稳定化的药物组合物及其制备方法

专利名称：稳定化的药物组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的是稳定化的药物组合物及其制备方法。
更具体地说，本发明涉及的是由大分子或大分子复合物组成的或者是含有大分子或大分子复合物的稳定的预防剂、治疗剂或诊断试剂。
生物大分子对社会和商业的重要性日益增加。
大多数治疗剂是在胞间或胞内的含水介质中或粘膜表面上起作用的。
某些治疗剂是在构成膜或类脂相的疏水介质中或疏水性氨基酸的环境中起作用的。
近年来，生物技术已经明显地影响到保健品工业。用于制备和提纯大分子材料的新方法能够以工业规模生产出具有以往不曾实现的特性的天然产品或基因工程产品(病毒、DNA、RNA、核酶、抗致敏剂等……)。
较早的含有较低分子量(阿司匹林、扑热息痛、儿茶酚胺、青霉素)的治疗组合物它们的特征在于在一定程度上能够方便地配制成片剂、乳浊液、悬浮液或溶液。
某些大分子，如核酸及其与蛋白质(和它们的辅因子)的复合物、碳水化合物复合物、类脂及其复合物作为疫苗或治疗剂或诊断试剂正在变得越来越重要。
在含水介质中，上述所有的大分子或大分子复合物均有降解的趋势，这种降解趋势限制了它们作为治疗剂、免疫剂或诊断试剂的应用。
对于许多制剂来说，降解并不是一个重要问题(例如按照制造商的说明，可以避免因使用过期疫苗而产生的问题)。然而，既使在最好的情况下，对治疗剂来说延长50％-100％数量级的贮存期(20℃)也是不易的(例如，脊髓灰质炎疫苗)。
对于其它制剂来说，以冻干粉的形式贮存是令人满意的，其降解仅仅在加入到含水介质中的那一刻才开始发生。
然而对于许多制剂来说，以干燥形式贮存的问题尚不能得到解决。而某些制剂其干燥形式是稳定的，但在含水介质中的降解速度却很快，以致于甚至在将其加入到含水介质中到使用这么短的时间内稳定性都成问题。
有几个因素可以引起降解发生制造方法，降解酶(蛋白水解酶、核酸酶、脂酶、糖解酶)，氧化剂或还原剂(如氧、有机或无机化学物质)，微生物污染。
对于生物大分子来说弱化学键是重要的。
由于生物大分子的特征是具有许多弱化学键，因此热变性是不可避免的，例如即使保持在低温(冷藏或冷冻)下也不能制止发生热变性。有时提高一点温度可以使生物制剂的活性发生明显变化。这些变化意味着分子组织的破坏，所说的破坏是由与特异性蛋白质或核酸变性无关联的协同作用决定的。
为了消除不稳定现象，可以利用佐剂，如MgCl2(用于脊髓灰质炎疫苗)，聚乙二醇等；然而这些佐剂的不便之处在于它们并非总是(取决于浓度)生理适宜的。
就室温而言，具有能够改变大分子或大分子复合物结构的有用能谱(参见Watson，James等人，Molecular Biology Ofthe Gene，P126-162，4Th Edition(1987) PublighersBenjamin Cummings，ISBN 0-8053-9612-8)。在最坏的情况下，这些改变会涉及到共价化学键的断裂或形成。较小的能量即足以形成或使二级化学键断裂(氢键，疏水性作用，范德华氏作用)，所说的二级化学键在生物加工及生物大分子的活性方面起着重要的作用。这类键的重要性在0-45℃，即在相应于高等生物体生命过程中的温度范围是最为显著的，下面将对此进行讨论。
上述所说的弱作用均是由物理结构的互补性所产生的。例如，激素与其结合位点是通过若干弱作用结合在一起的，结构的互补性增加了作用类型即范德华氏结合、疏水性结合或氢键结合作用的数目，因而避免了外界能量的破坏作用。
水本身在稳定含水介质中的大分子的作用方面扮演着重要的角色。
水分子之间的氢键形成一种结构，该结构可以通过X-射线衍射技术或中子技术得到证明。
在大分子周围的水分子形成一种有几个水分子高的外壳。这种外壳靠水分子之间和水分子与大分子之间的氢键得到加固，它象笼网一样起着保护内容物完整性的作用。
水的电子结构允许水网络上的元素和含水介质中的大分子上的有利位点之间的质子(氢原子核)进行自由交换。
