一种表面多孔型核壳结构硅胶微球及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种表面多孔型核壳结构硅胶微球及其制备方法及其色谱分离应用，属于分析化学领域。

背景技术：

近年来，由固体核和表面多孔的壳组成的核壳结构色谱固定相被广泛应用于高流速低压色谱体系中。由于固体核表面多孔的外壳能够增大固体核的尺寸，降低了柱压，同时由于多孔的外壳材料增大了核的比表面积，从而提高色谱柱载样量，如2.2μm核壳结构硅胶由0.5μm厚多孔的壳和1.7μm的核组成(g.guiochonandf.gritti,journalofchromatographya,2011,1218,1915-1938.)，能够产生和2μm的粒子相同的柱效，同时柱压又接近于装填了3μm的硅胶微球填料的色谱柱的柱压。因而，核壳结构的较小的孔隙体积能够减少纵向扩散(即vandeemter方程中的b项)，同时，较短的扩散路径能够减小传质阻力，从而减小vandeemter方程中的c项，因而对难以采用色谱分离的大分子化合物如蛋白质和多肽等生物大分子化合物具有较好的分离效果。

vandeemter方程：h＝a+b/u+cu

核壳结构中的核和壳可以是不同的材料或者相同的材料不同的结构组成，如图所示，图1为几种不同的核壳结构粒子的示意图，其中核可以是一个单独的球(图1(a))或者是几个小球的合体(图1(b))；核壳结构可能是含有一个中空的外壳和中间一个小球(图1(c))，或像一个蛋黄-蛋壳的结构(图1(c))；壳结构可以是一个连续层(图1(c)和图1(h))、一些更小的球吸附到一个大核表面(图1(d)和图1(e))或者核是由一群小核聚集合成(图1(f))(x.l.zhang,h.y.niu,w.h.li,y.l.shiandy.q.cai,chemicalcommunications,2011,47,4454-4456.)。比较复杂的核壳结构是将一些更小的小球嵌入到壳里面(图1(g))(x.y.lai,j.li,b.a.korgel,z.h.dong,z.m.li,f.b.su,j.a.duandd.wang,angewandtechemie-internationaledition,2011,50,2738-2741.)或者是由多层壳组成(图1(i))(r.j.gui,a.wanandh.jin,analyst,2013,138,5956-5964.)，这些核和壳都由一个无孔的核和多孔的壳组成，核壳结构的材料被广泛应用于色谱分离中，其中应用最多的基质填料是硅胶。不同孔径大小的核壳结构可以用于分离不同大小的分析物，当核壳材料的孔径在8-10nm之间，适合用于小分子化合物的分离(j.j.destefano,s.a.schuster,j.m.lawhornandj.j.kirkland,journalofchromatographya,2012,1258,76-83.)，孔径更大的填料可用于分离更大相对分子质量的分子化合物。如孔径16nm用于分离多肽和小分子蛋白质(mw<15kda)(j.j.kirkland,f.a.truszkowski,c.h.dilksandg.s.engel,journalofchromatographya,2000,890,3-13.)；更大孔径的多孔材料，如孔径40nm，可以允许大分子(mw<500kda)化合物能够无限制地进入固定相，从而获得较好的分离效果。

大部分核壳结构的硅胶材料是采用层层自组装(lbl)的方法制备，特别是现在市场中商品化的核壳结构的硅胶(g.guiochonandf.gritti,journalofchromatographya,2011,1218,1915-1938.)。该方法利用正负电荷之间的静电作用(或氢键作用、共价键、范德华力等)组装成多层，具体方法为：硅胶核首先吸附一层带电聚合物(如带负电荷的硅胶能够吸附带正电荷的聚合物)，表面多余的带电聚合物被水洗掉，这个包裹的核材料再浸润在与带电聚合物具有相反电荷的纳米颗粒溶液中，从而再吸附一层壳。这个过程是交替重复沉浸在带电聚合物溶液和纳米颗粒的悬浮液中，直到形成所需厚度的壳(g.guiochonandf.gritti,journalofchromatographya,2011,1218,1915-1938.)；最后将形成的粒子采用高温煅烧去除表面的有机聚合物，形成核壳多孔的材料。但是这种制备方法时间长，重现性差，因而需要找出一种制备简单，方法可控，重现性更好的制备核壳型材料的方法。

技术实现要素：

为了克服现有技术中存在的技术难题，本发明提供一种操作简单、应用广泛的表面多孔的核壳固定相的制备方法及对上述表面多孔型核壳结构硅胶微球进行改性的方法，首先将在硅胶微球表面堆积h2sif6水解的纳米氧化硅颗粒组成核壳型材料，再在该核壳材料表面进行功能化修饰，可以得到多种不同的色谱固定相。

