一种碳量子点‑铜离子荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于纳米材料制备技术领域，具体涉及一种以柠檬酸为碳源，尿素为氮源，利用微波水热合成法制备水溶性碳量子点-铜离子荧光探针，及其在快速非酶环境下检测葡萄糖中的应用。

背景技术：

随着经济高速发展和工业化进程的加速，及生活方式发生改变和老龄化进程的加速，使我国糖尿病的患病率呈快速上升的趋势，成为继心脑血管疾病、肿瘤之后另一个严重危害人民健康的重要慢性非传染性疾病。据who估计，2005-2015年，中国由于糖尿病及相关心血管疾病导致的经济损失达5577亿美元。而近年的多项调查表明，无论是欧美发达国家还是发展中国家，糖尿病控制状况均不容乐观。糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害和功能障碍。糖尿病存在家族发病倾向，1/4～1/2患者有糖尿病家族史，1型或2型糖尿病均存在明显的遗传异质性。1型糖尿病有多个dna位点参与发病，其中以hla抗原基因中dq位点多态性关系最为密切。针对2型糖尿病已发现多种明确的基因突变，如胰岛素基因、胰岛素受体基因、葡萄糖激酶基因、线粒体基因等。糖尿病一旦病发，病情将不可逆转。我国党和政府十分重视以糖尿病为代表的慢性非传染性疾病的防治工作，对糖尿病和高血压患者的管理自2009年开始作为促进基本公共卫生服务均等化的重要措施，已纳入深化医疗卫生体制改革的3年实施方案中。

众所周知，传统检测血糖的方法大致分为两类：葡萄糖酶检测法和非酶检测法。葡萄糖氧化酶法，可以用来测定血清(浆)葡萄糖。葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase,god)利用氧和水将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并释放过氧化氢。然而，葡萄糖酶检测方法一般有很多缺点，例如葡萄糖氧化酶成本高，并且对实验条件要求苛刻，需要适宜的温度，ph，盐度条件下进行反应，不能快速高效地检测葡萄糖。因此，探索先进的葡萄糖检测方法是至关重要的。非酶法检测葡萄糖，是一种成本低，简单易行的新型检测方法。尤其是对于大批量待检测葡萄糖样品有着广阔的应用前景。然而，非酶法检测葡萄糖大多为电化学催化法，在电极表面负载碳量子点和金属纳米材料，催化氧化葡萄糖发生反应。在最近这些年，很多复合纳米材料已经被报道具有改善电化学法检测葡萄糖的能力。然而，持续的电流对碳量子点的稳定性具有损伤，并且发生的氧化反应易对电极产生氧化，因此一直严重的限制着电化学法检测葡萄糖稳定性的实际应用，困扰着广大研究者。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明的目的之一是设计合成一种基于碳量子点-铜离子荧光探针。

本发明的目的之二是提供一种基于碳量子点-铜离子荧光探针的制备方法。

本发明的目的之三是提供基于碳量子点-铜离子荧光探针在非酶环境下有效检测葡萄糖的方法。

本发明采用的技术方案是：一种碳量子点-铜离子荧光探针，所述的碳量子点-铜离子荧光探针是cqds/cu²⁺，cu²⁺的浓度为300-2000μm。

一种碳量子点-铜离子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

1)碳量子点cqds制备：以柠檬酸为碳源，尿素为氮源，将柠檬酸、尿素与超纯水混合后，转移到反应釜中，放入防爆膜，密封，在微波水热合成仪中微波加热，得到悬浊液；将悬浊液静置，冷却至室温，过滤，取滤液离心，弃上层清液，所得产物置于透析袋中，在4℃阴暗的条件下，透析24h，每8h换一次超纯水，得到碳量子点cqds溶液；

