一种用于植物代谢组分析的样品前处理方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种高效的新鲜植物组织样品的代谢组分析快速处理方法，具体地 说，是对茶树等木本植物新鲜组织(含叶片、嫩茎、根）进行代谢组学分析测试的快速、无损、 无污染的样品前处理技术。该方法处理样品还可用于品质成分分析、RNA提取、蛋白质组学 分析等多种检测。
【背景技术】
[0002] 代谢组学技术逐渐在品种分析、代谢机理的研究方面体现强大的优势。但是代谢 组学方法对样品前处理技术要求很高，代谢物对环境变化敏感，处理条件要求较高。由于很 多代谢反应可W在1sW内发生，所W样品前处理过程不仅要求绝对低溫处理，而且所有转 移步骤和操作过程也必须不产生溫度变化。
[0003] 很多组学研究文献表明，植物代谢组学分析中的主要误差来至样品准备和前处 理，并提出了植物样品前处理必须遵守的基本要求，即可重复性、无损、无污染。然而，现有 用于拟南芥、水稻研究的代谢组学样品前处理方法在茶叶等木本植物样品中的运用具有较 大的局限性，主要表现在： 茶树等木本植物，组织体积较大、取样的均一性很容易对结果造成误差，因此传统方法 对实验人员的技术熟练程度要求较高。
[0004] 茶树等木本植物，组织坚硬，对与研磨和提取有更高的要求，传统研磨方法直接在 敞开的大量液氮中操作，不仅操作危险性高，而且研磨效率极低。
[0005] 茶树等木本植物富含多种易受环境影响而氧化的特殊次级代谢成分，特别是茶树 中富含抗氧化活性极强的多酪类物质，对环境变化巧日空气暴露，溫度）极为敏感，容易发生 氧化反应。
[0006] 当前主要采用研鉢研磨样品，并添加液氮，需要来回转移，清洗研鉢等过程，该方 法不仅对样品造成大量的浪费，并且很容易造成污染。
[0007] 总之，当前所采用的方法很容易使样品被污染，可重复性差，且工作效率低，其样 品前处理过程费时、费力，对操作人员的熟练程度及工作经验要求较高，与代谢组学的高通 量技术要求相违背，所采用的处理方法时间较长，对样品的影响较大。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种快速高效的植物组织样品的代谢组分析快速处理技术， W解决现有技术存在的弊端，克服了现有技术中由于样品前处理中污染、混样不均等因素 造成的组学分析重复性低等缺陷。
[0009] 实现本发明的所采用的技术方案如下： 一种用于植物代谢组分析的样品前处理方法，其特征在于主要包括如下步骤： 1)取样、灭活：对植物各组织部位分开取样立即放入离屯、管中冷冻灭活，离屯、管事先竖 直放置在乘有液氮的盛装容器中；所述离屯、管由离屯、管主体和离屯、管盖构成，离屯、管主体 的中上部设有一个用于液氮进出的离屯、管孔，离屯、管盖上设有供液氮气化流出的盖孔；所 述盛装容器中液氮的液面高度低于离屯、管主体的管口； 2) 样品均质与研磨：将研磨棒置于液氮中预冷15min后放入离屯、管中，盖上离屯、管 盖，带手套握住离屯、管盖置于縱满振荡器上高速震荡进行样品均质和研磨30s; 3) 离屯、过滤：加入置于-20度冰箱中预冷1小时W上的提取溶剂，离屯、，去除蛋白质， 取上清液过0.22μm有机滤膜即可上机器分析。
[0010] 所述的一种用于植物代谢组分析的样品前处理方法，其特征在于：在样品均质与 研磨后还包括样品精细研磨：在低于o°c条件下迅速称取研磨好的样品粉末0.Ig置于预冷 的2mL离屯、管中，加入1mL置于-20度冰箱中预冷1小时W上的提取溶剂，用超声波辅助 提取10min或加入2粒直径5mm的不诱钢钢珠于离屯、管中，用球磨仪进一步精细研磨。
[0011] 所述的一种用于植物代谢组分析的样品前处理方法，其特征在于：所述离屯、管为 50ml,离屯、管孔的直径为1. 5mm，盖孔直径2-3mm。