本发明所提供的技术方案具体如下：

一种表面多孔型核壳结构硅胶微球，具有核壳结构，以粒径为2～5μm的球形硅胶为核，以球形硅胶表面堆积的硅胶纳米颗粒所形成的多孔壳状结构为壳，核与壳紧密结合，壳的厚度为100-700nm，孔径范围为15-120nm。

一种表面多孔型核壳结构硅胶微球的制备方法，包括以下步骤：将粒径为2～5μm的球形硅胶加入10体积份35wt％的h2sif6水溶液中，搅拌2～16h，其中，球形硅胶和h2sif6水溶液的用量比为1g：1ml；然后依次加入5体积份水和6体积份0.1mol·l^-1h3bo3水溶液，混合均匀；先将混合溶液在真空环境中静置1h，再在40℃的恒温摇床中振荡12～24h，然后将反应后的混合溶液用沙芯漏斗过滤，过滤出的固体在120℃下烘干，再将烘干产物置于马弗炉中，以140℃/min的速率升温至200℃，保持2h，得到表面多孔型核壳结构硅胶微球，即sio2＠sio2。

一种对上述表面多孔型核壳结构硅胶微球进行改性的方法，包括以下步骤：将表面多孔型核壳结构硅胶微球置于反应釜中，加入8体积份硅烷偶联剂和200体积份无水甲苯，在130℃下反应12h，冷却至室温后进行抽滤，然后依次用甲苯﹑丙酮、甲醇洗涤，45℃烘干，即得到表面修饰硅烷偶联剂的表面多孔型核壳结构硅胶微球。

所述的硅烷偶联剂为十八烷基三甲氧基硅烷或氨基丙基三甲氧基硅烷等硅烷偶联剂。

一种表面修饰硅烷偶联剂的表面多孔型核壳结构硅胶微球，由上述方法制备得到。

上述表面修饰硅烷偶联剂的表面多孔型核壳结构硅胶微球用于蛋白质的分离或多肽的分离。

上述表面修饰硅烷偶联剂的表面多孔型核壳结构硅胶微球作为色谱固定相的应用。

本发明具有以下优点和有益效果：

1.本发明制备方法简单，制备时间短，方法可控(可以制备出不同孔径不同厚度的多孔外壳)，重现性好。

2.本发明制备的核壳型硅胶应用性能好，可用于蛋白质、多肽等生物大分子化合物的分离，以及多种物质的快速色谱分离。

附图说明

图1是不同类型的核壳结构的示意图；其中，图1(a)表示核是一个单独的球的核壳结构，图1(b)表示核是几个小球的合体的核壳结构；图1(c)表示含有一个中空的外壳和中间一个小球的蛋黄-蛋壳核壳结构；图1(d)和图1(e)表示一些更小的球吸附到一个大核表面的核壳结构，图1(f)表示核和壳均由一群小核聚集合成的核壳结构，图1(g)表示将一些更小的小球嵌入到壳里面的复杂核壳结构，图1(h)表示中空的核和连续的壳的核壳结构，图1(i)表示具有多层壳的核壳结构。

图2是粒径为5μm球形硅胶和在40℃的恒温摇床中振荡24h所制备的壳厚度为0.48μm的sio2＠sio2的扫描电镜(sem)图；其中，图2(a)是粒径为5μm球形硅胶在放大1万倍的sem图；图2(b)是粒径为5μm球形硅胶放大5万倍的sem图；图2(c)是壳厚度为0.48μm的sio2＠sio2放大1万倍的sem图；图2(d)是壳厚度为0.48μm的sio2＠sio2放大5万倍的sem图。

图3是粒径为5μm球形硅胶和所制备的壳厚度为0.48μm的sio2＠sio2的透射电镜(tem)谱图；其中，图3(a)是粒径为5μm球形硅胶放大5万倍的tem图；图3(b)是壳厚度为0.48μm的sio2＠sio2放大5万倍的tem图。

图4为十八烷基键合sio2＠sio2分离5种蛋白质混合物的色谱分离图。

图5为十八烷基键合sio2＠sio2分离胰蛋白酶酶解的牛血清蛋白(bsa)的酶解物色谱分离图。

具体实施方式

以下实施例为了使本领域普通技术人员更清楚地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。以下百分比若无特殊说明，均表示体积百分比。