2)cqds/cu²⁺的制备：将铜盐溶液溶于cqds溶液中，搅拌，得cqds/cu²⁺。

优选的，上述的一种碳量子点-铜离子荧光探针的制备方法，按质量比，柠檬酸:尿素＝1:1。

优选的，上述的一种碳量子点-铜离子荧光探针的制备方法，步骤1)中，微波水热合成仪中微波加热具体为：分四个阶段，第一阶段，升温至120℃，加热15-20min；第二阶段，升温至150℃，加热15-20min；第三阶段，升温至180℃，加热15-20min；第四阶段，升温至210℃，加热反应2-2.5h；微波水热合成仪设置功率为1000w，压力为1.0-1.5mpa。

优选的，上述的一种碳量子点-铜离子荧光探针的制备方法，步骤1)中，滤液离心时，先以1500rpm低速离心10min后，再以3500rpm高速离心5min。

优选的，上述的一种碳量子点-铜离子荧光探针的制备方法，步骤1)中，透析袋的截留分子量为3500da。

优选的，上述的一种碳量子点-铜离子荧光探针的制备方法，步骤2)中，所述的铜盐是cuso4。

一种碳量子点-铜离子荧光探针在非酶环境下检测葡萄糖中的应用。方法如下：于含有葡萄糖的待测样品中，加入上述的碳量子点-铜离子荧光探针cqds/cu²⁺，混合均匀，调节溶液的ph为7，于80℃下加热10min，冷却至室温后用荧光仪检测。

量子点具有较强的荧光性能。量子点主要存在三种类型，金属量子点、半导体量子点和碳量子点，结合发光性能，合成方法，稳定性等方面，本发明选择碳量子点(cqds)。碳量子点无毒害作用，对环境的危害很小，制备成本低廉。相比半导体量子点，cqds是一种具有相似光学性能的环境友好型荧光纳米材料，除拥有光学性能优良，尺寸小等传统半导体量子点所具备的优点外，其还具有细胞毒性低，生物相容性好，易于大规模合成及功能化修饰，制备成本低廉和反应条件温和等无可比拟的优势。它在包括改进生物传感器，医学成像设备和微小的发光二极管的很广的领域中都有应用前景。本发明，将cqds和cuso4复合构成的cqds/cu²⁺荧光探针体系，可在一定程度上有效的检测溶液中的葡萄糖。本发明通过cqds溶液加入cu²⁺后，表面能量从cqds(能量供体)转移到cu²⁺(能量受体)，使cqds荧光猝灭。复合纳米材料cqds/cu²⁺具有稳定的荧光性能，其作为荧光探针显示特有的优势，还具有一定的催化能力，加速铜离子与葡萄糖反应，有效检测低浓度葡萄糖。

本发明一种基于碳量子点-铜离子荧光探针的非酶检测葡萄糖溶液过程分析：碳量子点的合成方法有多种，一般可分为2类：自上而下合成法和自下而上合成法。其中自下而上合成法中，以大分子有机物为原材料，一般是通过碳化的方式将大分子变成小分子，碳化过程中除去了大量非碳物质，产率较高。能满足如荧光标记或生物成像等应用。本发明利用微波水热这种自下而上合成法，以柠檬酸作为制备碳量子点的碳源，尿素作为氮源，在未经修饰的条件下，量子产率高，不仅有效制备高荧光强度碳量子点并且大幅度缩短反应时间。在cu²⁺加入后，由于cqds含有大量氨基基团，对cu²⁺具有亲和性，cu²⁺与cqds结合构成了碳量子点-铜离子荧光探针体系(cqds/cu²⁺)，能够有效的检测葡萄糖。本发明通过在cqds溶液中加入cu²⁺，使cu²⁺有效的降低了cqds的荧光强度，这个方法应用在葡萄糖溶液的检测中。一方面，复合纳米材料cqds/cu²⁺具有稳定的荧光性能可以作为荧光探针直接检测葡萄糖，另一方面，还具有一定的催化能力，加速铜离子与葡萄糖反应，有效检测低浓度葡萄糖。经过一系列的化学反应，葡萄糖与铜离子反应生成氧化亚铜，从而碳量子点表面上的铜离子得到释放，最终cqds荧光强度得到恢复。同时葡萄糖被氧化为葡萄糖酸，作为副产物无毒无害易处理，对cqds荧光强度不产生任何干扰。进一步说，复合纳米材料cqds/cu²⁺的加入可以加速葡萄糖氧化反应，进一步提高检测葡萄糖的效率和限度。

