专利名称：一种高效疏水介质的制备方法及其在纯化蛇毒降纤酶中的应用的制作方法
一种高效疏水介质的制备方法及其在纯化蛇毒降纤酶中的应用技术领域
本发明属于生化领域，具体涉及一种高效疏水介质的制备方法及其在纯化蛇毒降纤酶中的应用。技术背景
传统疏水介质的基质通常为琼脂糖、纤维素等软基质，这些基质具有生物相容性好、化学稳定性好、通透性好、非特异性吸附少等优点。但较差的机械性使它们无法运用于现代闻效制备液相系统。近年发展起来的娃I父基质属于硬基质，以其为基础合成的疏水介质配合现代高效制备液相色谱仪使用，使疏水层析柱效获得了空前的提升，纯化效能大幅的提高。但由于硅胶自身较差的化学稳定性使其只能在低于PH8的条件下使用，当溶液pH值大于8时，硅胶容易发生溶解。当pH值大于10.7时，硅胶则完全溶解。此外硅胶表面未封闭的硅醇基容易产生非特异性吸附，这些都限制了硅胶成为一个合适的高效疏水层析基质。目前以硅胶为基质的疏水介质主要运用于化学合成小分子多肽的纯化。一个优秀的基质它必须具备以下性能: 1、不溶性:基质在操作条件下不溶解于流动相。
2、通透性:具有优良的水力学性能，流动相可以在适当的流速下通过。
3、机械稳定性好:有合适的颗粒形状，不会发生压力形变，并有较长的使用寿命O
4、无非特异吸附性:基质本身在层析操作条件下不会吸附蛋白质。
5、化学稳定性好:在吸附、洗脱、再生的操作的条件下，分离介质的大分子链具有稳定的结构。
聚甲基丙烯酸环氧丙酯(PGMA)微球是一种富含环氧基的功能高分子材料，既具备特定的物理结构。又有良好的化学反应性能，所以聚甲基丙烯酸环氧丙酯(PGMA)微球的应用与研究已越来越受到人们的关注。中国科学院化学研究所的赵莹歆等以聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球(PGMA)为基质，利用还原氨化方法将肝素键合在其表面上，得到一种以肝素为配基的高效亲和色 谱填料，填料耐压可达20MPa以上。该填料对抗凝血酶III的亲和容量为1.2 mg/g,对抗凝血酶III和人血清白蛋白的回收率分别为96.9%和94.4%。余晓等人以聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球(PGMA)为基质，以胰蛋白酶抑制剂为配基合成了高效亲和色谱填料，该填料于20MPa下装填于制备色谱柱中，用于人血清白蛋白的纯化收率大于99%。杨春霞等聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球为基质，合成一种新型弱酸性阳离子色谱填料。选用甲烷磺酸作淋洗液，在流速为1.0mL/min时，对6种无机阳离子(Li+)、(Na+)、(ΝΗ；)、(K+) > (Mg2+)、(Ca2+)和有机胺进行了良好分离，此色谱柱的分离效果与Dionex1nPac CS12A商品柱接近，但分析时间缩短了 44min。因此聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球(PGMA)作为高效色谱填料基质应用前景广阔，效果良好。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效疏水介质的制备方法，该方法制得的产品纯度高、收率高、操作简便。本发明的另一目的在于提供该高效疏水介质在纯化蛇毒降纤酶中的应用，使其能够快速、高效的纯化高纯度蛇毒降纤酶。本发明的目的是这样来实现的，其制备方法的步骤为:
O 制备聚甲基丙烯酸环氧丙酯(PGMA)微球
制备聚甲基丙烯酸环氧丙酯(PGMA)微球采用的是分散聚合方法，其单体为甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)，引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)或过氧化苯甲酰(ΒΡ0)，稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，反应介质为一元醇或这类醇与甲苯等其它溶剂组成的混合物。各原料组分为:甲基丙烯酸环氧丙酯50-100 g、偶氮二异丁腈或过氧化苯甲酰1-2 g、聚乙烯吡咯烷酮 5-20 g、乙醇 600-800 ml、甲苯 70-200 ml。制备过程如下:将称量好的原料加入到适当的玻璃反应瓶中，使其充分溶解并通氮气除氧。然后置反应瓶于带有旋转和加热装置的设备上，于65-75摄氏度下聚合24-36h。反应结束后，用沉降方法除去溶剂，并用乙醇充分洗涤，即可得到颗粒分布基本呈现单分散的PGMA微球。2) 以聚甲基丙烯酸环氧丙酯(PGMA)微球为基质制备高效疏水介质
聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球富含环氧基基团，因此具有良好的化学反应性能，在催化齐U(三氟化硼乙醚)作用下可以迅速的与醇、酚反应。得到高效疏水介质。根据配基的种类不同催化剂的加入量为0.01-0.03ml/g.PGMA,反应时间为30_50min，反应温度控制在45-50°C。以下是反应通式:
权利要求
1.一种高效疏水介质的制备方法，其特征在于方法步骤为: 1)利用分散聚合法制备聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球: 各原料组分为:甲基丙烯酸环氧丙酯50-100 g、偶氮二异丁腈或过氧化苯甲酰1-2 g、聚乙烯吡咯烷酮5-20 g、乙醇600-800 ml、甲苯70-200 ml ； 制备过程如下:将称量好的原料加入到适当的玻璃反应瓶中，使其充分溶解并通氮气除氧，然后置反应瓶于带有旋转和加热装置的设备上，于65-75摄氏度下聚合24-36h，反应结束后，用沉降方法除去溶剂，并用乙醇充分洗涤，即可得到颗粒分布基本呈现单分散的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球； 2)以聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球为基质，通过化学反应接入疏水配基制备高效疏水介质: 在催化剂三氟化硼乙醚的作用下，聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球与醇、酚反应，得到高效疏水介质，催化剂的加入量为0.01-0.03ml/g.PGMA,反应时间为30_50min，反应温度控制在 45-50 °C。
2.根据权利要求1所述的一种高效疏水介质的制备方法，其特征是:步骤I)中所述聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球的粒径为8-10微米。
3.—种权利要求1所述高效疏水介质在纯化蛇毒降纤酶中的应用，其特征是:将权利要求I合成所得高效疏水介质以20MPa压力装填于不锈钢色谱柱中，然后将柱子连接于制备液相色谱系统，色谱柱平衡液为:20-50mmol/L磷酸盐、PH值为7-8.5、内含l-2mol/L硫酸铵；洗脱液为20-50mmol/L磷酸盐缓冲液、PH值为7-8.5 ;首先以平衡液将色谱柱平衡至基线平直，然后将降纤酶样品加入柱中，接着以平衡液洗涤至基线平直；最后以平衡液为A相、洗脱液为B相进行梯度洗脱，得到高纯度降纤酶，活性回收大于90%。
全文摘要
一种高效疏水介质的制备方法及其在纯化蛇毒降纤酶中的应用。其制备方法包括如下步骤1)利用分散聚合法制备聚甲基丙烯酸环氧丙酯(PGMA)微球；2)以聚甲基丙烯酸环氧丙酯(PGMA)微球为基质制备高效疏水介质；高效疏水介质以20MPa压力装填于不锈钢色谱柱中，然后将柱子连接液相色谱系统，用来纯化蛇毒降纤酶。本发明的优点在于产品纯度高、收率高、操作简便、达到产业化要求，利于推广。
文档编号B01J20/26GK103145899SQ201310083428
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月16日 优先权日2013年3月16日
发明者胡小光, 刘庆华, 张素芳 申请人:南昌佰泰生物科技有限公司