在大分子中，水分子往往作为一种结构组分在蛋白质残基，核酸基质、碳水化合物或类脂的极性组分之间架起刚性桥。晶体学研究清楚地表明，在数个大分子晶体中包含有水分子。在结构物如细小核糖核酸病毒中这些分子桥的累积和协同作用对温度的升高是非常敏感的。
1932年，Urey发现了重水(即氧化氘，D2O或2H2O)。这一发现骤然引起了人们的兴趣，尤为关注的是其对生命化学可能产生的影响。在1932-1939年期间，有200多篇出版物阐明了重水对于活生物体的作用及其生理学或生物化学特性。在所有情况下，均用D2O取代(5％-100％)含水介质中的H2O，但得出的结果是不能把重水视认稳定剂。
在1970-1980年期间，重水成为生物物理研究领域，如NMR(核磁共振)或单色中子扩散中的重要工具。
对于NMR，氘核不具有核自旋的特性。在H2O介质中，在磁场内，由于水中的氢造成巨大的背景噪音，因此不能检测到激发态核所发射的无线电频率的信号。在D2O介质中，水不会对背景起作用，质子磁共振技术变得更为有力，特别是对于含有质子(1H)的，且溶于D2O的分子。H核和D核的性质是完全不同的。对于中子束而言，氘是相对透明的，而普通水是相对不透明的[Stuhrman H.(1974)J.Appl.Cryst.7，173 187]。各种技术允许不同的大分子所形成的结构有差异，中子结晶学已成为一种行之有效的工具。
如此说来，尽管已知重水增加了0.24千卡/摩尔的氢键强度，但并不可能预知重水对于溶解于水中的分子的稳定性的影响，因为此时其它现象，如笼网效应就很难理解。此时病毒内的水/DNA/蛋白质的协同作用仍然存在着，这是很难解释的。通过晶体学研究(中子或X-射线)可以提供最终的证明。
本发明的一个目的是提供生理相容的稳定的药物组合物。
本发明的另一目的是提供一定的稳定化药物组合物，在该组合物中，药物试剂的剂量比未稳定化的相同治疗组合物中的剂量要低。
本发明的另一方面是提供一种简单的用于制备一定的稳定化药物组合物，特别是治疗组合物、免疫组合物或诊断组合物的方法。
上述不同的方面是通过本发明的组合物来实现的。
本发明提供了稳定的药物组合物，该组合物包括选自核酸、类脂或碳水化合物中的一种或多种大分子和/或一种或多种大分子复合物，其特征在于该组合物含有一种或多种药物可接受的载体，这些载体中的至少一种含有重水(D2H)。
现已发现，用氘核取代作为分子或大分子复合物溶剂的水分子中的一部分氢核或全部氢核能够使药物组合物稳定化，其中所说的分子或大分子复合物是组成所说药物组合物的活性物质。
事实上，氢中含有0，0156％的氘。可以将水蒸馏或电解来进行提纯得到纯的重水，然后再电解重水获得纯的氘。
本发明涉及D2H或D2H与H2O的混合物作为稳定大分子的试剂的应用，所说的大分子选自核酸、类脂、碳水化合物或水相(溶液、悬浮液或乳浊液)中的大分子复合物。
在本发明中，氧化氘即重水的性质是特别令人感兴趣的。核子H或D在水分子之间和溶解、悬浮或乳化的生物大分子的许多位点之间进行自由的交换。D和H在活泼的氢位点之间，例如重力水中的全部氢，或生物大分子中的很多氢是可以自由地进行交换的。其它的氢有时隐藏在疏水性介质中，它们不可以交换的，但过一段时间之后，它们也是可以交换的。
关于H2O、D2H或这两者的混合物，溶液的物理性质证明它们具有呈线性变化的物理特性(如密度、或沸点，或能量/摩尔氢键)。
本发明所述的大分子或大分子复合物其分子质量至少为1500Da，优选大于5000Da。
为了清楚起见，大分子的稳定化是指在给定温度下，如约40℃下，相对于保持在H2O中大分子或大分子复合物而言，所观察到的保持在含D2H的溶液中的大分子或大分子复合物所提高的稳定性。
例如，对于脊髓灰质炎病毒(见结果)来说，根据活性病毒颗粒增加的数目，很明显，稳定性提高了103-104倍。
如上所述，本发明所述的大分子是核酸、碳水化合物或类脂。