本发明的有益效果：本发明的基于碳量子点-铜离子荧光探针不仅具有传统荧光探针检测的优点，更值得关注的是在非酶的条件下检测葡萄糖。葡萄糖氧化酶检测葡萄糖中，酶是蛋白质的一种，保存和使用对环境的要求较为苛刻，例如温度，ph，盐度均会对酶检测葡萄糖的效率造成影响。与葡萄糖氧化酶检测葡萄糖相比，本发明在针对非酶条件下快速检测葡萄糖的应用上有了大幅度提高，同时简化了实验条件和难度。另外，由于碳量子点具有较好的发光性能，即使低浓度的反应也可以通过荧光的猝灭或恢复观察到，在本发明中较低的葡萄糖可以被检测到，结果表明cqds/cu²⁺荧光探针进一步提高了检测葡萄糖的效率。本发明的荧光探针具有新颖、简单、成本低等特点，可广泛应用于血糖、尿糖的葡萄糖检测领域，前景广阔。

附图说明

图1是cqds的透射电镜分析(tem)图。

图2a是cqds的紫外可见光谱(uv-vis)图。

图2b是cqds的荧光光谱图。

图3a是不同ph对cqds荧光强度影响的荧光光谱图。

图3b是不同温度对cqds荧光强度影响的荧光光谱图。

图4是cu浓度对cqds荧光强度影响的荧光光谱图。

图5是不同ph条件下，相同浓度葡萄糖溶液对cqds/cu²⁺体系荧光强度影响的柱状比较图。

图6a是ph＝7.0的条件下，不同浓度葡萄糖溶液对cqds/cu²⁺体系荧光强度影响的荧光光谱图。

图6b是葡萄糖溶液与cqds/cu²⁺体系的线性关系图。

图7是ph＝7.0的条件下，干扰物溶液对cqds/cu²⁺体系荧光强度影响的荧光光谱图。

图8是cqds/cu²⁺检测葡萄糖的机理图。

具体实施方式

实施例1一种新型基于碳量子点-铜离子的荧光探针

(一)制备方法

1、制备碳量子点(cqds)溶液

用超纯水机up取超纯水，将0.1g柠檬酸，0.1g尿素与40ml超纯水混合后，转移到反应釜中，放入防爆膜，密封，放置在微波水热合成仪中，设置功率为1000w，压力为1.5mpah，分四个阶段进行加热，第一阶段，升温至120℃，加热15-20min；第二阶段，升温至150℃，加热15-20min；第三阶段，升温至180℃，加热15-20min；第四阶段，升温至210℃，加热反应2h，得到棕色悬浊液。将棕色悬浊液放入到通风橱中静置，冷却至室温，先用布氏漏斗(滤纸滤径为15～20μm)过滤，滤除大块物质，取滤液。将滤液用离心机先以1500rpm低速离心10min后，再以3500rpm高速离心5min，弃上层清液，得到棕色透明产物。将棕色透明产物置于截留分子量为3500da的透析袋中，在4℃阴暗的条件下，透析24h，平均每8h换一次超纯水，得到碳量子点cqds溶液。

2、制备碳量子点-铜离子(cqds/cu²⁺)溶液

按体积比1:1，取浓度为2000μm的cuso4溶液和步骤1制备的碳量子点cqds溶液，混合均匀，得到cu²⁺浓度为1000μm的基于碳量子点-铜离子的荧光探针cqds/cu²⁺溶液。放置避光阴暗处待用。

