专利名称：一种检测辐射肾性骨矿物盐损伤方法
技术领域：
本发明属辐射生物学与骨生物学领域，具体涉及一种检测辐射肾性骨矿物盐损伤方法本发明利用137Csγ射线照射肾区致肾脏损伤，通过检测骨矿盐量与质的改变，建立辐射肾性骨病检测方法。本发明通过下述步骤建立辐射肾性骨矿物盐损伤检测方法。
1.肾脏照射，取实验动物SD大鼠麻醉状态下侧向暴露其两侧肾脏，并将动物侧卧位固定于模具上，用厚度4.2cm，射线衰减98％的铅板遮挡肾脏以外的组织，达到精确定位并避免肾脏以外组织受到照射。照射计量为10-50Gy。
2.肾损伤检测血尿素氮、肌酐动态监测每2个星期尾静脉取血，自动生化分析仪测定浓度。
尿量、尿蛋白、尿肌酐清除率、尿β2微球蛋白动态监测每2个星期收集24小时尿液，测定尿量，自动生化分析仪测定尿蛋白和尿肌酐浓度(根据24h尿量，血肌酐，尿肌酐的值计算肌酐清除率)，放射免疫法测定β2微球蛋白的浓度。
维生素D羟化检测血清中1，25(OH)2D3水平可间接反反映肾脏1α羟化酶活性。每月尾静脉采集血清0.6ml，放射免疫法测定25(OH)D3和1，25(OH)2D3，以反映肾1α羟化酶活性。
肾脏病理观察光学显微镜观察照射6周后处死动物，取左侧肾脏入Susa固定液固定12小时后用95％酒精洗涤，常规石蜡包埋，切片，HE染色后光学显微镜观察。
电子显微镜观察动物处死后立即取3块1mm3大小的右侧肾皮质入2.5％戊二醛固定后作电镜切片观察。
肾脏羟化酶表达水平检测(1)制作肾脏冰冻切片，免疫组织化学法观察肾近曲小管1α羟化酶表达水平。(2)肾匀浆检测法肾脏匀浆，加入定量25(OH)D3，检测1，25(OH)2D3产物水平。
3.骨矿盐损伤检测骨密度测定取第四腰椎，右侧股骨，剔除软组织，蒸馏水冲洗骨髓腔，120℃干燥1小时，固体密度仪测定骨密度；骨形态计量学测定处死前14d，4d分别腹腔注射盐酸四环素30mg/kg体重。取左侧股骨上段，剔除软组织，PBS冲洗骨髓腔。Million`s液固定72h(4℃)，每24h换液一次。乙醇梯度脱水，甲基丙烯酸甲酯渗透包埋。硬化后不脱钙切片机切5μm，15μm两种切片。厚片用中性树脂封片后在荧光显微镜下观察，薄片用乙二醇乙醚乙酸酯脱塑，2％甲苯胺兰染色后作形态计量学分析，测定骨小梁体积、平均骨小梁厚度、平均骨小梁间距、结点末端比、骨形成表面、骨吸收表面、矿化沉积率。
本发明以肾区辐照模具固定暴露肾脏，应用137Csγ射线一次照射双侧肾脏各10-50Gy，引起肾脏放射损伤，表现在尿蛋白明显增加，尿β2微球蛋白增高，血清肌酐清除率降低1/3-1/2。由于肾1α羟化酶活性受抑，血清1，25(OH)2D3水平明显低下，下降近1/2。2月后发生骨矿盐结构的明显改变，表现为骨密度下降、骨小梁体积减少、骨小梁平均间距增宽、结点末端比下降等。本发明通过手术暴露双侧肾脏，并用铅板遮挡肾脏以外的组织，使肾脏照射定位准确，且最大限度地降低了肾脏周围组织的受照剂量。通过射线照射肾脏引起骨矿盐损伤方法的建立，为骨矿盐代谢的基础研究和有关防治药物研究提供了新的技术手段。
操作过程麻醉及肾脏暴露各组动物称重，腹腔注射11％乌来糖0.5ml/100g体重+盐酸氯胺酮0.2ml/100g体重。剔毛，常规消毒铺巾。大鼠右侧卧位，在腰大肌外侧0.5cm处自肋下缘向下作一长1cm的纵行切口。小心打开腹腔。用手在体表触及左侧肾脏，轻轻将其经切口推至体外。生理盐水纱布覆盖保护。然后动物左侧卧位，暴露右侧肾脏。
动物固定动物右侧卧于模具中，将头尾及四肢固定。使动物肾脏与铅板的孔吻合对准。
照射将固定好的B组动物(A组除本步与B组不同外，其余相同)放入辐照系统的辐照腔，打开辐射源，分别给予双肾各15Gyγ射线照射。
照射后处理将肾脏放回腹腔，分层缝合，关腹前腹腔注射青霉素抗感染。未苏醒的大鼠置于温暖处。苏醒后给予正常饮水、饮食、光照。
肾功能及骨代谢检测方法同上述技术方案。
实验结果表明A、B两组动物的尿量在照射后各时间段基本无显著变化。但随着时间的延长，A组动物的血肌酐清除率基本无变化，而B组动物的血肌酐清除率逐渐下降，说明肾脏的照射导致肾小球滤过功能的降低。与A组相比较，B组动物的尿β2微球蛋白/尿肌酐值明显升高，说明射线致肾小管功能一定程度的损伤。扫描电镜可见肾小球基底膜呈不规则改变，毛细血管腔明显扩大，细胞外间隙内可见游走炎症细胞并有大量原胶原沉积，肾小管细胞数减少，细胞线粒体明显肿胀，光密度明显降低。证实本发明方法采用15Gyγ射线局部照射大鼠双侧肾脏可导致肾小球、肾小管功能的进行性下降，以至慢性肾功能衰竭的发生。上述照射所至肾脏的损伤可以通过几个方面影响骨矿盐代谢，如Ca，P经尿液的过量丢失使血Ca，血P失平衡，近曲肾小管上皮细胞的破坏使合成活性维生素D所必需的1α羟化酶减少，继发性甲状旁腺激素(PTH)分泌增加可导致骨吸收的增强。骨密度及骨形态计量学结果证实了骨矿盐代谢的改变。