携式的常规PCR系统类似的检测灵敏度。
[0066] 包括图10A、10B、10C和10D的图10示出了在使用常规PCR系统和根据本发明的该实 施方案的PCR系统100的情况下，PCR溶液中的Cy 3与Cy 5荧光的解析。参考图10A，其中沿X轴 100 2对循环数绘图并且沿y轴1004对RFU绘图的图表1000示出了利用常规PCR系统，使用Cy 3 共辄DNA探针1006、Cy 5共辄DNA探针1008和FAM共辄DNA探针1010的GAPDH、β-肌动蛋白和β-2 微球蛋白（Β2Μ)小鼠对照基因的三重实时PCR扩增结果。Cy3-i3-肌动蛋白1006的扩增似乎较 低，因为常规PCR系统没有针对检测Cy3而进行优化。
[0067] 参考图10B和10C，视图1020(图10B)描绘了常规PCR系统中的FAM-GAPDH、Cy 3-β-肌 动蛋白和Cy5-B2M的终点单重扩增结果，并且视图1030(图10C)描绘了常规PCR系统中的双 重溶液的终点双重扩增结果，其中ProbeixProbe2y代表X份Probei和y份Probe2。从提出的光 学系统测量的Cy3-i3-肌动蛋白的单重扩增的终点荧光读出数与FAM-GAH)H和Cy5-B2M是相 当的，如视图1020所示。视图1030中的双重PCR反应突出了在解析FAMtyS1和FAMkyS2具有 类似颜色特征的Cy3和Cy5方面的难度，并且这在图10D中被观察到，其中三维RGB散点图 1040 显示 Cy3 1042 与 Cy5 1044 以及 FAMtyShiMe 与 FAMtyS1 1048 的显著光谱重叠。
[0068]图11描绘了视图1100，其示出了根据本发明的该实施方案的PCR系统100中的在光 谱上不同的荧光团的单重、双重和三重混合物，其中CxFyDz*别表示X份Cy3、y份FAM和z份 DAPI。视图1100显示PCR溶液中的单重、双重和三重混合物的更宽光谱，其中'洋红'、'青色' 和'黄色'分别指示Cy3与DAPI的混合物(CV)、FAM与DAPI的混合物(FV)以及Cy3与FAM的 混合物(CV)。等量的所有三个焚光团(CbV)产生'白色荧光'。
[0069] 考虑到Cy3与Cy5之间的光谱重叠，选择焚光素亚酰胺Bull-Hutchings-Quayle One (FAM-BHQ1)、Cy5-BHQ2和A1 exa 405-Dabcy 1作为与PCR系统100-起使用的探针组，其中 Cy5优于Cy3，因为与Cy3相比，Cy5与FAM和Alexa 405的光谱分离是更好的。包括图12A和12B 的图12示出了使用所选FAM、Cy5和A1 exa 405探针的GATOH、B2M和β-肌动蛋白小鼠对照基因 的终点PCR扩增结果。参考图12Α，视图1200描绘了FAM、Cy5和Alexa 405的单重反应，并且参 考图 12B，视图 1220描绘了FAM+Alexa 405、FAM+Cy5和Alexa 405+Cy5的双重反应。Alexa 405的背景焚光似乎高于FAM和Cy5的背景焚光。然而，Alexa 405的背景焚光可以通过实施 采用发夹探针构型616(图6B)的Alexa 405来减少，使得Dabcyl可以更有效地猝灭非混杂态 下的荧光，因为其接近荧光团。
[0070] 接下来参考图13,图解1300描绘了利用根据本发明的该实施方案的PCR系统100将 复用PCR溶液解析成其荧光团分量的基于颜色的去卷积。使用以上等式1到8的基于颜色的 去卷积算法，将如视图1310所示的FAM+Alexa 405、FAM+Cy5和Alexa 405+Cy5的双重反应物 解析成Cy5、FAM和Alexa 405荧光团分量 1320、1330、1340。
[0071] 因此，可以看出，便携式实时PCR系统100克服了现有技术系统的缺点并且提供特 征如下的系统：（i)具有不可移动的组件，（ii)占据较小空间，（iii)由电池供电，（iv)具有 充分的检测灵敏度，和(v)提供适度的通量和复用。根据本发明的该实施方案的便携式实时 PCR系统100包括光学系统，该光学系统并入有RGB彩色CCD相机102、完全多波段滤光系统 (包括滤光片104、106和具有二向色镜109的滤光块108)、RGB荧光探针、UV-可见光源110、不 透光的成像室116和能够由计算机118执行的基于颜色的去卷积算法(等式1到8)。
