本发明属于分析化学技术领域，尤其涉及一种复合纳米探针及其制备方法以及应用。
背景技术：
氨基酸作为生物大分子的基本单位以及蛋白质和生命过程的基本组成部分已经得到了深入研究，在分子水平上选择性识别和分析氨基酸特别是对疾病的医学诊断非常重要，在所有的氨基酸中，精氨酸在细胞分裂、伤口愈合、免疫功能、血管扩张和荷尔蒙的释放等许多生物学功能中起着关键作用，精氨酸是一氧化氮、尿素鸟氨酸和胍丁胺的直接生理前体，如果精氨酸衍生物水平不正常，这会引起一些疾病甚至威胁生命，例如，过量的精氨酸会增加胃酸水平，引起过敏反应，但是如果缺乏精氨酸，可能导致血氨失衡甚至昏迷，因此，精氨酸可以作为检查某些疾病的指标，由于以上的因素发展临床精氨酸检测的可行方法对疾病诊断有重要的意义。
目前检测精氨酸的主要方法有高效液相色谱法和气体色谱法，然而，这些方法通常涉及专业和昂贵的设备，复杂的样品预处理和很长的测定时间，因此，许多研究人员尝试设计化学传感器进行检测精氨酸，但目前精氨酸的传感器仍然非常少见。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种基于荧光共振有机分子修饰的比率荧光检测精氨酸复合纳米探针及其制备方法以及应用。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种复合纳米探针，复合纳米探针由带负电荷的碳纳米颗粒和带正电的探针1通过静电引力相结合制备而成。
一种复合纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）探针1的制备：首先于室温下将8-羟基-2-甲基喹啉与丙烯酰氯反应得到化合物4，再将化合物4于101℃下与seo2发生氧化反应生成化合物3，在制备化合物4的同时将1,1,2-三甲基苯并[e]吲哚和ch3i反应得到化合物2，最后将化合物3和化合物2进行knoevenagel缩合反应得到探针1；
（2）合成碳纳米颗粒：首先将柠檬酸溶于水中，向其中加入100-1000µl乙二胺，搅拌使其混合均匀，将溶液转移至水热釜中，于200℃烘箱中反应4小时，冷却至室温，得到棕色溶液，将此溶液用截留分子量为3000的透析膜透析48小时，再用无水乙醇沉淀两次，离心，所得棕色固体在真空干燥箱中干燥18小时得到碳纳米颗粒；
（3）制备复合纳米探针：将碳纳米颗粒和探针1置于容量瓶中，使用体积比10:1-500:1的超纯水与二甲基亚砜定容，超声溶解10-60分钟，再以10000转/分钟离心3-15分钟，过滤即得。
进一步的，所述步骤（1）中探针1的化学合成路线为
进一步的，所述步骤（1）中化合物4的制备方法如下：将8-羟基-2-甲基喹啉加入三口瓶中，加入15-30ml干燥的二氯甲烷溶剂，再加入1.4-2ml三乙胺，置于冰水浴搅拌30-60分钟，向反应液中缓慢滴加入4-10ml丙烯酰氯，随后移去冰水浴，在室温下搅拌反应12-36小时，待反应完成后，过滤，将所得滤液进行减压蒸馏得到粗产物，将所得粗产物用柱层析分离，其中展开剂为乙酸乙酯/石油醚的体积比1:4-1:10，得淡黄色油状物液体化合物4，其产率为47.3-57.8%。
进一步的，所述步骤（1）中化合物3的制备方法如下：将化合物4加入三口瓶中，再加入13-20ml的1,4-二氧六环，缓慢升温至65℃，将二氧化硒加入反应液中，继续升温到101℃，回流反应4-12小时，待反应完成后，趁热过滤反应液，滤液加入硅胶减压蒸馏得粗产物，将所得粗产物通过柱层析分离法提纯，其中，硅胶粒度为200-300目，展开剂为乙酸乙酯和石油醚，两者的体积比为1:8-1:35，旋蒸，得白色絮状固体化合物3，其产率为71.6-80.7%。
进一步的，所述步骤（1）中化合物2的制备方法如下：将1,1,2-三甲基苯并[e]吲哚和碘甲烷溶解在15-20ml乙腈中，将混合物加热到45℃，反应13-24小时，将混合物冷却至室温再将40-70ml乙醚倒入反应液中，过滤得到化合物2，其收率为52.6-68.2%。