对于大分子复合物来说，可以优选下述之中的复合物蛋白质-碳水化合物、蛋白质-类脂、核酸-碳水化合物、核酸-类脂、核酸-蛋白质，以及与碳水化合物和/或类脂可能的复合物，和病毒中的复合物。
可以进入本发明组合物的生物大分子或大分子复合物的实例为1)核酸活体内用的(如基因疗法)及体外用的(如诊断剂)DNA；用于活体内的RNA，核酶(改性的核酸或核酸/蛋白质复合物)；来源于用作治疗和免疫媒介的病毒基因组的DNA和RNA；天然的或合成的DNA和RNA复合物；所用的核酸可以是天然存在的核酸或人工合成的核酸(通过基因工程创造的)。
2)碳水化合物这些大分子尚未发现能够独立地作为治疗剂应用，但可以以其蛋白质复合物的形式应用，据认为它们是改进蛋白质活性的主要因素；碳水化合物的不同形式可以产生有意义的生理活性(如使用tPA时，其中不同的“糖形式”显示出完全不同的活性)。
3)类脂类脂大分子在细胞膜中起着重要的作用，但是，不考虑较小分子如前列腺素和A族维生素的话，尚未发现这些试剂有更多的治疗用途；令人感兴趣的是它们的大分子复合物，特别是它们作为脂质体的应用，所述的脂质体被用作其它治疗剂的释放系统。
4)大分子复合物最典型的大分子复合物是核酸/蛋白质复合物和蛋白质/碳水化合物复合物；病毒是一种大分子复合物，它可以是由核酸、蛋白质、碳水化合物和类脂组成的(例如流感病毒或HIV病毒)；人工复合物也是可以的，如包裹治疗剂的类脂包衣，这些人工复合物可以被位于类脂包衣中的活性物导引，其中所说的类脂涂层特异性地结合在指定靶向的组分上。
本发明所说的药物组合物可以定义如下A-一种或多种大分子和/或一种或多种大分子复合物，所说的大分子和/或大分子复合物保存在一种或多种药物可接受的载体中；B-或者，一种或多种大分子和一种或多种大分子复合物。所说的大分子和大分子复合物与一种或多种药物可接受的载体分开保存，于患者给药之前再将大分子、大分子复合物和药物可接受的载体混合起来；C-或者，至少两种组分，彼此分开保存，每一种均是由一种或多种大分子和/或一种或多种大分子复合物所组成，这些组分中的至少一种是以含有重水的药物可接受的载体的形式存在，不同的组分在患者给药时再混合到一起；D-或者，前述方案A、B或C中的至少两种药物组合物彼此分开保存，在患者给药之前再混合到一起。
举例来说，与下述实例B或C对应的用于患者给药的混合物的组合物具有如下特征-一方面，一种或多种大分子和/或一种或多种大分子复合物与一种或多种药物可接受的载体分开保存，另一方面，至少有两种组分彼此分开保存，每一种组分均包括一种或多种大分子和/或一种或多种大分子复合物，这些组分中的至少一种是以含有重水的药物可接受载体的形式存在的，大分子、大分子复合物、药物可接受的载体以及上述组分于患者给药前混合在一起。
大分子和/或大分子复合物可以用也可以不用含重水的药物可接受载体保存。
根据本发明的优选方式，本发明的组合物其大分子或大分子复合物以悬浮液或以溶液或以乳浊液的形式存在于药物载体中。
根据本发明的另一优选方式，本发明组合物其大分子和/或大分子复合物和药物可接受的载体是分开保存的，于患者给药之前再混合到一起。
举例来说，可以将大分子和/或大分子复合物冻干，然后于患者给药之前的很短时间或在给药即刻将它们与药物可接受的载体混合在一起。
在本发明的又一优选实施方式中，在本发明的组合物中，药物可接受的载体的体积约为0.1ml-20ml，特别是约0.1ml-5ml，大分子或大分子复合物的用量约为1μg-3g。
根据本发明优选的一次剂量实施方式，对于约1ml药物可接受的载体体积，大分子或大分子复合物的用量为约10μg。
根据本发明的另一优选实施方式，在本发明的组合物中，药物可接受载体是H2O和D2O的混合物，D2O与H2O的比例约为10％-100％，优选约40％-95％，更优选80％-95％。
通常，含有高浓度D2O(90-100％)的D2O/H2O混合物能够得到相当于把室温降低4-5℃(即，在25℃在含95％的D2O中的大分子其降解作用相当于正常20℃时H2O中所观察到的降解程度)的稳定程度。
