一种负压串联组合式贝类毒素固相萃取装置的制作方法

本实用新型属于食品安全检测的技术领域，具体涉及一种负压串联组合式贝类毒素固相萃取装置，主要用于贝类、鱼类、水体中贝类毒素快速的净化与富集。

背景技术：

贝类毒素的形成与海洋中有毒藻类赤潮密切相关，属于海洋天然有机物，主要包括腹泻性贝类毒素、麻痹性贝类毒素、神经性贝类毒素、记忆缺失性贝类毒素等，贝类毒素作用于人类消化系统、神经系统或心血管系统，引起中毒，威胁人类健康，中国、欧盟和美国等相继出台了法律法规，提出了贝类毒素最大检测限量，其中腹泻性贝类毒素中大田软海绵酸等价物≤160μg/kg，欧盟对市场上流通的活鲜贝类及贝类产品要求麻痹性贝毒的整体数量上含有的海洋生物毒素不得超过80μg/100g石房毒素等价物，神经性贝类毒素最大允许限量为20个mu/100g，欧盟对记忆缺失性贝类毒素的安全标准为20mg/kg贝肉组织。

目前，主要采用lc-ms/ms进行相关的检测与研究，lc-ms/ms检测的前处理采用固相萃取柱完成，腹泻性贝类毒素的样本净化采用spesilics固相萃取小柱，麻痹性贝类毒素样本净化采用oasishlb固相萃取小柱或poly-serymax混合性阴离子固相萃取小柱，神经性贝类毒素和记忆缺失性贝类毒素采用阳离子spe柱。但是这些净化技术通常需要多个净化步骤，缺乏选择性，不但费时繁琐、容易污染、损失样本且会引起严重的本底干扰，降低结果的可靠性。

样品前处理是检测技术的核心，因此建立高效的样本净化技术已成为痕量分析的主要问题。免疫亲和层析(iac)提供了一个有效的方法，从液体材料中进行选择净化、化合物浓缩、分类，然后从固相支持物中提取纯化样本，iac是一种利用抗原抗体特异性可逆结合特性的spe技术，根据抗原抗体的高选择性，从复杂的待测样品中提取目标化合物。

免疫亲和柱制备是抗体与凝胶共价结合形成填料，填料装入亲和柱中，偶联的抗体可以为一种多或多种，凝胶可以为溴化氢活化的凝胶或蛋白a与蛋白g预交联的凝胶，而在实际生产过程中，由于检测目标物对柱容量的要求不同，进而对偶联抗体的数量要求亦不同，多种抗体同时交联一种凝胶增加了生产工艺的难度，复合型亲和柱在实际应用中并不广泛。贝类毒素的限量相对于真菌毒素限量要求宽泛，需要亲和柱的柱容量较大，相应的偶联抗体数量要多，为了避免复合型亲和柱实用过程中某些检测目标物净化、富集效果差的问题，采用亲和柱串联方式可以较好的解决这以问题，串联亲和柱可以用于单独使用或组合使用，操作方便，但使用的前提是需要摸索出一种同步提取贝类毒素的方法，将腹泻性贝类毒素、麻痹性贝类毒素、神经性贝类毒素和记忆缺失性贝类毒素各个组分同时提取出来。

技术实现要素：

本实用新型的目的在于针对现有产品的不足，提供了一种用于贝类毒素检测的负压串联贝类毒素固相萃取装置，所述负压串联贝类毒素固相萃取采用四种的贝类毒素免疫亲和柱串联，以保证高效的净化、富集效果，同时增加了负压气囊提高缩短了操作时间、使用方便。

为实现上述实用新型目的，本实用新型采用下述技术方案予以实现。

一种负压串联组合式贝类毒素固相萃取装置，其包括进液漏斗1、固相萃取串联柱2、收液瓶3和气囊装置4；进液漏斗1与固相萃取串联柱2的一端相连接，固相萃取串联柱2的另一端与收液瓶3相连接，收液瓶3与气囊装置4连接。

所述的固相萃取串联柱2由多个固相萃取柱5串联构成，每个固相萃取柱5包括柱管6、填料7、上筛板8、下筛板9、上帽10和下帽11；其中上筛板8和下筛板9设置于固相萃取柱5的柱管6的内部下方，上筛板8位于下筛板9的上方，上筛板8和下筛板9之间填充有填料7，填料7为贝类毒素抗体凝胶偶联物。