进一步的，所述步骤（1）中探针1的制备方法如下：将化合物2和化合物3在乙醇中溶解，加热至78°c，回流反应12-52小时后，将反应混合物冷却至室温，过滤得到棕色固体探针1，其收率为45.1-66.5%。
一种复合纳米探针的应用，所述复合纳米探针在溶液中可用于近红外荧光比率定量检测精氨酸，在ph为5~11的范围内，其检测精氨酸的浓度范围从60~270μmol。
本发明具有的优点是：本发明基于荧光共振能量转移（fret）在带负电荷的碳纳米颗粒和带正电的探针1通过静电引力相结合，近红外荧光比率检测精氨酸（arg），具有高灵敏度（检出限为64.7纳摩尔）和良好的选择性和抗干扰能力；探针可以定量检测精氨酸的浓度范围从60到270微摩尔，复合纳米探针比率发射光谱与精氨酸浓度的线性函数绘制的精氨酸的滴定曲线中，440纳米处的发射峰与607纳米处的发射峰的比值在精氨酸60至270μm范围内可以保持良好的线性关系；在很宽的ph范围内（ph从5到11），复合荧光探针可以检测精氨酸的变化，这样的范围已经涵盖了生物体内的ph范围，生物体内多种有机生物分子thr,val,ser,phe,his,gly,pro,iie,trp,ala,tyr,glu,glc,leu,和h2o2不会对检测造成干扰且具有良好的选择性；复合探针cds-1的溶液中逐渐加入精氨酸的吸收光谱可以看到随着精氨酸的加入溶液吸收峰位置发生了超过150纳米的移动，溶液颜色由黄色变为无色。
附图说明
图1复合纳米探针（包含0.67微克/毫升的碳点和3×10−5摩尔化合物1）水-二甲基亚砜溶液（水与二甲基亚砜的体积比为100:1）的发射光谱对精氨酸水溶液滴定（与化合物1的当量比为0–10），激发波长为360nm，反应时间为12分钟）；
图2为复合探针（包含0.67微克/毫升的碳点和3×10−5摩尔化合物1）在水−二甲基亚砜溶液（体积比100:1）检测不同浓度的精氨酸（从左到右浓度分别为0,3×10−5摩尔/升，6×10−5摩尔/升，9×10−5摩尔/升，12×10−5摩尔/升，15×10−5摩尔/升，18×10−5摩尔/升，21×10−5摩尔/升，24×10−5摩尔/升，27×10−5摩尔/升）的照片，激发波长为365nm；
图3由复合纳米探针比率发射光谱与精氨酸浓度的线性函数绘制的精氨酸的滴定曲线；
图4在水−二甲基亚砜溶液（体积比100:1）添加精氨酸之前和之后与不同ph值的复合纳米探针荧光变化（0.67微克/毫升的碳点和3×10−5摩尔/升化合物1）；
图5复合纳米探针对精氨酸的选择性和抗干扰性实验，有机生物分子分别为thr,val,ser,phe,his,gly,pro,iie,trp,ala,tyr,glu,glc,leu,andh2o2；
图6复合纳米探针识别精氨酸后分别加入不同有机生物分子溶液的照片，有机生物分子分别为thr,val,ser,phe,his,gly,pro,iie,trp,ala,tyr,glu,glc,leu,andh2o2；
图7加入不同浓度的精氨酸，复合纳米探针水−二甲基亚砜溶液（体积比100:1）440纳米处与607纳米处的荧光强度比值随时间变化情况，激发波长360纳米；
图8加入精氨酸(浓度3.0×10−4摩尔/升)之前和之后化合物1的水-二甲基亚砜溶液（浓度3.0×10−5摩尔/升，水与二甲基亚砜的体积比为100:1）的发射光谱，激发波长为360纳米，反应时间为12分钟；
图9化合物1的水-二甲基亚砜溶液（浓度3.0×10−5摩尔/升，水与二甲基亚砜的体积比为100:1）在加入精氨酸前和加入3.0×10−4摩尔/升的精氨酸后（灰色）的吸收光谱（黑线），在360纳米光激发下和0.67微克/毫升的碳点的水溶液的荧光激发光谱（最右边的灰色线）；
