专利名称：一种快速检测甲状腺干扰物的方法－非洲爪蟾尾吸收试验的制作方法
技术领域：
本发明涉及甲状腺干扰物和体外培养方法，具体说是检测甲状腺干扰物的方法。
近年来发现环境中一些污染物能够影响甲状腺的结构和功能，干扰甲状腺系统的正常作用，从而导致生物体生长发育及行为的异常，这类污染物即所说的甲状腺干扰物。大量野外研究表明一些野生动物，象鸟类、鱼类甲状腺结构和功能的异常与环境中的甲状腺干扰物有关。实验室研究证明许多污染物，如多氯联苯(PCBs)、多溴联苯醚(PBDEs)、DDE、马拉硫磷、乙草胺等有甲状腺干扰活性。从理论上讲，这些甲状腺干扰物可通过以下环节引发干扰作用1.引起甲状腺结构的变化；2.干扰TH的分泌；3.影响TH的代谢和转运；4.干扰TH与TR的结合影响转录激活。目前的研究多集中在由前三种途径介导的甲状腺干扰上。已有的几种检测甲状腺干扰物的方法，如甲状腺结构的观察、TH水平的测定等，都是针对前三种途径介导的甲状腺干扰作用设计的，而无法检测出通过第4种途径实现干扰作用的物质。另外美国内分泌干扰物筛查和确证顾问委员会(EDSTAC)建议的一种蛙14天变态试验，也是通过对变态的影响来评价甲状腺干扰作用的。这种方法对那些通过第4种途径实现干扰作用的物质可能也是不敏感的。而最近有研究表明一些甲状腺干扰物正是通过干扰TH与TR的结合影响转录激活途径实现干扰作用。所以，建立一种针对这类甲状腺干扰物的检测方法是目前急需解决的问题。
发明内容
本发明提供一种体外检测甲状腺干扰物的方法，本方法专门针对通过干扰TH与TR的结合影响转录激活途径实现干扰甲状腺作用的干扰物。本方法用非洲爪蟾蝌蚪的尾作材料，用甲状腺素体外诱导其吸收，同时暴露测试物，并保持测试物的浓度，每天记录尾的长度，最后分析测试物暴露组尾吸收的情况与对照组的不同，以对测试物的甲状腺干扰作用进行评价。本方法的优势表现为1.试验材料易得。非洲爪蟾终生生活在水中，在实验室容易饲养；终年可以孵卵繁殖，而且每次产卵很多；2.尾可在体外培养，并能在T3的诱导下吸收，表现为长度缩短；3.本方法的可操作性强，终点指标尾的吸收率数据容易获取。4.本方法专门针对通过干扰TH与TR的结合影响转录激活途径实现干扰甲状腺作用的干扰物，特异性强。
具体实施例方式
性成熟的雌蛙、雄蛙隔离喂养，室温保持在22±2℃。每周喂两次猪肝换一次水。饲养用水为活性炭除氯的自来水。晚上雌蛙腹腔注射700IU HCG，雄蛙注射300 IUHCG，放入孵化缸。次日凌晨抱对产卵，产卵完毕移出亲蛙，静置孵化。室温保持在22±2℃，明暗光周期12小时12小时。第5天后开始喂虾卵，每天喂2次，每4天换一次水。选择处于53-55阶段的蝌蚪，要求大小整齐。在干净的除氯水中游泳两小时，然后转移至含0.1％磺胺的除氯水中，2小时后灭菌的蒸馏水冲洗，用手术刀齐身将尾切下置含1640培养液的6孔培养板中培养。1640培养液含1mM谷胺酰胺，1nM-1μM甲状腺素，2％碳酸氢钠，100μg/L链霉素，50μg/L青霉素，2μg/L两性霉素，PH值7.2，渗透压调整到两栖动物的渗透压。每孔含5ml培养液，培养2条尾，每个测试物浓度需12条尾。当下测得的尾长为原始尾长。然后将培养板放二氧化碳培养箱中23℃，5％CO2培养。每2天换一次培养液，每天测一次尾长。终点测试指标为每天尾长度占原始尾长的百分比，即尾的吸收率。最后用one-way ANOVA统计方法做差异显著性分析(P＜0.05)。如果通过统计分析显示，同一时间测试物组的尾吸收率明显高于或低于对照组，则表明测试物促进或抑制了尾的吸收，通过干扰TH与TR的结合影响转录激活途径干扰了甲状腺作用。
权利要求
1.一种快速检测甲状腺干扰物的方法—非洲爪蟾尾吸收试验。
2.权利要求1所指的方法所使用的材料为非洲爪蟾蝌蚪。
3.权利要求1所指的方法其终点测试指标为尾的吸收率。
4.权利要求1所指的方法其体外诱导尾吸收所用的甲状腺素浓度为1nM-1μM。
5.权利要求1所指的方法用于检测甲状腺干扰物及甲状腺干扰机制的研究。
全文摘要
本发明提供一种快速检测甲状腺干扰物的方法它以53－55阶段的非洲爪蟾蝌蚪的尾作试验材料，用甲状腺激素诱导其吸收缩短，同时予以测试物暴露处理，通过比较测试物暴露组的尾的缩短情况与对照组的不同，评价测试物的甲状腺干扰活性。此方法的优点是能够快速评价测试物的甲状腺系统干扰活性，并且专门针对通过干扰TH与TR的结合影响转录激活途径实现干扰甲状腺作用的干扰物，具有一定的敏感性。
文档编号G01N33/50GK1661369SQ20041000459
公开日2005年8月31日 申请日期2004年2月24日 优先权日2004年2月24日
发明者秦占芬, 周景明, 徐晓白 申请人:中国科学院生态环境研究中心