另外，高浓度D2O能够严格防止微生物的污染。少数微生物能够耐70％以上浓度的D2O。因此，重水是一种有效的自我消毒介质(注意，有一些微生物是非病原体的，能够在D2O介质中存活)。
本发明的组合物是无毒的，实际上，D2O在体内水中的浓度小于10％是没有明显的毒性作用的，这点是已知的(参见A.Barbour，H.G.，(1937)Yale J Biol.Med.9，551；B.Barbour，H.G.，(1938)Am.J.Cancer32，440；C.Barbour，H.G.，(1938)J.Pharm.Exp.Therap.，62，158；D.Barbour H.G.，(1938)J.Pharm.Exp.Therap.，58，460)。
有可能受益于稳定化作用的药物制剂往往都是昂贵的，体积含量较少(如口服疫苗为0.15ml)，因此相对较高价格的D2O就显得不太重要了。
由于D2O和H2O是可任意溶和的，活泼的氢原子(1H和2H)可以自由交换，因此，可以断言，含有一定剂量保护剂或治疗剂的D2O能够很快分散于体内的水中。由于自然存在的充足的0.0156％的氢原子，在75Kg体重的个体内所存在的氘质量为约1g，相当于大约10g的重水。小剂量的给药(如0.1-5.0ml)不会超过成人体内已经存在的重水量。即使非常高的剂量(10ml-50ml)也不会使氘的含量(约0.1％)接近毒性水平(或10％-20％)或致死水平(25％以上)。
重水不会在生物体内积聚，与水一样通过尿液、汗液和呼吸排出。
总之，实验与观察表明重水可使约5℃的大分子物和其复合物具有稳定作用。尽管在2-5℃内变化相当小，但是上面提到的协同作用可显著地增强稳定性。大分子物甚至活的生物(某些通常为非致病的微生物适于在D2H介质中存活)能耐受通常与热变性有关的(在H2O介质中)的温度范围。某些复合物表明具有可逆的可耐受由弱离子强度的溶液(以H2O为例，KCl至少1mM)引起的双聚集。
在本发明的组合物中，药物载体可包含一种具有稳定作用的佐剂，优选MgCl2、羧甲基纤维素、聚乙二醇、碳水化合物分子如甘油、葡萄糖、蔗糖(以及其它的C6糖)、戊糖，以及它们的聚合物，碳水化合物可以与聚乙二醇复合，其中所存在的聚乙二醇的分子质量优选约500-5000道尔顿，更优选约1000-5000道尔顿。
在临床应用时，D2H(和其混合物)可与张力、pH、粘度调节剂以及上述稳定剂一起使用。
在本发明的组合物中，稳定用的佐剂与药物载体的重量比例为使所存在的药物载体其粘度不大于约0.2帕斯卡-秒(20厘泊)。
在本发明的组合物中，稳定用的佐剂与药物载体的重量比例小于约30％，优选约10％-30％。
在本发明的组合物中，大分子复合物和大分子是—免疫组合物中所用的那些大分子复合物和大分子，所说的免疫组合物如是对脊髓灰质炎、麻疹、肝炎，特别是乙型肝炎或丙型肝炎、流感、后天免疫缺陷综合症病毒(AIDS病毒，也称之为HIV＝人体免疫缺陷病毒)、白喉、破伤风、百日咳，或对至少上述两种综合病理具有免疫作用的那些组合物(例如对白喉、破伤风和脊髓灰质炎具有免疫作用的疫苗[DTP]，或者对白喉、破伤风、脊髓灰质炎和百日咳具有免疫作用的疫苗，商品名为个ETRACOQ)或-作为诊断试剂，如用于诊断麻疹或脑膜炎或HIV的诊断试剂的大分子复合物或大分子，或-作为治疗剂，如蛋白质、因子VIII、单克隆抗体或多克隆抗体、激素、核酸或核酶的大分子复合物或大分子。
本发明同样涉及一种制备本发明的药物组合物的方法，其特征在于该方法包括以下步骤-用D2O稀释以适宜的浓缩含水形式如20mg/ml存在的上述药物组合物，-和/或透析以含水形成存在的上述药物组合物中的D2O，-或用足以获得适宜浓度的药物组合物的用量D2O再次悬浮以固体形成存在的上述药物组合物。
将所说的大分子复合物放入含有重水的介质的溶液、悬浮液或乳浊液中。