所述的柱管6包括相互连通的圆柱体形的柱身、进液口12和出液口13，进液口12设置有可拆卸连接有上帽10，出液口13设置有可拆卸连接的下帽11；所述的上帽10的帽顶中心具有圆柱体的连接管24，连接管24底部为穿刺膜25，穿刺膜25具未切穿十字刀口；一个固相萃取柱5的柱管6的出液口13和与其相邻的另一个固相萃取柱5的上帽10的连接管24紧密贴合，出液口13刺破位于下方的固相萃取柱5的上帽10的穿刺膜25的十字刀口形成流通管道，以使多个固相萃取柱5串联。

所述的进液漏斗1包括加液口14和流出口15，加液口14用于加入试验溶液或与自动加液系统连接；流出口15与位于固相萃取串联柱2最上方的固相萃取柱5的上帽10的连接管24紧密贴合，以使进液漏斗1与串联固相萃取柱2连接。

所述的收液瓶3包括入液口16、排气口17和瓶体18，入液口16开设于瓶体18的上方，排气口17开设于瓶体18的侧壁上；入液口16与位于串联固相萃取柱2最下方的固相萃取柱5的出液口13紧密连接，排气口17通过导管20与气囊装置4连接，瓶体18用于收集溶液。

所述的气囊装置4包括气囊19，气囊19一端设置有吸气口，该吸气口通过导管20与收液瓶3的排气口17相连接，导管20上设置有第一阀门22，用于控制气体进出；气囊19的另一端设置有进出气口21，进出气口21设置有第二阀门23，用于控制气体进出气囊19，进出气口21用于与负压装置连接进行自动化、高通量控制。

进一步地，所述的进液漏斗1的流出口15外径为3-6mm，内径为2-5mm；所述的柱管6的柱身的高度为20-50mm，外径为8-12mm，内径为7-11mm；所述的上帽10的圆柱体的连接管24的高度为10-18mm，内径为2-5mm，外径为3-6mm；所述的穿刺膜25内径为2-5mm，厚度为0.8-1.2mm，未切穿十字刀口厚度为0.3-0.5mm；所述的下帽11的内径为2-5mm；所述的收液瓶3入液口16的内径为2-5mm；所述的填料7的体积为30-300μl，上筛板8直径为7-11mm，下筛板9直径为7-11mm。

进一步地，固相萃取串联柱2包括四个相互串联的固相萃取柱5。

每个固相萃取柱5选自腹泻性贝类毒素萃取柱、麻痹性贝类毒素萃取柱、神经性贝类毒素萃取柱、记忆缺失性贝类毒素萃取柱中的任意一种；贝类毒素抗体选自腹泻性贝类毒素抗体、麻痹性贝类毒素抗体、神经性贝类毒素抗体和记忆缺失性贝类毒素抗体。

本实用新型的效果和益处是：

1、本实用新型采用的亲和纯化成为一种新型的凝胶材料，可用于对腹泻性贝类毒素、麻痹性贝类毒素、神经性贝类毒素和记忆缺失性贝类毒素的净化与富集；

2、本实用新型将固相萃取柱串联，可同时对多种贝类毒素样本进行净化和富集，既可组合使用，也可分离单独使用。

3、本实用新型将固相萃取柱上帽改进，增加了刺穿膜，一方面用于固相萃取柱内保护液体的泄漏，另一方面刺穿膜被出液刺穿形成流通管道，可作为转换头连接不同种类的固相萃取柱，形成固相萃取串联柱，方便试验人员的操作，减少了固相萃取柱生产环节。

4、采用气囊负压方法，加快了试验溶液流穿固相萃取柱的速度，相比与泵流操作架操作易于操作，与重力法相比节省了操作时间。

5、将多种贝类毒素提取方法进行了改进，一种提取溶液即可提取出多种贝类毒素，解决了贝类毒素分别提取的耗时、耗力的难题。

由于固相萃取柱串联起来，仅通过重力法无法让试验溶液快速通过串联亲和柱，需要对试验溶液增压处理，以减少操作时间。

附图说明

图1为本实用新型实施例中提供的负压串联组合式贝类毒素固相萃取装置的结构示意图。

图2为本实用新型实施例中提供的负压串联组合式贝类毒素固相萃取装置的爆炸图。

图3为本实用新型实施例中提供的负压串联组合式贝类毒素固相萃取装置的固相萃取柱的结构示意图。

图4为本实用新型实施例中提供的负压串联组合式贝类毒素固相萃取装置的固相萃取柱的上帽结构示意图。

图5为本实用新型实施例中提供的负压串联组合式贝类毒素固相萃取装置的固相萃取柱的上帽俯视结构示意图。

图中：1进液漏斗；2固相萃取串联柱；3收液瓶；4气囊装置；5固相萃取柱；6柱管；7填料；8上筛板；9下筛板；10上帽；11下帽；12进液口；13出液口；14加液口；15流出口；16入液口；17排气口；18瓶体；19气囊；20导管；21进出气口；22第一阀门；23第二阀门；24连接管；25穿刺膜。

