高通量三维微流控芯片免疫测定装置及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种高通量三维微流控芯片免疫测定装置及其制备方法，疫测定装置典型例子包括导流管和立体玻璃芯体，玻璃芯体的侧面上修饰有共聚物刷，共聚物刷上点印有检测探针；本检测装置将传统的二维芯片变为三维的微阵列芯片，并极大地提高了芯片的检测通量，同时促进传质过程、加快目标和探针分子的结合或反应速率，大幅度缩短检测时间。本发明中制备方法包括清洁活化玻璃芯体的表面，并进一步修饰PEGMA-GMA共聚物刷，然后在聚物刷上点印检测探针，置于导流管中形成三维微流控芯片免疫测定装置，比较现有微阵列免疫芯片本发明免疫测定装置检测通量高，检测时间短，且不需要微加工，制造成本低。
【专利说明】高通量三维微流控芯片免疫测定装置及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种免疫测定装置，特别涉及一种新概念的高通量三维微流控芯片免疫测定装置及其制备方法。
【背景技术】
[0002]免疫分析是一种利用抗原抗体之间特异性结合反应对小分子化合物、生物大分子以及微生物等进行定性和定量检测的方法，已广泛应用于生物医学诊断、环境评价、食品安全检测等领域。近年来，微阵列和微流控免疫芯片因其样品和试剂用量少、分析通量高、易于自动化等特征被普遍用于科研和日常生活中。对于微阵列技术，虽然市场上有成熟的点样仪器和分析软件，但在静止的反应状态下传质过程比较缓慢，微阵列芯片上抗原-抗体反应时间较长。对于微流控技术，流动的检测体系加快了传质过程从而缩短了抗体-抗原的反应时间，但因芯片的微加工需要严格的条件和昂贵的仪器，抑制了微流控技术的发展。
[0003]目前虽然有研究者将微阵列和微流控技术结合用以免疫检测，但现有装置仍然没有解决微流体平台的微加工技术要求苛刻、费用昂贵的缺点；另外，现有微阵列检测仅在一个平面上进行，芯片的有效利用面积小，检测通量相对较低。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明的目的是提供一种高通量三维微流控芯片免疫测定装置及其制备方法，以提高免疫检测通量、提高检测信噪比和灵敏度和提高检测工作效率。
[0005]本发明高通量三维微流控芯片免疫测定装置，包括导流管和设置于导流管内的玻璃芯体,所述玻璃芯体为正棱柱体、正棱柱管形、圆柱形或圆柱管形,所述玻璃芯体的外侧面上修饰有共聚物刷，所述共聚物刷上点印有检测探针。
[0006]进一步，所述玻璃芯体为长方体形。
[0007]进一步，所述检测探针为目标检测物的单克隆抗体。
[0008]进一步，所述单克隆抗体为抗人癌胚抗原单克隆抗体或/和抗人甲胎蛋白单克隆抗体。
[0009]本发明高通量三维微流控芯片免疫测定装置的制备方法，包括如下步骤:
[0010]a.将玻璃芯体的侧面清洗活化；
[0011]b.在活化后的玻璃芯体的侧面上修饰PEGMA-GMA共聚物刷；
[0012]c.在玻璃芯体侧面上的PEGMA-GMA共聚物刷上点印检测探针；
[0013]d.将步骤c中结合了检测探针的玻璃芯体放置于导流管中形成三维微流控芯片免疫测定装置。
[0014]进一步，所述步骤a中，将玻璃芯体的侧面清洗活化的步骤包括:先将玻璃芯体用体积分数为3 %的3-氨丙基三乙氧基硅烷浸泡2个小时后清洗干净，再放入真空干燥箱，在110°C下真空退火2个小时。
[0015]进一步，所述步骤b中，在玻璃芯体的侧面修饰PEGMA-GMA共聚物刷的步骤包括:[0016]将侧面清洗活化后的玻璃芯体放入含三氯甲烷、三乙胺和2-溴异丁酰溴的混合溶液中，先在0°c冰浴中孵育20分钟，后放置室温下继续孵育2个小时；所述混合溶液中每20mL的三氯甲烷混合溶液中三乙胺的终浓度为55禮，2-溴异丁酰溴的终浓度为50mM ;然后将玻璃芯体从混合溶液中取出清洗干净后再放入聚合溶液中孵育6个小时，所述聚合溶液中甲醇和水的最终体积分数为50%,溴化铜的最终浓度为3.35mg/mL,联卩比唳的最终浓度为4.6mg/mL,抗坏血酸的最终浓度为2.38mg/mL,甲基丙烯酸缩水甘油酯的最终体积分数为2%，聚乙二醇甲基丙烯酸酯的最终体积分数为20%。