可通过分析来优化药物组合物包含易损坏的活性物质，这种物质很难耐受其它物理处理。
本发明还涉及一种制备病毒源的免疫稳定制剂的方法，该制剂包含大分子复合物，从而合所说的大分子复合物在包含重水的介质中形成溶液、悬浮液或乳液。
通过病毒源制剂，可清楚地看出-失活或稀释的完全病毒，-表面或内部的且从一种病毒得到或通过已知的基因重组得到的病毒葡蛋白，例如丙肝病毒表面蛋白。
-病毒媒介，如呼吸系统病毒，水痘病毒如金丝雀痘，或表达病毒或细菌源的蛋白的病毒疫苗(参见EP083286)，-包胶囊或未包胶囊的核酸(RNA或DNA)，例如在EP465529(WO90/11092)或USP4394448中给出的“裸DNA”，该文献描述了在脂类载体中DNA或DNA片断的包囊技术。
本发明还涉及一种使病毒源，特别是病毒悬浮液的免疫制剂稳定的方法，其特征在于该方法包括加入重水的步骤-在使待感染的细胞与病毒接触之前，向病毒或待感染的细胞中加入重水，
-或在被病毒感染的细胞培养介质中加入重水，-或在前述步骤所获得的疫苗制剂中加入重水。
重水可在制备病毒悬浮液的方法中的任何步骤中加入，优选在病毒颗粒回收之后，在由病毒感染的培养阶段结束时加入。
对于以冷冻形式制备的疫苗，重水可用于在冷冻之前制备病毒悬浮液，和/或用于对上述经冷冻的疫苗再水化。重水将优选用于再水化步骤中。
本发明可优选采用的疫苗为流感、麻疹、水痘、流行性腮腺炎、风疹、登革热、HIV、疱疹。
以下所给出的实例仅用于说明本发明，并非对本发明保护范围的限定。
它们表明1重要疫苗的热稳定性；2典型大分子复合物的稳定性，表明由于D2O和相关的等同效应而产生的热稳定作用的可逆性。
这些实例可用于下述情形核酶，重组乙肝或丙肝疫苗，流感疫苗，麻疹疫苗，DTP疫苗(白喉、破伤风和脊髓灰质炎)，破伤风疫苗，HIV诊断药盒。
需要指出，所有引证的参考文献均引入本文以作参考。
附

图1显示按照本发明的药物组合物在37℃时的热稳定性。
横坐标为时间(以天数表示)，纵坐标为病毒粒子浓度(以TCID50/ml的单位数表示，TCID50是细胞中细胞毒素的感染剂量)的对数。
带有菱形的曲线相应于水溶液中的药物组合物；带有方块的曲线相应于含有作为佐剂的MgCl2(浓度1M)的水溶液中的药物组合物；带有三角形的曲线相应于溶解在重水(在95％时)中的本发明的药物组合物；带有叉号的曲线相应于溶解在D2O和含有MgCl2(浓度1M)作为佐剂的本发明的药物组合物。
附图2显示按照本发明的药物组合物在42℃时的热稳定性。
横坐标为时间(以天数表示)，纵坐标为病毒粒子浓度(以TCID50/ml的单位数表示)的对数。
带有菱形的曲线相应于水溶液中的药物组合物；带有方块的曲线相应于含有作为佐剂的MgCl2(浓度1M)的水溶液中的药物组合物；带有三角形的曲线相应于溶解在重水(在95％时)中的本发明的药物组合物；带有叉号的曲线相应于溶解在D2O和含有MgCl2(浓度1M)作为佐剂的本发明的药物组合物。
附图3显示按照本发明的药物组合物在45℃时的热稳定性。
横坐标为时间(以天数表示)，纵坐标为病毒粒子浓度(以TCID50/ml的单位数表示)的对数。
带有菱形的曲线相应于水溶液中的药物组合物；带有方块的曲线相应于含有作为佐剂的MgCl2(浓度1M)的水溶液中的药物组合物；带有三角形的曲线相应于溶解在重水(在95％时)中的本发明的药物组合物；带有叉号的曲线相应于溶解在D2O和含有MgCl2(浓度1M)作为佐剂的本发明的药物组合物。
附图4表明萨宾脊髓灰质炎病毒株3的热失活。该病毒的初始尝试固定在5×106TCID50/50μl(TCID50是细胞中细胞毒素的感染剂量)。
萨宾病毒株3相等效价(5×106TCID50/50μl)的悬浮液用下列介质制备a)普通水中的Dulbecco-MEM(相应于附图中的缩写词“介质H”)；b)最终浓度为87％的重水中的(相应于附图中的缩写词“介质D”)；c)浓度为1M的在水中的MgCl2，缓血酸胺缓冲至pH7.2(相应于附图中的缩写词“介质H-Mg”)；