与A组比较，B组动物的腰椎、股骨密度均有所下降，其中又以腰椎更为明显。照射动物的骨小梁体积减小，骨小梁平均间距增宽，结点末端比减小，骨形成表面减小，平均骨小梁间距、骨吸收表面增大，矿化沉积率下降。肾脏电镜观察见，B组肾小球基膜间隙纤维增生，近曲小管线粒体肿胀，电子密度降低，甚至有空泡样改变；A组无有纤维增生现象，近曲小管线粒体致密清晰，电子密度较高，无肿胀等改变。表1是实验动物尿蛋白变化结果。表2是血清肌酐清除率(％)。表3是实验结束时测得肾功能指标。表4是实验结束时血尿常规生化指标。表5是实验结束时血25(OH)D3、1，25(OH)2D3、PTH及尿PYD/肌酐结果。表6是腰椎骨密度及成分分析结果。表7是股骨骨密度及成分分析结果。表8是骨形态计量结果。表9是骨矿化沉积率结果。表10是羟化酶活性。表1组别 照射后2周 4周 6周正常组(A)0.895±0.123 1.017±0.189 0.823±0.038照射组(B)1.727±0.378**1.728±0.169**1.983±0.583*注照射后2、4、6周，与正常组比较，照射组*p＜0.05，**p＜0.01表2组别 第一周第二周A66.440±10.76 56.69±4.96B32.23±11.75**20.46±5.34**注与正常组比较，照射组*p＜0.2(无统计学差别)，**p＜0.01表3组别 血尿素氮 血肌酐 尿β-2微球蛋白(mmol/L) (mmol/L)(g/mL)A6.19±0.6548.19±2.12 0.28±0.07B10.91±1.15*70.31±7.18 0.36±0.08*单因素方差分析，*P＜0.05。(mean±s，n＝10)表4组别 血Ca 血P 血ALP尿Ca 尿P(mmol/L) (mmol/L) (U/L)(mmol/L) (mmol/L)A 2.87±0.021.87±0.15123.40±18.643.79±2.46 5.46±3.98B 2.79±0.071.71±0.13140.70±31.60*6.03±2.07*6.49±3.61*单因素方差分析，*P＜0.05。(mean±s，n＝10)表525(OH)D31，25(OH)2D3PTH PYD/肌酐组别(ng/mL)(pg/mL) (ng/dl) (nmol/mmol)A 9.76±1.19 52.79±18.2117.55±4.50 49.27±9.69B 10.04±2.5725.70±7.10*22.01±4.74*64.75±11.34*单因素方差分析，*P＜0.05。(mean±s，n＝10)表6组别 BMD(g/cm2) 干重(g)灰重(g)A 0.34±0.02 0.30±0.03 0.21±0.02B 0.30±0.03*0.27±0.02*0.19±0.01*单因素方差分析，*P＜0.05。(mean±s，n＝10)表7组别 BMD 干重灰重(g/cm3)(g) (g)A 1.24±0.03 0.79±0.07 0.52±0.03B 1.21±0.03*0.74±0.04*0.47±0.04*单因素方差分析，*P＜0.05(mean±s，n＝10)表8组别 骨小梁体积骨小梁平均厚度骨小梁平均间距(％) (μm) (μm)A 25.19±2.67 35.51±5.56 110.21±11.27B 21.79±1.84* 29.57±4.47* 128.48±24.60单因素方差分析，*P＜0.05。(mean±s，n＝10)表9组别 MAR(μm/d)A4.34±0.52B2.80±0.40*单因素方差分析，*P＜0.05。(mean±s，n＝10)表10组别 酶活性(Pg/200mg/20min)A 108.37±47.15B 65.57±5.32*单因素方差分析，*P＜0.05。(mean±s，n＝5)
权利要求
1.一种辐射肾性骨矿盐损伤检测方法，其特征在于利用射线照射致肾脏损伤后，检测骨矿盐量与质的改变，建立辐射肾性骨病检测方法。
2.按权利要求1所述的辐射肾性骨矿盐损伤检测方法，其特征在于按下述步骤进行，1)精确定位实验动物照射部位，进行137Csγ射线照射，计量为10-50Gy。2)肾损伤检测，包括血尿素氮，肌酐动态监测，尿量、尿蛋白、尿肌酐清除率、尿β2微球蛋白动态监测，维生素D羟化检测，和肾脏病理光学显微镜、电子显微镜观察以及肾脏羟化酶表达水平检测。3)骨矿盐损伤检测，包括骨密度测定和骨形态计量学测定
全文摘要
本发明属辐射生物学与骨生物学领域，具体涉及一种辐射肾性骨矿物盐损伤检测方法。本发明利用
文档编号G01N37/00GK1417583SQ02150739
公开日2003年5月14日 申请日期2002年11月27日 优先权日2002年11月27日
发明者王洪复, 高林峰, 朱飞鹏, 钱志林, 金慰芳 申请人:复旦大学