[0017]进一步，所述步骤c中，在修饰了 PEGMA-GMA共聚物刷的玻璃芯体的侧面上结合检测探针的步骤包括:
[0018]将玻璃芯体用乙醇和去离子水依次冲洗，再干燥，然后通过芯片点样仪将10yg/mL的检测探针以微阵列形式点在玻璃芯体的的四个侧面上，并在室温下放入真空箱干燥2个小时，最后用Tris缓冲液清洗和浸泡。
[0019]本发明的有益效果:
[0020]1、本发明高通量三维微流控芯片免疫测定装置，其玻璃芯体的四个侧面均具有聚合物刷和微阵列的检测探针，聚合物刷可有效提高固定抗体的数量并降低非特异性吸附，相对于现有微阵列免疫芯片本免疫测定装置的有效使用面积大大提高，且检测灵敏度高。
[0021]2、本发明高通量三维微流控芯片免疫测定装置，其通过在玻璃芯体外套导流管，检测对象可在流动泵的驱动下在导流管的微通道内流动，实现流动检测，从而可很大的缩短抗体-抗原的反应时间；因此本三维微流控芯片免疫测定装置不仅兼具了微阵列和微流控的检测优势，而且其检测效率现对于现有微阵列和微流控免疫芯片有了很大的提高，非常适用于大规模快速筛查，可在疾病早期筛查、食品安全分析、环境污染物监控等方面得到广泛应用。
[0022]3、本发明高通量三维微流控芯片免疫测定装置，其玻璃芯体和导流管结构简单，且不要通过专门的微加工设备制造，制造成本低。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为本高通量三维微流控芯片免疫测定装置的立体结构示意图；
[0024]图2为本高通量三维微流控芯片免疫测定装置的纵向剖视示意图；
[0025]图3为本高通量三维微流控芯片免疫测定装置在静止和不同流速的流通条件下，抗体-抗原结合与反应时间的关系图；
[0026]图4为本高通量三维微流控芯片免疫测定装置对多个肿瘤标志物检测的特异性和选择性的柱状图和荧光照片；
[0027]图5为本高通量三维微流控芯片免疫测定装置对肿瘤标志物AFP和CEA检测得到的标准曲线和荧光照片。
【具体实施方式】
[0028]下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
[0029]实施例一，本实施例高通量三维微流控芯片免疫测定装置，包括导流管I和设置于导流管I内的玻璃芯体2，所述玻璃芯体2为长方体形，所述玻璃芯体2的侧面上修饰有共聚物刷，所述共聚物刷上点印有检测探针。长方体形的玻璃芯体2在点印检测探针时，可将多个玻璃芯体并列布置同时点印，可提高工作效率。当然在不同实施例中，所述玻璃芯体2还可是其它形状的正棱柱体、正棱柱管形、圆柱形或圆柱管形。
[0030]本实施例高通量三维微流控芯片免疫测定装置，其玻璃芯体2的四个侧面均具有聚合物刷和微阵列的检测探针，聚合物刷可有效提高固定抗体的数量并降低非特异性吸附，相对于现有微阵列免疫芯片本免疫测定装置的有效使用面积大大提高，且检测灵敏度高。进一步，本高通量三维微流控芯片免疫测定装置，其通过在玻璃芯体2外套导流管1，检测对象可在流动泵的驱动下在导流管I的微通道内流动(玻璃芯体2和导流管I间的间隙小，可使所需的检测对象用量较少)，实现流动检测，从而可很大的缩短抗体-抗原的反应时间；因此本三维微流控芯片免疫测定装置不仅兼具了微阵列和微流控的检测优势，而且其检测效率现对于现有微阵列和微流控免疫芯片有了很大的提高，非常适用于大规模快速筛查，可在疾病早期筛查、食品安全分析、环境污染物监控等方面得到广泛应用。进一步，本高通量三维微流控芯片免疫测定装置，其玻璃芯体2和导流管I结构简单，且不要通过专门的微加工设备制造，制造成本低。
[0031]本实施例中，所述检测探针为目标检测物的单克隆抗体。
[0032]本实施例中，所述单克隆抗体为抗人癌胚抗原单克隆抗体，当然在不同实施例中，所述单克隆抗体还可为抗人甲胎蛋白单克隆抗体。
[0033]实施例二、本实施例高通量三维微流控芯片免疫测定装置的制备方法，包括如下步骤:
[0034]a.将玻璃芯体的侧面清洗活化；
[0035]b.在活化后的玻璃芯体的侧面上修饰PEGMA-GMA共聚物刷；