实施例1

将10g粒径为5μm的球形硅胶加入到10ml35wt％h2sif6水溶液中，搅拌2h；然后依次加入5ml水和6ml0.1mol·l^-1h3bo3溶液，混合均匀；先将混合溶液在真空环境中静置1h，再在40℃的摇床中振荡24h，然后将反应后的混合溶液用沙芯漏斗过滤，过滤出的固体在120℃下烘干，再将烘干产物置于马弗炉中，以140℃/min的速率升至200℃，并保持2h，即得到表面多孔型核壳结构硅胶微球，即sio2＠sio2；

然后将制备的表面多孔型核壳硅胶置于反应釜中，再加入8ml十八烷基三甲氧基硅烷和20ml无水甲苯，在130℃温度下反应12h，冷却，抽滤，抽滤出的固体依次用甲苯﹑丙酮、甲醇洗涤，45℃烘干备用，即得到十八烷基键合sio2＠sio2。

实施例2

将10g粒径为5μm的球形硅胶加入到10ml35wt％h2sif6水溶液中，搅拌16h；然后依次加入5ml水和6ml0.1mol·l^-1h3bo3溶液，混合均匀；先将混合溶液在真空环境中静置1h，再在40℃的摇床中振荡12h，然后将反应后的混合溶液用沙芯漏斗过滤，过滤出的固体在120℃下烘干，再将烘干产物置于马弗炉中，以140℃/min的速率升至200℃，并保持2h，即得到表面多孔型核壳结构硅胶微球，即sio2＠sio2；

然后将制备的表面多孔型核壳硅胶置于反应釜中，再加入8ml氨基丙基三甲氧基硅烷和20ml无水甲苯，在130℃温度下反应12h，冷却，抽滤，抽滤出的固体依次用甲苯﹑丙酮、甲醇洗涤，45℃烘干备用，即得到氨基键合sio2＠sio2。

实施例3

将十八烷基键合sio2＠sio2装填于50mm×4.6mm(i.d.)的液相色谱柱中，然后将其用于5种标准多肽样品混合物(crgrgrgr-594.73kda,spvlaedpsegee-1269.21kda,cfrgl-594.73,cfrglrgfrg-1381.61,angitotensinⅱ-1046.18)的色谱分离，得到了很好的分离效果。

色谱条件：溶剂a为0.1％tfa水溶液，溶剂b为乙腈/0.1％tfa。流动相梯度程序为(t表示时间(min)，例如：t20表示进样后20min时)：t0，20％b；t20，90％b；流速为0.2ml/min；样品进样量为20μl；检测波长：215nm；柱温：50℃。

实施例4

将十八烷基键合sio2＠sio2装填于50mm×4.6mm(i.d.)的液相色谱柱中，然后将其用于5种标准蛋白质样品混合物的色谱分离，得到了很好的分离效果，结果如图3所示。

色谱条件：溶剂a为0.1％tfa水溶液，溶剂b为乙腈/0.1％tfa。流动相梯度程序为(t表示时间(min))：t0，25％b；t15，70％b；流速为0.2ml/min，样品：5种蛋白质样品(rnasea、cytochromec、bsa、myoglobin和carbonicanhydrase)；样品进样量为20μl；检测波长：215nm。

实施例5

将十八烷基键合sio2＠sio2装填于150mm×2.1mm(i.d.)的液相色谱柱中，然后将其用于胰蛋白酶酶解的牛血清蛋白(bsa)的酶解物色谱分离，得到了很好的分离效果，结果如图4所示。

液相色谱条件：溶剂a为0.1％tfa水溶液，溶剂b为乙腈/0.1％tfa。流动相梯度程序为(t表示时间(min))：t0，10％b；t90，90％b；t120，10％b。流速为0.2ml/min，样品：3pmolbsa酶解物；样品进样量为20μl。

质谱条件：质谱仪为德国布鲁克公司的microtof-q质谱仪；质谱扫描模式：全扫描模式；扫描范围m/z350-1500。

实施例6

将十八烷基键合sio2＠sio2装填于50mm×4.6mm(i.d.)的液相色谱柱中，然后将其用于菲的保留分析，发现菲的容量因子k的lgk与流动相中甲醇含量成正比，表明其在该色谱柱上的保留主要基于疏水作用，且其保留机理不同于蛋白质等大分子样品化合物的保留。

液相色谱条件：流动相分别为90％甲醇，80％甲醇，70％甲醇，60％甲醇和50％甲醇；流速为0.2ml/min；样品进样量为20μl；检测波长：254nm。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。