(二)检测

(1)cqds的透射电镜分析(tem)图

用胶头滴管吸取cqds溶液，将滤纸垫在铜网下方，滴一滴cqds溶液在铜网上迅速散开，待烘干后检测。

如图1所示，cqds纳米粒子成球形，均匀分布，无杂质无重叠，证明通过微波水热法成功的合成了cqds。其中，随机抽取100个cqds对其粒径进行测量，微波水热法合成的cqds粒径平均尺寸约为1.40nm，符合一般碳量子点的尺寸。

(2)cqds的紫外可见光谱(uv-vis)和荧光光谱图的分析

通过对图2a的分析，在246nm和351nm波长处看到两个强吸收峰，以紫外分光光度法可以得到，其中一个吸收峰出现在245nm波长下，这属于双键，共轭双键和苯环的π→π*电子跃迁。另一个吸收峰出现在351nm波长处，属于双键杂原子的n→π*电子跃迁。图2b显然可以看出，不同激发波长条件下得到的荧光强度曲线不同，荧光强度随波长310nm至355nm的上升而不断增强，在355nm波长激发下，荧光强度达到制高点，随后在波长355nm至390nm处，荧光强度随激发波长的增大而下降。便携紫外灯的激发波长通常为350nm到360nm，该量子点可在这段波长的激发下，发出较高的荧光强度，可直接利用便携紫外灯直接检测，方便快捷。

(3)环境条件改变(ph)对cqds荧光强度影响的荧光光谱图分析

取ph分别为1-14的水溶液，将cqds溶液与ph各不相同的溶液分别以体积比为1:1混合，摇匀后测其荧光强度。结果如图3a所示。

由图3a可见，在弱酸，中性，碱性条件下，ph值的改变均不影响cqds的发光能力，只有在极强的酸性条件下，cqds不发出荧光，说明cqds适应能力强，ph的改变几乎不影响cqds的荧光强度。普遍溶液ph值都在中性或弱酸弱碱的范围,该cqds具有做为荧光探针的潜质，能广泛应用于大多数溶液中，不受环境条件限制。

(4)环境条件改变(温度)对cqds荧光强度影响的荧光光谱图分析

将cqds溶液与ph为7的水溶液以体积比为1:1混合，分别取等体积混合液倒入试管中，分别以10℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃，100℃各自加热10min，冷却后分别测其荧光强度，结果如图3b。

由图3b可见，改变cqds溶液温度的，cqds的荧光强度略微不同。普遍制备的cqds溶液都保存在阴暗4℃条件下，当cqds溶液逐渐加热升温，冷却后测其荧光强度，在正常室温条件下，30℃时，cqds荧光强度最强，表面能量达到最大，有利于cqds的荧光发射；继续升温至100℃，cqds荧光强度略有下降，但仅下降了原来的1/4，说明该cqds耐高温，适用于需要加热的应用条件。

(5)cu浓度对cqds荧光强度影响的荧光光谱图

按体积比1:1，分别取浓度为0-2000μm的cuso4溶液和步骤1制备的碳量子点cqds溶液，混合均匀，得到不同cu²⁺浓度的基于碳量子点-铜离子的荧光探针cqds/cu²⁺溶液。放置避光阴暗处待用。结果如图4。

由图4可见，加入cu²⁺的浓度从0μm～300μm递增时，荧光强度开始逐渐下降；当加入的cu²⁺浓度为300μm时，即3×10^-4m浓度的cu²⁺时，荧光强度下降至原来的1/2，当加入的cu²⁺浓度再逐渐增加到1000μm时，荧光强度猝灭率减慢，但荧光强度下降至原来的2/3，即猝灭效率明显；当cu²⁺浓度达到2000μm时，cqds荧光强度几乎完全猝灭，不发出荧光。结果表明，随着cu²⁺浓度的升高，荧光强度不断下降，猝灭效率增强。