图10碳点、化合物1和复合探针cds-1的红外谱图；
图11碳点和复合探针cds-1的zeta电位；
图12360纳米光激发下，碳点（0.67微克/毫升）水溶液中加入精氨酸(3.0×10−4摩尔/升)前后的发射光谱，反应时间是12分钟；
图13复合探针cds-1（包含0.67微克/毫升的碳点和3×10−5摩尔化合物1）的水-二甲基亚砜溶液（水与二甲基亚砜的体积比为100:1）中逐渐加入精氨酸（与化合物1的当量比为0–10）的吸收光谱，反应时间是12分钟；
图14自然光下，复合探针cds-1（包含0.67微克/毫升的碳点和3×10−5摩尔化合物1）溶液中加入不同浓度的精氨酸(从左到右0,3×10−5摩尔/升,6×10−5摩尔/升,9×10−5摩尔/升,12×10−5摩尔/升,15×10−5摩尔/升,18×10−5摩尔/升,21×10−5摩尔/升,24×10−5摩尔/升,27×10−5摩尔/升)的照片。
具体实施方式
实施例1
复合探针中的化合物1采用如下合成路线：
将8-羟基-2-甲基喹啉（2.41g，15mmol）加入100ml三口瓶中，加入干燥的20ml二氯甲烷溶剂，再加入1.5ml三乙胺，置于冰水浴搅拌30分钟，向反应液中缓慢滴加入4ml丙烯酰氯，随后移去冰水浴，在室温下搅拌反应12小时。待反应完成后，过滤，将所得滤液进行减压蒸馏得到粗产物。将所得粗产物用柱层析分离（展开剂为乙酸乙酯:石油醚体积比1:4），得淡黄色油状物液体，即为化合物4（产率47.3%）。
表征：1hnmrδh(dmso,400mhz)：8.32(d,1h),7.85(m,1h),7.57(m,2h),7.47(d,1h),6.61(t,2h),6.20(m,1h),2.61(s,3h).13cnmr:δc(100mhz,dmso):164.71,159.47,146.77,140.38,136.70,133.90,128.25,127.91,126.32,125.85,123.31,121.95,25.73.
将化合物4（0.928g，4.4mmol）加入100ml的三口瓶中，再加入15ml的1,4-二氧六环，缓慢升温至65℃。将二氧化硒（0.648g，5.8mmol）加入反应液中，继续升温到101℃，回流反应4小时。待反应完成后，趁热过滤反应液，滤液加入硅胶减压蒸馏得粗产物。将所得粗产物通过柱层析分离法提纯（硅胶为200-300目，展开剂为乙酸乙酯和石油醚的体积比为1:20，旋蒸，得白色絮状固体，即为化合物3（产率71.6%）。
表征：1hnmrδh(dmso,400mhz)：10.00(s,1h),8.70(d,2h),8.06(m,2h),7.84(t,1h),7.78(m,1h),6.66(t,2h),6.27(m,1h).13cnmr:δc(100mhz,dmso):193.74,164.68,152.44,147.78,140.64,138.82,134.57,131.27,129.85,127.88,126.84,123.41,118.31.
将1,1,2-三甲基苯并[e]吲哚（1.045克，5毫摩尔）和碘甲烷（1毫升）溶解在15毫升乙腈中，将混合物加热到45°c。经过13小时的反应，将混合物冷却至室温再将50毫升乙醚倒入反应液中。过滤得到产物2（0.9234克，收率：52.6%）。
表征：1hnmrδh(dmso,400mhz):8.38(d,1h),8.31(d,1h),8.22(d,1h),8.12(d,1h),7.78(t,1h),7.76(t,1h),4.10(s,3h),2.88(s,3h),1.76(s,6h).13cnmr:δc(dmso,100mhz):196.37,133.49,130.98,130.21,128.84,127.59,127.58,123.88,113.62,55.72,35.59,21.75,and14.48.