具体实施方式

以下结合附图和技术方案，进一步说明本实用新型的具体实施方式。

应当了解，所附附图并非按比例地绘制，而仅是为了说明本实用新型的基本原理的各种特征的适当简化的画法。本文所公开的本实用新型的具体设计特征包括例如具体尺寸、方向、位置和外形将部分地由具体所要应用和使用的环境来确定。

在所附多个附图中，同样的或等同的部件(元素)以相同的附图标记标引。

在本实用新型的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本实用新型和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本实用新型的限制。

以下提供了本实用新型实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本实用新型，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本实用新型。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

图1为本实用新型实施例中提供的负压串联组合式贝类毒素固相萃取装置的结构示意图。图2为本实用新型实施例中提供的负压串联组合式贝类毒素固相萃取装置的爆炸图。参见图1和图2，在本实施例中，一种负压串联组合式贝类毒素固相萃取装置，包括进液漏斗1、固相萃取串联柱2、收液瓶3和气囊装置4；进液漏斗1与固相萃取串联柱2的一端相连接，固相萃取串联柱2的另一端与收液瓶3相连接，收液瓶3与气囊装置4连接。

固相萃取串联柱2由多个固相萃取柱5串联构成，如图3所示，每个固相萃取柱5包括柱管6、填料7、上筛板8、下筛板9、上帽10和下帽11；其中上筛板8和下筛板9设置于固相萃取柱5的柱管6的内部下方，上筛板8位于下筛板9的上方，上筛板8和下筛板9之间填充有填料7，填料7为贝类毒素抗体凝胶偶联物。

在本实施例中，每个固相萃取柱5选自腹泻性贝类毒素萃取柱、麻痹性贝类毒素萃取柱、神经性贝类毒素萃取柱、记忆缺失性贝类毒素萃取柱中的任意一种。相应地，在本实施例中，贝类毒素抗体选自腹泻性贝类毒素抗体、麻痹性贝类毒素抗体、神经性贝类毒素抗体和记忆缺失性贝类毒素抗体。上述的贝类毒素抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体和基因工程纳米抗体。凝胶选自溴化氢的琼脂糖凝胶、蛋白a交联的琼脂糖凝胶、蛋白g交联的琼脂糖凝。

在本实施例中，柱管6包括相互连通的圆柱体形的柱身、进液口12和出液口13，进液口12设置有可拆卸连接有上帽10，出液口13设置有可拆卸连接的下帽11。图4和图5分别为本实用新型实施例中提供的负压串联组合式贝类毒素固相萃取装置的固相萃取柱的上帽结构示意图和俯视结构示意图。参见图4和图5，在本实施例中，上帽10的帽顶中心具有圆柱体的连接管24，连接管24底部为穿刺膜25，穿刺膜25具未切穿十字刀口。一个固相萃取柱5的柱管6的出液口13和与其相邻的另一个固相萃取柱5的上帽10的连接管24紧密贴合，出液口13刺破位于下方的固相萃取柱5的上帽10的穿刺膜25的十字刀口形成流通管道，以使多个固相萃取柱5串联。具体地，在本实施例中，如图1所示，固相萃取串联柱2包括四个以上述方式相互串联的固相萃取柱5。

如图1和图2所示，进液漏斗1包括加液口14和流出口15，加液口14用于加入试验溶液或与自动加液系统连接；流出口15与位于固相萃取串联柱2最上方的固相萃取柱5的上帽10的连接管24紧密贴合，以使进液漏斗1与串联固相萃取柱2连接。

如图1和图2所示，收液瓶3包括入液口16、排气口17和瓶体18，入液口16开设于瓶体18的上方，排气口17开设于瓶体18的侧壁上。入液口16与位于串联固相萃取柱2最下方的固相萃取柱5的出液口13紧密连接，排气口17通过导管20与气囊装置4连接，瓶体18用于收集溶液。

气囊装置4包括气囊19，气囊19一端设置有吸气口，该吸气口通过导管20与收液瓶3的排气口17相连接，导管20上设置有第一阀门22，用于控制气体进出；气囊19的另一端设置有进出气口21，进出气口21设置有第二阀门23，用于控制气体进出气囊19，进出气口21用于与负压装置连接进行自动化、高通量控制。