实施例2基于碳量子点-铜离子荧光探针在非酶检测葡萄糖中的应用

(一)制备葡萄糖(c6h12o6)溶液

秤取3.567g葡萄糖，溶于盛有400ml超纯水的烧杯中，放在磁力搅拌器上均匀搅拌10.00min，溶解后用玻璃棒引流倒入500ml容量瓶中，加超纯水定容，得浓度为36mm葡萄糖储备液，放置避光阴暗处待用。

(二)在不同ph条件下，相同浓度葡萄糖溶液对cqds/cu²⁺体系荧光强度影响

分别取实施例1制备的cu²⁺浓度为1000μm的基于碳量子点-铜离子的荧光探针cqds/cu²⁺溶液2ml于试管中。向cqds/cu²⁺溶液中加入浓度为1000μm的葡萄糖溶液2ml，用浓度为1g/l的氢氧化钠溶液分别调节ph为5，6，7，8，9，10，11，12，将试管放入80℃的水浴锅中加热10min，冷却后在355nm波长下观察不同ph对葡萄糖恢复cqds/cu²⁺荧光强度的影响。结果如图5所示。

由图5可见，由于cqds表面携带大量的羟基、羧基和氨基，cu²⁺与cqds表面的氨基基团发生配位，但不影响cqds表面的羟基和羧基基团，故ph的改变，会一定程度的增加溶液中的羟基或羧基，从而影响cqds/cu²⁺的荧光强度。此外，葡萄糖溶液与cqds/cu²⁺溶液发生反应需要在碱性条件下进行，故溶液ph对葡萄糖恢复cqds/cu²⁺荧光强度有一定的影响。从图5中可以看出，在355nm波长激发下，不同溶液ph对葡萄糖恢复cqds/cu²⁺荧光强度的恢复率不同。在酸性条件下，混合溶液不发生反应；随着ph升高，葡萄糖恢复cqds/cu²⁺荧光强度的恢复率逐渐增大，在ph＝6，7，8处计算出的恢复率分别为41.00％，75.59％和14.30％。同时可以观察到随着ph的进一步增加，恢复率表现出明显的下降趋势，这是由于cuso4溶液与naoh溶液生成大量的cu(oh)2，进而与葡萄糖溶液反应生成大量的红棕色沉淀cu2o2。由于cqds粒子尺寸小，重量小，而cu2o2离子尺寸较大，重量大，cu²⁺脱离cqds表面形成沉淀并吸附了大量cqds，导致溶液中cqds大幅度减少，故溶液不发出荧光。这说明在ph＝7时，有利于葡萄糖溶液恢复cqds/cu²⁺荧光强度，可以用该ph值来评价葡糖溶液对cqds/cu²⁺荧光强度的恢复过程，并测定其恢复率。(三)优化检测条件下，不同浓度葡萄糖溶液对cqds/cu²⁺体系荧光强度影响

向2ml实施例1制备的cu²⁺浓度为1000μm的基于碳量子点-铜离子的荧光探针cqds/cu²⁺溶液中分别加入浓度为0-2μm的葡萄糖溶液2ml，调节ph为7，将试管放入在80℃的水浴锅中加热10min，冷却后在355nm波长下观察不同葡萄糖浓度对cqds/cu²⁺荧光强度的影响，结果如图6a和图6b。

改变葡萄糖浓度，测试葡萄糖浓度对cqds/cu²⁺荧光强度的影响。由图6a可见，葡萄糖浓度的逐渐增大，cqds/cu²⁺荧光强度恢复率表现出明显的上升的趋势，原因是弱碱性下，cqds/cu²⁺催化氧化葡萄糖发生反应，葡萄糖被氧化为葡萄糖酸，cqds表面的cu²⁺被还原生成红棕色cu2o2，从而cu²⁺从cqds表面上得到释放，表能能量转移，溶液中cqds大幅度增加，溶液恢复强荧光。同时可以观察到，当葡萄糖浓度达到2μm时，cqds/cu²⁺荧光强度不在继续升高，表明c6h12o6与cqds/cu²⁺反应达到平衡。因此优选葡萄糖浓度为2μm。