将化合物2（0.3513g，1毫摩尔）和3（0.2771克，1毫摩尔）在10毫升乙醇中溶解，加热至78°c，回流反应12小时后，将反应混合物冷却至室温。最终产品探针1为棕色固体经过滤后获得（0.2528g，45.1%）。
表征：hrms(ei)m/z:calcdforc29h25n2o2[m-i],433.1911;found,433.1839.1hnmrδh(dmso,400mhz):8.75(d,1h),8.66(d,1h),8.35(t,3h),8.28(d,1h),8.22(d,1h),8.14(d,1h),8.05,(m,1h),7.86(t,1h),7.79(m,3h),6.78(d,2h),6.36(t,1h)4.25(s,3h),and2.05(s,6h).13cnmr:δc(dmso,100mhz):182.49,164.86,152.03,148.53,147.75,139.95,138.48,134.68,133.98,131.61,130.53,130.20,129.09,128.69,128.12,127.11,126.63,125.29,123.98,123.06,117.15,114.02,54.71,36.01,25.08.
实施例2
将8-羟基-2-甲基喹啉（2.006g，12.5mmol）加入100ml三口瓶中，加入干燥的30ml二氯甲烷溶剂，再加入2.0ml三乙胺，置于冰水浴搅拌45分钟，向反应液中缓慢滴加入10ml丙烯酰氯，随后移去冰水浴，在室温下搅拌反应36小时。待反应完成后，过滤，将所得滤液进行减压蒸馏得到粗产物。将所得粗产物用柱层析分离（展开剂为乙酸乙酯:石油醚体积比1:10），得淡黄色油状物液体，即为化合物4（产率57.8%）。将化合物4（0.742g，3.5mmol）加入100ml的三口瓶中，再加入13ml的1,4-二氧六环，缓慢升温至65℃。将二氧化硒（0.518g，4.6mmol）加入反应液中，继续升温到101℃，回流反应12小时。待反应完成后，趁热过滤反应液，滤液加入硅胶减压蒸馏得粗产物。将所得粗产物通过柱层析分离法提纯（硅胶为200-300目，展开剂为乙酸乙酯和石油醚的体积比为1:8，旋蒸，得白色絮状固体，即为化合物3（产率77.2%）。将1,1,2-三甲基苯并[e]吲哚（1.254克，6毫摩尔）和碘甲烷（1毫升）溶解在20毫升乙腈中，将混合物加热到45°c。经过24小时的反应，将混合物冷却至室温再将70毫升乙醚倒入反应液中。过滤得到产物2（1.174克，收率：55.7%）。将化合物2（0.3513g，1毫摩尔）和3（0.2771克，1毫摩尔）在15毫升乙醇中溶解，加热至78°c，回流反应36小时后，将反应混合物冷却至室温。最终产品探针1为棕色固体经过滤后获得（0.3212g，57.3%）。
实施例3
将8-羟基-2-甲基喹啉（1.605g，10mmol）加入100ml三口瓶中，加入干燥的15ml二氯甲烷溶剂，再加入1.4ml三乙胺，置于冰水浴搅拌60分钟，向反应液中缓慢滴加入5ml丙烯酰氯，随后移去冰水浴，在室温下搅拌反应34小时。待反应完成后，过滤，将所得滤液进行减压蒸馏得到粗产物。将所得粗产物用柱层析分离（展开剂为乙酸乙酯:石油醚体积比1:7），得淡黄色油状物液体，即为化合物4（产率55.0%）。将化合物4（1.265g，6.0mmol）加入100ml的三口瓶中，再加入20ml的1,4-二氧六环，缓慢升温至65℃。将二氧化硒（0.905g，8.1mmol）加入反应液中，继续升温到101℃，回流反应10小时。待反应完成后，趁热过滤反应液，滤液加入硅胶减压蒸馏得粗产物。将所得粗产物通过柱层析分离法提纯（硅胶为200-300目，展开剂为乙酸乙酯和石油醚的体积比为1:35，旋蒸，得白色絮状固体，即为化合物3（产率80.7%）。将1,1,2-三甲基苯并[e]吲哚（0.627克，3毫摩尔）和碘甲烷（0.5毫升）溶解在20毫升乙腈中，将混合物加热到45°c。经过24小时的反应，将混合物冷却至室温再将40毫升乙醚倒入反应液中。过滤得到产物2（0.599克，收率：68.2%）。将化合物2（0.3513g，1毫摩尔）和3（0.2771克，1毫摩尔）在15毫升乙醇中溶解，加热至78°c，回流反应52小时后，将反应混合物冷却至室温。最终产品探针1为棕色固体经过滤后获得（0.3728g，66.5%）。