在本实施例中，所述的进液漏斗1的流出口15外径为3-6mm，内径为2-5mm；所述的柱管6的柱身的高度为20-50mm，外径为8-12mm，内径为7-11mm；所述的上帽10的圆柱体的连接管24的高度为10-18mm，内径为2-5mm，外径为3-6mm；所述的穿刺膜25内径为2-5mm，厚度为0.8-1.2mm，未切穿十字刀口厚度为0.3-0.5mm；所述的下帽11的内径为2-5mm；所述的收液瓶3入液口16的内径为2-5mm；所述的填料7的体积为30-300μl，上筛板8直径为7-11mm，下筛板9直径为7-11mm。

负压串联组合式贝类毒素固相萃取装置的使用：

一、贝类毒素固相萃取柱的制备

1、腹泻性贝类毒素抗体、神经性贝类毒素抗体、记忆缺失性贝类毒素抗体、麻痹性贝类毒素抗体抗体分别溶于50ml，0.2mnahco3，ph8.3，含0.5mnacl溶液中，分别加入5gcnbr活化的sepharose4b(购自ge公司，货号17-0430-02)，4℃混匀8h；

2、将上述步骤(1)所制得的悬浮液2000g离心，加入100ml，0.1mtris-hcl缓冲液，ph8.0，室温混匀2h；

3、0.1m醋酸/醋酸钠，ph4.0内含0.5mnacl的缓冲液洗涤，接着再用0.1mtris-hcl，ph8.0内含0.5mnacl的缓冲液洗涤步骤(2)的悬浮液，循环3次，填料保存于0.01％nan3-pbs；

4、取步骤(3)所制得的300μl固相填料7组装固相萃取串联柱2。

二、负压串联组合式贝类毒素固相萃取装置连接步骤

1、卸取各固相萃取柱5的下帽11，相邻的一固相萃取柱5的出液口13插入另一固相萃取柱5的上帽10，刺破穿刺膜25，形成固相萃取串联柱2，可所需测试目标物的选取所用的固相萃取柱组合或单独使用；

2、进液漏斗1的流出口15插入位于最上方的固相萃取柱5的上帽10，刺破穿刺膜25，固定连接，形成流通管道；

3、将收集瓶3的入液口16与位于串联固相萃取柱2的最下方的固相萃取柱5的出液口13连接；

4、将与气囊19连接的导管20与收集瓶3的排气口17连接。

三、负压串联组合式贝类毒素固相萃取装置操作过程

1、贝类样本的准备：称取5g贝肉，研磨，加入用40ml甲醇/乙腈/水/乙酸(25/55/15/5)，高速均质5min，室温振荡提取30min，取8ml上清液，用24mlpbs稀释，取16ml提取液(相当于1g样本)。

2、净化与富集

2.1吸气：气囊装置4的第一阀门22开启后，关闭第二阀门23，挤压气囊19，排出气囊19内的气体，关闭第一阀门22，将导管20与收液瓶3的排气口17相连接；

2.2上样：取16ml贝类毒素样本提取液加入到加液口14中，打开第一阀门22，贝类毒素样本提取液因负压进入固相萃取串联柱2，流速为1滴/秒，进而流入瓶体18；

2.3洗涤：待全部贝类毒素提取液流穿固相萃取串联柱2，30ml洗涤液经加液口加入固相萃取串联柱2，流速为1滴/秒，负压较小时，重复步骤2.1吸气步骤；

2.4吹干：重复步骤2.1吸气步骤，排干凝胶内液体；

2.4洗脱：向进液口内加入6ml甲醇/乙酸(98/2，v/v)混合物重力法流出、收集，将收集的洗脱液在50℃下氮气吹干。残留物用0.5ml乙腈/0.1mm醋酸铵缓冲液(30/70，v/v)溶解，进行hplc或lc-ms/ms测试。

以上示例性实施方式所呈现的描述仅用以说明本实用新型的技术方案，并不想要成为毫无遗漏的，也不想要把本实用新型限制为所描述的精确形式。显然，本领域的普通技术人员根据上述教导做出很多改变和变化都是可能的。选择示例性实施方式并进行描述是为了解释本实用新型的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的其它技术人员便于理解、实现并利用本实用新型的各种示例性实施方式及其各种选择形式和修改形式。本实用新型的保护范围意在由所附权利要求书及其等效形式所限定。