[0036]c.在玻璃芯体侧面上的PEGMA-GMA共聚物刷上点印检测探针；
[0037]d.将步骤c中结合了检测探针的玻璃芯体2放置于导流管I中形成三维微流控芯片免疫测定装置。
[0038]所述步骤a中，将玻璃芯体的侧面清洗活化的步骤包括:先将玻璃芯体用体积分数为3%的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)乙醇熔液浸泡2个小时，然后用乙醇和去离子水依次清洗干净，然后用氮气吹干，再放入真空干燥箱，在110°C下真空退火2个小时。
[0039]所述步骤b中，在玻璃芯体的侧面修饰PEGMA-GMA共聚物刷的步骤包括:
[0040]将侧面清洗活化后的玻璃芯体放入含三乙胺(TEA)和2-溴异丁酰溴(BIB)的三氯甲烷混合溶液中，先在0°c冰浴中孵育20分钟，后放置室温下继续孵育2个小时；所述混合溶液中每20mL的三氯甲烷混合溶液中三乙胺的终浓度为55mM，2-溴异丁酰溴的终浓度为50mM ;然后将玻璃芯体从混合溶液中取出清洗干净后再放入聚合溶液中孵育6个小时，所述聚合溶液中甲醇和水的最终体积分数为50%,溴化铜的最终浓度为3.35mg/mL,联批唳的最终浓度为4.6mg/mL,抗坏血酸的最终浓度为2.38mg/mL,甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)的最终体积分数为2%，聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)的最终体积分数为20%。
[0041]所述步骤c中，在修饰了 PEGMA-GMA共聚物刷的玻璃芯体的侧面上结合检测探针的步骤包括:
[0042]将玻璃芯体用乙醇和去离子水依次冲洗，再干燥，然后通过芯片点样仪将100 μ g/mL的检测探针以微阵列形式点在玻璃芯体的的四个侧面上，并在室温下放入真空箱干燥2个小时，最后用Tris缓冲液清洗和浸泡；本实施例中所述检测探针为鼠抗人CEA(癌胚抗原,carcino-embryonic antigen)单克隆抗体，PEGMA-GMA共聚物刷中的甲基丙烯酸缩水甘油酯的环氧键与单克隆抗体上的氨基反应形成化学键，使单克隆抗体共价固定于玻璃毛细
管表面。
[0043]本实施例高通量三维微流控芯片免疫测定装置的检测肿瘤标志物CEA的具体步骤如下:
[0044]将分别含Opg/mL, 0.lpg/mL, lpg/mL, 10pg/mL, lOOpg/mL, Ing/mL, lOng/mL, 10ng/mL, I μ g/mL, 10 μ g/mL肿瘤标志物CEA的PBS溶液采用流动泵分别泵入此装置，在流速为15μ L/min流动反应30分钟，再将I μ g/mLCy3标记的鼠抗人CEA单克隆抗体泵入此装置30分钟，最后将TBS溶液和去离子水分别流过此装置，干燥后，用荧光扫描仪读取荧光信号，然后以荧光强度为纵坐标，肿瘤标志物CEA的浓度为横坐标，绘制标准曲线，如图5所示。
[0045]实施例三、本实施例高通量三维微流控芯片免疫测定装置的制备方法与实施例一的区别在于:所述检测探针为鼠抗人AFP (甲胎蛋白，alpha-fetalprotein)单克隆抗体，本实施例的其它步骤与实施例二相同，在此不再赘述。
[0046]本实施例高通量三维微流控芯片免疫测定装置的检测肿瘤标志物AFP的具体步骤如下:
[0047]将分别含有0pg/mL,0.lpg/mL,lpg/mL,10pg/mL,100pg/mL,Ing/mL,10ng/mL,lOOng/mL, I μ g/mL, 10 μ g/mL肿瘤标志物APF的PBS溶液分别采用流动泵将样品溶液以流速为15 μ L/min流经此装置30分钟，再将I μ g/mL Cy3标记的鼠抗人AFP多克隆抗体泵入此装置30分钟，最后将TBS溶液和去离子水分别流过此装置，干燥后，用荧光扫描仪读取荧光信号，然后以荧光强度为纵坐标，肿瘤标志物AFP浓度为横坐标，绘制标准曲线，如图5所