d)浓度为1M的在最终浓度为87％的重水中的MgCl2，缓血酸胺缓冲至pH7.2(相应于附图中的缩写词“介质D-Mg”)。
在4℃、37℃、42℃和45℃培养3天(附图4A部分)和7天(附图4B部分)后，测定病毒类型。结果以在-30℃下保存的初始病毒的效价与每一样品效价之间的LogTCID50/50μl的差值表示。显示了每一结果的平均和标准误差。
附图5表明萨宾脊髓灰质炎病毒株1在D2O和/或MgCl2存在下的热失活(详细情况参见附图4)。附图5的A部分相应于培养3天，附图5的B部分相应于培养7天。
附图6表明萨宾脊髓灰质炎病毒株2在D2O和/或MgCl2存在下的热失活(详细情况参见附图4)。附图6的A部分相应于培养3天，附图6的B部分相应于培养7天。
附图7表明萨宾脊髓灰质炎病毒株3在不同的D2O和MgCl2浓度时的稳定性。
除了D2O浓度(附图7的A部分)和MgCl2浓度(附图7的B部分)外，实验条件与附图4描述的相同。
结果以在-30℃下保存的悬浮液的初始效价(LogTCID50/50μl)与培养3天后的每一样品的效价之间的差值表示，病毒的初始效价为5×106TCID50/50μl。
附图8表示随水的离子强度的变化和有无重水的存在是否出现核小体核心粒子(NCP)沉降的情况。
NCP的沉降在pH7.72(D2O介质中，按玻璃电极pH为8.15)，0.2mM EDTA。其后表1所示的离子强度下进行。所有沉降在50,000rpm下用含6个测定细胞的离心器以MSE CENTRISCAN分析型超离心进行。A至C部分相应于6分钟的测定间隙，D至G部分相应于8分钟的测定间隙，波长254nm，样品浓度0.5到1.0mg/ml。
横坐标为测量的范围，纵坐标为DNA浓度，这一附图表明，与离子强度一样，重水强化NCP粒子。
实施例1
用重水热稳定脊髓灰质炎病毒根据服用时的传染力使萨宾脊髓灰质炎疫苗中的减毒病毒致免疫。口服脊髓灰质炎疫苗(OPV)的摄取速度与疫苗中所含的三种病毒株1、2和3各自的剂量有关。在某些第三世界国家中摄取速度较低可能是由于在服用疫苗前冷藏链破坏。萨宾疫苗的毒株3是非常关键的，因为其致免疫性和热稳定性相对较差。
目前，世界卫生组织(WHO)要求在疫苗中通过加入氯化镁(浓度为1M)稳定OPV。目前该方法只是最好的折中方法，这远不是理想的解决办法(在45℃经过7天后，丧失小于0.5的对数活性)。
已经证实，按照本发明，由95％的重水(不加任何其它佐剂)提供的稳定性等于或优于氯化镁依照完全标准的方法(当然除了使用重水自外)所提供的稳定性。
实验目的在下列实施例中所涉及的所有重水(D2O)均是指95％的重水。
1.测定重水对萨宾疫苗的稳定作用并进行定量。
2.比较(a)重水和(b)加有氯化镁的重水的热稳定作用。
与萨宾疫苗有关的多数问题由第3种毒株引起。因此，病毒是开始研究的目标。
对脊髓灰质炎研究的一般性内容用病毒悬浮液感染使一名男子OPV致免疫。问题是OPV对高温环境敏感以致于降解(见上文)。对于WHO，在2000年以前消灭脊髓灰质炎的任务部分取决于改进稳定现有疫苗的方法(特别是对于发展中国家)。
下列结果表明不加任何其它佐剂，在95％重水中萨宾疫苗中的第3种毒株有非常明显的稳定性(其它条件与那些使用水的情况相同)。重水的作用略好于目前最佳的解决方法(氯化镁，1M)。
实验方法选择萨宾毒株3作用模型。按照常规方法培养病毒。
通过将病毒丸(在标准条件下经超速离心沉淀得到)悬浮于重水(19倍体积)和20×浓缩的PBS(磷酸盐缓冲的盐水)缓冲液(1倍体积)中加入重水。超速离心对病毒没有显著影响。用标准介质(水、水/氯化镁和氯化镁＋重水)进行比较研究。
将病毒的浓度调至在95％重水中的约1010单位/ml。
按照下面的曲线使病毒耐受不同的温度条件。