由有机分子制备线粒体定位比率荧光检测精氨酸复合纳米探针，包括以下步骤：
1）合成碳纳米颗粒
首先称取1g柠檬酸溶于10ml水中，向其中加入100-1000µl乙二胺，搅拌使其混合均匀，将溶液转移至水热釜中，于烘箱中200℃反应4小时，冷却至室温，得到棕色溶液，将此溶液用截留分子量为3000的透析膜透析48小时。再用无水乙醇沉淀两次，离心，所得棕色固体在真空干燥箱中干燥18小时得到碳纳米颗粒。
2）制备复合纳米探针
称取10mg碳纳米颗粒和5mg探针分子1于10ml的容量瓶中，使用超纯水与二甲基亚砜（体积比10：1-500:1）定容，超声溶解10-60分钟，离心机10000转离心3-15分钟，过滤。
该纳米复合材料可以用于近红外荧光比率检测精氨酸（arg），具有高灵敏度（检出限为64.7纳摩尔）和良好的选择性和抗干扰能力，探针可以定量检测精氨酸的浓度范围从60到270微摩尔，精氨酸的浓度不同溶液发光颜色由红色变为蓝色（如图2）；复合纳米探针比率发射光谱与精氨酸浓度的线性函数绘制的精氨酸的滴定曲线中，440纳米处的发射峰与607纳米处的发射峰的比值在精氨酸60至270μm范围内可以保持良好的线性关系，表明精氨酸在此范围内可以由比率荧光强度定量地得到（如图3）；在很宽的ph范围内（ph从5到11），复合荧光探针可以检测精氨酸的变化，这样的范围已经涵盖了生物体内的ph范围（如图4），生物体内多种有机生物分子thr,val,ser,phe,his,gly,pro,iie,trp,ala,tyr,glu,glc,leu,和h2o2不会对检测造成干扰且具有良好的选择性（如图5）；复合探针cds-1的溶液中逐渐加入精氨酸的吸收光谱可以看到随着精氨酸的加入溶液吸收峰位置发生了超过150纳米的移动（如图13），图7是加入不同浓度的精氨酸，复合纳米探针溶液440纳米处与607纳米处的荧光强度比值随时间变化情况，随着时间荧光强度比值最终接近饱和，饱和时间在30分钟左右；图8是加入精氨酸之前和之后化合物1的水-二甲基亚砜溶液的发射光谱，12分钟内溶液的发光颜色发生了接近170纳米的移动；图9中化合物1的水-二甲基亚砜溶液在加入精氨酸前和加入3.0×10−4摩尔/升的精氨酸后（灰色）的吸收光谱（黑线）与碳点的水溶液的荧光激发光谱（最右边的灰色线）相匹配，碳点发出的光由最初被化合物吸收到不能吸收；由图10碳点、化合物1和复合探针cds-1的红外谱图可以看出复合探针负载了有机化合物；由图11碳点和复合探针cds-1的zeta电位计算得出复合探针的负电性由-1.35mv到0.57mv。图12是360纳米光激发下，碳点（0.67微克/毫升）水溶液中加入精氨酸（3.0×10−4摩尔/升）前后的发射光谱，加入精氨酸前后，碳点溶液的发射光谱变化不大；图14是自然光下，复合探针cds-1溶液中加入不同浓度的精氨酸的照片，随着精氨酸浓度的增加溶液颜色由黄色变为无色溶液。
综上所述，一种复合纳米探针，基于荧光共振能量转移（fret）在带负电荷的碳纳米颗粒和带正电的探针1通过静电引力相结合，近红外荧光比率检测精氨酸（arg），具有高灵敏度（检出限为64.7纳摩尔）和良好的选择性和抗干扰能力。探针可以定量检测精氨酸的浓度范围从60到270微摩尔。