[0072] PCR系统100的关键有利特征包括：（i)其是非电动化的，并且因此可以被并入需要 荧光读出的床旁诊断设备中，（ii)其能够经由去卷积程序在复用反应中对荧光团进行实时 和终点定量，和（iii)其允许光学复用最多3个标靶以及空间复用，因为装置中的CCD相机和 聚焦透镜保留空间信息。为了实现最佳性能，多波段滤光片104、106、108需要具有与所用的 荧光探针的光谱特性和RGB相机102的峰值光谱响应这两者匹配的光谱特性。举例来说，对 应于Alexa 405和德克萨斯红探针的多波段滤光片104、106、108的激发带宽和发射带宽可 以被定制成更宽，因为与Alexa 488相比，对于这些探针来说，RGB相机102的CCD灵敏度通常 更差。在实验室装置中，UV-可见光源110理想地使用汞灯/氙灯来实施，但是对于便携式户 外装置，如光源配置200中所示的组合了 UV与可见白光LED的紧凑型光源110将是优选的。 [0073]除了实时和终点PCR检测之外，PCR系统100的使用可以延伸到其它应用领域，例如 DNA微阵列、基于荧光的酶联免疫吸附分析(ELISA)和活的/死的染色系统。光学系统720可 以作为实施这些测定法中的一个或多个的集成装置的部分而实现，或备选地，除了该光学 系统提供高度特异性的复用荧光读出数以外，其可以是类似于凝胶成像装置的独立荧光读 取器。
[0074]虽然系统100被设计成检测Alexa 405、Alexa 488和德克萨斯红荧光团，但是满足 多波段滤光片和相机的必需光谱特性的其它荧光团也可以潜在地使用，例如级联蓝和太平 洋蓝(代替Alexa 405)、FAM和FITC(代替Alexa 488)以及Alexa 647和Cy5(代替德克萨斯 红）。探针可以采取线性或发夹构型(分别参见图6A和6B)。此外，光学系统720也可以用于从 例如SYBR Green、DAPI和碘化丙啶等其它常用染料读取荧光。
[0075]颜色去卷积已经在组织学上被传统地用于从使用光学显微镜获取的图像解析基 于吸光度的染料，例如苏木精、曙红和DAB。在PCR系统100中，颜色去卷积针对荧光图像被有 利地改写，其中重点放在荧光发射与荧光团浓度之间的关系上，而不是常规PCR系统中的透 射光与染料浓度之间的关系上。包括等式1到8的去卷积算法是基于NMF方法，其明显比许多 常规PCR系统所使用的标准线性去卷积方法更直观，因为NMF在每一荧光团非负面地构成总 体荧光强度的约束下运转。另外，与常规方法相比，NMF在检测低荧光信号方面更有效。 [0076] NMF先前已被用于组织学图像中的高达最大两次染色的盲法颜色去卷积，但是根 据本发明的该实施方案，荧光图像需要被去卷积成三个荧光团分量。因此，NMF去卷积算法 已经有利地经过修改，从而引入训练阶段和测试阶段，借此在训练阶段中使用NMF以确定去 卷积矩阵(等式5到7)，此后在测试阶段中使用矩阵对荧光团分量进行定量。与线性颜色去 卷积相比，NMF在算法上更为复杂并且是迭代的。然而，根据本发明的该实施方案的PCR系统 100中使用的NMF版本已经有利地经过修改，从而实现收敛并且最小化迭代次数。虽然在本 发明的前述【具体实施方式】中已经呈现了示例性实施方案，但是应了解存在大量的变化形 式。
[0077]应进一步了解，示例性实施方案仅是示例，并不旨在以任何方式限制本发明的范 围、适用性、操作或配置。事实上，前述【具体实施方式】将向所属领域的技术人员提供关于实 施本发明的示例性实施方案的便利的路线图，应理解在示例性实施方案中描述的元件的功 能和配置以及操作方法可以进行各种改变而不会脱离如随附权利要求书中所述的本发明 的范围。
【主权项】
1. 一种复用聚合酶链式反应(PCR)DNA检测系统，其包括： 彩色电荷耦合器件(CCD)相机； 荧光团-猝灭剂探针，所述荧光团-猝灭剂探针被选择响应于由所述荧光团-猝灭剂探 针所猝灭的、对应于三种选定的原色和所述CCD相机的峰值通道响应的荧光团，使得所述荧 光团的发射谱基本上匹配所述三种选定的原色，并且所述荧光团的峰值发射谱对应于所述 C⑶相机的峰值RGB通道响应；以及 用于定位DNA样品和所述荧光团-猝灭剂探针的成像室， 其中所述彩色CCD相机聚焦于所述成像室以便从所述DNA样品和所述荧光团-猝灭剂探 针的荧光同时检测最多三个标靶。2. 根据权利要求1所述的复用PCR DNA检测系统，其进一步包括光学滤光装置，所述光 学滤光装置包括完全多波段激发、发射和二向色滤光片，所述荧光团-猝灭剂探针进一步被 选择响应于对应于所述完全多波段滤光片的带宽的所述荧光团的激发谱。