病毒滴定制备一系列所有样品的稀释液(Eagle’s MEM，含有Eagle’s盐、4％FCS、3％碳酸氢钠、青霉素和链霉素)。向其中加入Hep2C细胞悬浮液，并在35℃培养5-7天。用“Naphthalene Black”对菌斑进行染色以评估细胞存活力。然后计算效价。每一实验都包括对照组。下列结果包括本发明组合物在下列三种温度下的稳定程度。
37℃42℃45℃结果，在37℃的天数，病毒单位的对数值，三个样品的平均值天数H2OMgCl2D2OMgCl2/D2O0 10 1010 102 8.6 9.5 9.6 9.65 7.8 8.1 8.1 8.27 6.8 7.5 7.7 7.8结果，在42℃的天数，病毒单位的对数值，三个样品的平均值天数H2OMgCl2D2OMgCl2/D2O0 10 10 10 102 5.4 8.89.4 9.35 3.4 5.46.0 6.27 2.8 5.25.5 5.4结果，在45℃的天数，病毒单位的对数值，三个样品的平均值天数H2OMgCl2D2OMgCl2/D2O0 10 1010 102 4.6 7.8 8.5 8.75 1.8 4.8 5.8 6.57 0.4 4.7 4.7 4.9实施例2用重水稳定核糖体结构核小体核颗粒由4对蛋白质分子组成，即H2a、H2b、H3和H4。在每一个蛋白质八聚物的周围包裹着144个碱基对的DNA，形成1.75螺旋圈(NO11 M.(1974)Nature 251，249-251；Kornberg R.D.(1974)Science 184，868-871；Finch J.等(1977)Nature 269，29-35)。Gordon研究了离子强度对NPC沉淀性质的影响(Gordon V.C.等(1978)Proc.Nat.Aead.Sci(USA).75，660-663)。下列实施例说明了就NCP稳定性质而言，普通水与重水之间的主要差别。NPC可以看作为用于核酸/蛋白质复合物组的一种模型系统。
实验方法(suau P.等20(1977)Nuc.Acids Res.43769-3786)在几种离子强度和重水浓度下，用分析超速离心法(MSE CENTRISCAN)对由鸡红细胞核制备的NCP沉淀物进行研究。通过在大体积的重水中进行透析将在水中的不同浓度和离子组成的几份样品在重水中进行再平衡。所有溶液用pH7.75的0.2mM EDTA进行缓冲(在重水中，调至玻璃电极的pH8.15)。由氯化钾提供离子强度。
结果NCP的沉淀取决于水中的离子组成。在低离子浓度的含水介质中NCP的解聚是非常明显的(图4A)。在重水中，NCP的降解不明显(图4D)。甚至于离子强度依赖性的沉淀值(以Svedburg单位-s表示)也变得非常有限(见表2和图4)。用重水透析后解聚的NCP(4A)再次变成具有NCP沉淀特性的单独的颗粒。
在所有研究中，采用在重水介质中的NCP-在水中观察则是最密实的结构(在使沉淀值标准化以校正重水及其混合物的密度和粘度的差异之后)。
在补充数据中(这里没有给出)，发现在低离子强度的约40％重水中稳定作用最明显。
表1
*重水粘度和密度的校正值。
实施例3脊髓灰质炎疫苗的稳定在上述图4-7所述条件下进行稳定。
图4-7所示结果证明了重水的稳定作用。当用含有重水的溶液代替水溶液工业化制备脊髓灰质炎病毒(萨宾1、2和3)(初级病毒悬浮液的稀释液感染细胞培养物的澄清上清液)时，如果最终浓度是约90％，所得结果比用离心后再悬浮的病毒所得结果更明显(见图1-3)。
实施例4脊髓灰质炎疫苗在不同的含重水溶液中的稳定性。
在于水溶液中制备的三种单价疫苗(萨宾1、2和3)的混合物制备完成后，立即加入重水。最终的重水浓度是80％。
对下列配方进行实验1.白蛋白-氯化镁在水溶液中的混合物2.白蛋白-氯化镁在含重水的溶液中的混合物3.氨基酸-氯化镁在含重水的溶液中的混合物4.氨基酸-蔗糖在含重水的溶液中的混合物总效价TCID50/剂量
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实施例5水痘疫苗的稳定水痘病毒是一种脆弱的病毒。