[0012] 所述的一种用于植物代谢组分析的样品前处理方法在木本植物新鲜组织代谢组 分析的样品前处理上的应用。
[0013] 所述的一种用于植物代谢组分析的样品前处理方法在茶树新鲜组织代谢组分析 的样品前处理上的应用。
[0014] 本发明通过对新鲜植物各组织部位分开取样，采用液氮迅速冷冻灭活，在液氮环 境中采用高速震荡进行样品均质和研磨(部分样品可采用球磨仪和钢珠进一步精细研磨)， 在得到混合样品后采用超声波辅助提取，最后高速离屯、去除蛋白质，与现有相比具有如下 有益效果：（1)适用于茶叶等坚硬的木本植物样品各组织部位(含叶片、新梢、嫩茎、根等部 位）均质和研磨；（2)能够处理体积较大的茶树组织样品，适用样品质量范围为0. 1g至35 g，不需分批次，保证均质效果，提高实验可重复性；（3)适合微量样品处理，减少样品在不 同容器转移过程中的浪费；（4)严格低溫环境，样品没有融化解冻，样品溫度变化极小，保 证样品最原始状态；（5)避免过多容器之间的转移造成的污染和转移的浪费。样品存储， 均质研磨均在同一容器中进行（50mL离屯、管)，不用来回转移，减少污染；（6)所用样品容 器为独立容器，比常规方法中使用研鉢来回转移效率更高、处理样品时间更短；（7)采用两 步研磨法(震荡粗磨加精细球磨）可W很好的处理根等样品，同时也提高了球磨取样的均一 性；避免操作过程中液氮的直接接触，提高了操作的安全性。
[0015] 综上，本发明克服了传统方法溫度变化、容易被污染、样品浪费多、可重复性较差、 混样不均、工作效率较低、操作危险系数高、对操作人员的熟练程度及工作经验要求高等众 多不足之处和技术难点。该发明能够很好的运用于茶树等木本植物样品坚硬组织取样、均 质、研磨、提取的前处理方法，是一种对茶树组织(含叶片、嫩茎、根）进行代谢组学分析测试 的快速、无损、无污染的样品前处理技术，该方法处理样品还可用于品质成分分析、RNA提 取、蛋白质组学分析等。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明中离屯、管的结构示意图； 图2为方法操作流程图；(a)取样、灭活；化）研磨棒预冷；（C)加研磨棒和离屯、管盖； (d)样品均质与震荡研磨；（e)研磨完成； 图3为专利方法和传统方法前处理样品代谢轮廓(负离子模式）； 图4为专利方法和传统方法前处理样品代谢物聚类及热图分析结果； 图5为专利方法和传统方法前处理样品代谢物主成分分析结果； 图中：1-离屯、管主体；2-离屯、管盖；3-管孔；4-盖孔；5研磨棒；6-盛装容器。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合附图对本发明作进一步具体说明。W下实施例中所述的50ml离屯、管由 离屯、管主体1和离屯、管盖2构成，离屯、管主体1的管壁中部设有孔径为1. 5mm管孔3,用 于液氮自动浸入和流出；管盖2上设有1-2个孔径为2-3mm盖孔4,用于残留液氮气化排 出。研磨棒为5cmX2cm陶瓷研磨棒；振荡器为100W，300r/min振荡器，设置为化11 模式；提取试剂为79%甲醇溶液。
[0018] 实施例1茶树新梢及叶片样品前处理 W龙井43茶树两年生杆插苗为材料，对照组茶树样品采用15Γ恒溫培养，实验组样品 采用25°C恒溫培养。实验设6个生物学重复，独立取样检测。培养处理1周后取新梢叶片 用于代谢组学分析。
[0019] 专利方法为：叶片样品立即放入50ml离屯、管于液氮中灭活(离屯、管事先竖直放 置在乘有液氮的盛装容器6中，盛装容器6中液氮的液面高度低于离屯、管主体1的管口，下 同）。每管样品约30g(研磨后为离屯、管体积的1/3)，将5cm研磨棒置于液氮中预冷15 min后放入离屯、管中，盖上离屯、管盖