3. 根据权利要求2所述的复用PCR DNA检测系统，其中所述荧光团-猝灭剂探针被选择 进一步响应于对应于所述完全多波段滤光片的带宽的所述荧光团的发射谱。4. 根据权利要求2或权利要求3所述的复用PCR DNA检测系统，其中所述完全多波段滤 光片包括三波段激发滤光片。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的复用PCR DNA检测系统，其中所述成像室是不透 光的成像室，所述系统进一步包括用于将激发光提供给所述成像室中的所述样品和所述荧 光团-猝灭剂探针的光源。6. 根据权利要求5所述的复用PCR DNA检测系统，其中所述光源包括由电池供电的光 源。7. 根据权利要求5或权利要求6所述的复用PCR DNA检测系统，其中所述光源包括发射 在紫外到可见电磁光谱中的光的宽带UV-可见光源。8. 根据权利要求7所述的复用PCR DNA检测系统，其中所述宽带UV-可见光源选自包括 汞光源、氙光源和LED光源的组。9. 根据权利要求5至8中任一项所述的复用PCR DNA检测系统，其中所述光源包括光纤 光传输装置，所述光纤光传输装置用于对所述成像室中的所述样品和所述荧光团-猝灭剂 探针提供所述激发光。10. 根据权利要求1至9中任一项所述的复用PCR DNA检测系统，其进一步包括耦合至所 述CCD相机的计算装置，所述计算装置用于响应于将来自所述DNA样品的荧光解析成其荧光 团分量而检测所述成像室中的所述最多三个标靶，所述检测是通过所述计算装置对来自所 述成像室的未猝灭的荧光团激发发射的被所述CCD相机捕获的图像像素执行基于颜色的去 卷积方法来进行的。11. 根据权利要求10所述的复用PCR DNA检测系统，其中所述基于颜色的去卷积方法包 括基于非负矩阵分解(NMF)的颜色去卷积方法。12. 根据权利要求10或权利要求11所述的复用PCR DNA检测系统，其中所述基于颜色的 去卷积方法是响应于将所述系统用于使用预定标靶的复用PCR反应的多个训练阶段和测试 阶段而导出的。13. -种用于在包括电荷耦合器件(CCD)相机的系统中的聚合酶链式反应(PCR)检测的 方法，所述方法包括： 用荧光团-猝灭剂探针光学复用最多三个标靶，所述荧光团-猝灭剂探针被选择响应于 由所述荧光团-猝灭剂探针所猝灭的、对应于三种选定的原色和所述CCD相机的峰值通道响 应的荧光团，使得所述荧光团的发射谱基本上匹配所述三种选定的原色，并且所述荧光团 的峰值发射谱对应于所述CCD相机的峰值RGB通道响应。14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述系统进一步包括三波段激发滤光片，并且其 中光学复用所述最多三个标靶的步骤进一步包括通过所述荧光团-猝灭剂探针光学复用所 述最多三个标靶，所述荧光团-猝灭剂探针进一步被选择响应于对应于所述三波段激发滤 光片的带宽的所述荧光团的激发谱。15. 根据权利要求14所述的方法，其中光学复用所述最多三个标靶的步骤进一步包括 通过所述荧光团-猝灭剂探针光学复用所述最多三个标靶，所述荧光团-猝灭剂探针进一步 被选择响应于也对应于所述三波段激发滤光片的带宽的所述荧光团的发射谱。16. 根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述荧光团的所述峰值发射谱对 应于选自包括Alexa405、FAM和Cy5、Alexa 488和德克萨斯红的组的发射谱。17. 根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其进一步包括使用基于非负矩阵分解 (NMF)的颜色去卷积方法确定所述最多三个标靶的最多三个组成荧光团的步骤。18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述基于NMF的颜色去卷积方法是响应于包括使 用预定标靶的复用PCR反应的多个训练阶段和测试阶段而导出的。
【文档编号】C12Q1/68GK105960466SQ201480068082
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2014年10月14日
【发明人】应仪如, S·K·库马拉萨米
【申请人】新加坡科技研究局