在水溶液和含80％重水(D2O)的溶液中制备常规稳定的水痘溶液。
权利要求
1.一种稳定的药物组合物，该组合物包括选自核酸、类脂或碳水化合物中的一种或多种大分子，和/或一种或多种大分子复合物，其特征在于该组合物含有一种或多种药物可接受的载体，这些载体中的至少一种含有重水(D2H)。
2.根据权利要求1的组合物，其特征在于大分子复合物选自蛋白质-碳水化合物、蛋白质-类脂、核酸-碳水化合物、核酸-类脂、核酸-蛋白质、与碳水化合物和/或类脂可能的复合物以及病毒中的复合物。
3.根据前述任一权利要求的组合物，其特征在于大分子或大分子复合物以悬浮液或以溶液或以乳浊液的形式存在于药物可接受的载体中。
4.根据权利要求1或2的组合物，其特征在于大分子和/或大分子复合物和药物可接受的载体是分开保存的，于给药时再混合到一起。
5.根据权利要求1-4任意之一的组合物，其特征在于药物载体的体积为约0.1-20ml，优选约0.1-5ml，大分子或大分子复合物的量为约1μg-3g。
6.根据前述权利要求任意之一的组合物，其特征在于药物载体是H2O-D2O的混合物，并且D2O与H2O的重量比例为约10％-100％，优选约40％-95％，更优选约80％-95％。
7.根据前述权利要求任意之一的组合物，其特征在于药物载体含有稳定用的佐剂，优选MgCl2、羧甲基纤维素、聚乙二醇、碳水化合物分子如甘油、葡萄糖、蔗糖(以及其它的C6糖)、戊糖，以及它们的聚合物，碳水化合物可以与聚乙二醇复合，其中所存在的聚乙二醇的分子质量优选约500-5000道尔顿，更优选约1000-5000道尔顿。
8.根据权利要求7的组合物，其特征在于稳定用的佐剂与药物载体的重量比例为使所存在的药物载体其粘度不大于约0.2帕斯卡-秒(20厘泊)。
9.根据权利要求8的组合物，其特征在于稳定用的佐剂与药物载体的重量比例小于约30％，优选约10％-30％。
10.根据权利要求1-9任意之一的组合物，其特征在于大分子复合物和大分子是—免疫组合物中所用的那些大分子复合物和大分子，所说的免疫组合物如是对流感、脊髓灰质炎、麻疹、水痘、流行性腮腺炎、风疹、登革热、肝炎，特别是乙型肝炎或丙型肝炎、后天免疫缺陷综合症病毒(AIDS病毒)、白喉、破伤风、百日咳，或对至少上述两种综合病理具有免疫作用的那些组合物，或-作为诊断试剂，如用于诊断麻疹或脑膜炎或HIV的诊断试剂的大分子复合物或大分子，或-作为治疗剂，如蛋白质、因子VIII、单克隆抗体或多克隆抗体、激素、核酸或核酶的大分子复合物或大分子。
11.一种制备权利要求1-10任意之一药物组合物的方法，其特征在于该方法包括以下步骤-用D2O稀释以适宜的浓缩含水形式如20mg/ml存在的上述药物组合物，-和/或透析以含水形成存在的上述药物组合物中的D2O，-或者，用足以获得适宜浓度的药物组合物的用量的D2O再次悬浮以固体形成存在的上述药物组合物。
12.制备含有病毒源大分子复合物的稳定化组合物的方法，其特征在于将所说的大分子复合物以溶液、悬浮液或乳浊液的形式放入含有重水的介质中。
13.一种使免疫用病毒源制剂，特别是病毒悬浮液稳定的方法，其特征在于该方法包括加入重水的步骤-在使待感染的细胞与病毒接触之前，向病毒或待感染的细胞中加入重水，-或向被病毒感染的细胞培养介质中加入重水，-或向前述步骤所获得的疫苗制剂中加入重水。
全文摘要
本发明涉及的是一种包括选自核酸、类脂或碳水化合物中的一种或多种大分子，和/或一种或多种大分子复合物的药物组合物，该组合物的特征在于其含有一种或多种药物可接受的载体，这些载体中的至少一种含有重水(D
文档编号A61K47/48GK1119414SQ94191508
公开日1996年3月27日 申请日期1994年3月17日 优先权日1993年3月17日
发明者卡尔·辛普森, 拉迪·克莱尼克 申请人:卡尔·辛普森, 巴士德尔研究所