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[0048]实施例四、本实施例高通量三维微流控芯片免疫测定装置的制备方法与实施例一的区别在于:所述检测探针为鼠抗人AFP(甲胎蛋白，alpha-fetal protein)单克隆抗体和鼠抗人CEA(癌胚抗原，carcino-embryonic antigen)单克隆抗体,本实施例的其它步骤与实施例二相同，在此不再赘述。
[0049]本实施例高通量三维微流控芯片免疫测定装置同时检测多组分肿瘤标志物的具体步骤如下:
[0050]采用流动泵将含有100ng/mL肿瘤标志物APF和CEA的PBS混合溶液或血清以流速为15 μ L/min流经此装置30分钟，再将I μ g/mL Cy3标记的鼠抗人AFP单克隆抗体和I μ g/mL Cy3标记的鼠抗人CEA单克隆抗体的PBS混合溶液泵入此装置30分钟，最后将TBS溶液和去离子水分别流过此装置，干燥后，用荧光扫描仪读取荧光信号，然后以荧光强度为纵坐标，肿瘤标志物AFP和CEA为横坐标,绘制柱状图,如图4所示。
[0051]最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【权利要求】
1.一种高通量三维微流控芯片免疫测定装置，其特征在于:包括导流管和设置于导流管内的玻璃芯体，所述玻璃芯体为正棱柱体、正棱柱管形、圆柱形或圆管形，所述玻璃芯体的外侧面上修饰有共聚物刷，所述共聚物刷上点印有检测探针。
2.根据权利要求1所述的高通量三维微流控芯片免疫测定装置，其特征在于:所述玻璃芯体为长方体形。
3.根据权利要求1所述的高通量三维微流控芯片免疫测定装置，其特征在于:所述检测探针为目标检测物的单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的高通量三维微流控芯片免疫测定装置，其特征在于:所述单克隆抗体为抗人癌胚抗原单克隆抗体或/和抗人甲胎蛋白单克隆抗体。
5.一种权利要求1-4中任一所述的高通量三维微流控芯片免疫测定装置的制备方法，其特征在于:包括如下步骤: a.将玻璃芯体的侧面清洗活化； b.在活化后的玻璃芯体的侧面上修饰PEGMA-GMA共聚物刷； c.在玻璃芯体侧面上的PEGMA-GMA共聚物刷上点印检测探针； d.将步骤c中结合了检测探针的玻璃芯体放置于导流管中形成三维微流控芯片免疫测定装置。
6.根据权利要求5所述的高通量三维微流控芯片免疫测定装置的制备方法，其特征在于:所述步骤a中，将玻璃芯体的侧面清洗活化的步骤包括:先将玻璃芯体用体积分数为3%的3-氨丙基三乙氧基硅烷浸泡2个小时后清洗干净，再放入真空干燥箱，在110°C下真空退火2个小时。
7.根据权利要求5所述的高通量三维微流控芯片免疫测定装置的制备方法，其特征在于:所述步骤b中，在玻璃芯体的侧面修饰PEGMA-GMA共聚物刷的步骤包括: 将侧面清洗活化后的玻璃芯体放入含三氯甲烷、三乙胺和2-溴异丁酰溴的混合溶液中，先在(TC冰浴中孵育20分钟，后放置室温下继续孵育2个小时；所述混合溶液中每20mL的三氯甲烷混合溶液中三乙胺的终浓度为55mM，2-溴异丁酰溴的终浓度为50mM;然后将玻璃芯体从混合溶液中取出清洗干净后再放入聚合溶液中孵育6个小时，所述聚合溶液中甲醇和水的最终体积分数为50%,溴化铜的最终浓度为3.35mg/mL,联卩比唳的最终浓度为4.6mg/mL,抗坏血酸的最终浓度为2.38mg/mL,甲基丙烯酸缩水甘油酯的最终体积分数为2%，聚乙二醇甲基丙烯酸酯的最终体积分数为20%。
8.根据权利要求5所述的高通量三维微流控芯片免疫测定装置的制备方法，其特征在于:所述步骤c中，在修饰了 PEGMA-GMA共聚物刷的玻璃芯体的侧面上结合检测探针的步骤包括: 将玻璃芯体用乙醇和去离子水依次冲洗,再干燥,然后通过芯片点样仪将100μ g/mL的检测探针以微阵列形式点在玻璃芯体的的四个侧面上，并在室温下放入真空箱干燥2个小时，最后用Tris缓冲液清洗和浸泡。
【文档编号】B01L3/00GK104034895SQ201410260221
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月12日 优先权日:2014年6月12日
【发明者】李长明, 刘英帅, 张嫄媛 申请人:西南大学