从图6b可以得到，cqds/cu²⁺的荧光恢复率随c6h12o6浓度的升高而升高，故可以得到线性方程y＝21.621c+49.402(r²＝0.9772)，y代表cqds/cu²⁺荧光强度恢复率，c为葡萄糖浓度。同时在信噪比为3时，得到最低检测限lod＝0.0555μm，这说明cqds/cu²⁺复合荧光探针具有更低的葡萄糖检测范围并且可多次重复使用。

(四)优化检测条件下，干扰物溶液对cqds/cu²⁺体系荧光强度的影响

分别取实施例1制备的cu²⁺浓度为1000μm的基于碳量子点-铜离子的荧光探针cqds/cu²⁺溶液2ml于试管中，向cqds/cu²⁺溶液中分别加入2ml浓度为2μm的葡萄糖溶液(glucose)、nacl溶液、kcl溶液、硫酸根溶液(so4^2-)、抗坏血酸溶液(ascorbicacid)、尿素溶液(uricacid)和多巴胺溶液(dopamine)，混合均匀，调节混合溶液ph均为7，将试管放入80℃的水浴锅中加热15min，冷却后在355nm波长下观察cqds/cu²⁺在其它生物分子存在条件下对荧光强度的影响，结果如图7。

为了评价cqds/cu²⁺荧光探针的灵敏性和稳定性，研究干扰物对荧光探针的影响是非常必要的。通常血液中与葡萄糖共存的生物分子有nacl，kcl，硫酸根，抗坏血酸，尿素，多巴胺，从图7可见，当分别加入干扰物到cqds/cu²⁺溶液中时，cqds/cu²⁺荧光强度并无任何恢复现象，只有加入葡萄糖溶液时，cqds/cu²⁺荧光强度才得到恢复，因此，该荧光探针cqds/cu²⁺对葡萄糖具有特异型，不受其他共存生物分子干扰，具备作为检测葡萄糖的荧光探针的优异性能。

为了更好地了解荧光探针检测过程并且提高非酶环境下葡萄糖检测效率，研究相关机理是有必要的，结果如图8所示。宽带隙半导体可以吸收短波长的紫外光，窄带半导体可以吸收长波长的紫外光。为了更好更经济地检测葡萄糖，本发明中碳量子点(cqds)和铜离子(cu²⁺)组合成复合纳米材料荧光探针。本发明以柠檬酸作为制备碳量子点的碳源，尿素作为氮源，合成的cqds具有强荧光性，同时由于cqds含有大量氨基基团，对cu²⁺具有亲和性，cqds遇到cu²⁺后表面能量转移，cqds作为能量供体，cu²⁺作为能量受体，cqds荧光强度大幅度下降，并且构成了碳量子点-铜离子荧光探针体系(cqds/cu²⁺)。一方面，复合纳米材料cqds/cu²⁺具有稳定的荧光性能可以直接检测葡萄糖，另一方面，还具有一定的催化能力，加速铜离子与葡萄糖反应。经过一系列的催化氧化反应，在弱碱性条件下，葡萄糖被cqds/cu²⁺氧化为葡萄糖酸，铜离子被还原生成红色沉淀氧化亚铜，从而碳量子点表面上的铜离子得到释放，最终cqds的强荧光得到恢复。同时，反应生成的副产物无毒无害易处理，对cqds荧光强度不产生任何干扰。在本发明中，荧光性能好，化学性质稳定的cqds/cu²⁺作为荧光探针，加速葡萄糖氧化，可以经济有效的检测葡萄糖。结果表明，复合纳米材料cqds/cu²⁺大大提高了非酶条件下检测葡萄糖的效率，具有更低的检测限度，对葡萄糖的检测具有特异型。简言之，基于碳量子点-铜离子的复合纳米材料是性能优异的非酶检测葡萄糖荧光探针。