专利名称：一种高效液相色谱分析苯丙醇原料及其制剂的方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，确切地说它是一种高效液相色谱分析苯丙醇原料及其制剂的方法。
背景技术：
苯丙醇，又名利胆醇，收载于中国药典2000年版，为我国的基本用药，其胶丸剂属于OTC品种。苯丙醇于1927年由瓦勃(Warrb)和Cortese首先合成，在德国首次上市。我国于1977年开始生产。本品为油状液体，味辛甜，极易溶于甲醇，乙醇和氯仿，微溶于水。本品口服后主要分布在肠、肝、胆囊、肾等器官，在肝脏代谢，以代谢物的形式和部分原形药物从胆汁和尿液中排泄。本品为胆计分泌促进剂。服药后10分钟胆汁开始分泌，1-2小时达高峰，3-5小时后作用消失，胆汁分泌平均增加2倍。可减轻腹胀，腹痛，恶心，厌油等症状，增加食欲，促进消化。能舒张奥狄斯(Oddis)括约肌，有排结石作用，但不能溶石。能加速胆固醇转变成胆酸的过程，降低胆固醇。临床用于胆囊炎、胆道感染、胆石症、胆道手术后综合征及慢性肝炎的辅助治疗。
制备苯丙醇的主要原料为苯丙酮，苯丙醇原料中往往会含有苯丙酮，由于苯丙醇与苯丙酮的沸点接近，前者为219℃，后者为218℃，采用简单的蒸馏技术难以将两者分开。中国药典2000年版收载的检查苯丙酮的方法为紫外分光光度法，由于苯丙醇与苯丙酮均在所指定的波长处有紫外吸收，该方法无特异性，同时原料中还有苯乙醇与苯乙酮等相关物质，紫外分光光度法不能区分。另外，中国药典2000年版收载的测定苯丙醇含量方法为容量分析方法，利用酸酐与苯丙醇中羟基反应，计算出苯丙醇含量，此法操作繁琐，专一性差。虽有文献采用气相色谱法测定苯丙醇胶丸中苯丙醇含量(史大军等气相色谱法测定苯丙醇含量《药物分析杂志》2000，20(6)428～429；李瑞萍气相色谱-质谱法测定苯丙醇胶丸中苯丙醇含量《药物分析杂志》2003，23(3)170～172)，但至今，国内外尚未见采用高效液相色谱法(HPLC)测定苯丙醇原料及其制剂的含量。另外，文献报道的气相色谱法中采用了苯乙酮为内标物，由于苯丙醇中含有苯乙酮杂质，故而采用苯乙酮为内标物不适宜，同时，文献中也未提及所建立的方法对相关物质苯甲醇、苯乙酮、苯乙醇的分离情况，所采用的溶剂四氯化碳对操作者有极大的毒性，不适合作为常规分析技术。我们所建立的HPLC不仅可以测定苯丙醇原料及其制剂的含量，而且可以同时将苯丙醇、苯丙酮、苯甲醇、苯乙酮、苯乙醇等成分分离开来，使得苯丙醇原料及其制剂的含量测定不受干扰，所用的溶剂为常规溶剂。方法学研究结果表明，空白辅料、软胶囊的稀释剂植物油无干扰，所建立的HPLC法的精密度、回收率、稳定性等指标符合分析要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效液相色谱分析苯丙醇原料及其制剂的方法。所采用的色谱柱包括反相柱、CN基柱、NH2基柱； 柱温室温～50℃；流动相甲醇-水、乙醇-水、乙腈-水，或甲醇、乙醇、乙腈与水的三元或四元混合组成；流速1ml/min(可以根据具体情况进行适当调整)；洗脱方式可以是等度也可以是梯度；检测波长为苯丙醇的最大吸收波长215±2nm、258±2nm，也可以是其他合理的波长。所说的反相柱为C18、C8。所说的在C18、C8柱上的流动相甲醇-水的比例为30∶70～90∶10、乙醇-水的比例为30∶70～90∶10、乙腈-水的比例为30∶70～90∶10。在CN基柱、NH2基柱上的流动相甲醇-水的比例为1∶99～20∶80；乙醇-水的比例为1∶99～20∶80；、乙腈-水的比例为1∶99～20∶80。所说的三元或四元混合流动相为甲醇-乙腈-水；乙醇-乙腈-水；甲醇-乙醇-水；甲醇-乙醇-乙腈-水等。
本发明的优点是采用此方法可以很好地分离苯丙醇、苯丙酮、苯甲醇、苯乙醇、苯乙酮等物质，控制苯丙醇质量，准确测定苯丙醇原料及其制剂的含量，指示苯丙醇原料及其制剂的杂质、稳定性。本发明所建立的HPLC法具有操作简单、准确度高，专一性强等特点。
图1为用二级管阵列检测器(DAD)提取苯丙醇峰的紫外扫描图。
图2为苯丙醇原料中苯丙醇浓度为5mg/ml时杂质检查色谱图。
图3为将苯丙醇制成包合物后，苯丙醇浓度为5mg/ml时杂质检查色谱图。
图4为苯丙醇原料药中可能存在的杂质，即苯甲醇、苯乙醇、苯乙酮、苯丙酮在同一色谱条件下的色谱叠加图。
图5为苯丙醇原料药在4500LX光照度环境下光照5天后色谱图。
图6为苯丙醇包合物在4500LX光照度环境下光照5天后色谱图。
具体实施例方式实施例1检测波长的确定取用95％乙醇制成0.5mg/ml的苯丙醇溶液20ul注入色谱仪中，以甲醇-水(60∶40)为流动相，于DIKMA Diamonsil ODS(200×4.6mm，5μm)柱上进行分离，用二级管阵列检测器(DAD)提取苯丙醇峰的紫外扫描图，见附图1。由附图1可知，苯丙醇的最大吸收波长为215±2nm、258±2nm，在252±2nm、264±2nm处也有吸收峰，可以根据具体情况选择检测波长，原则上选择215±2nm或258±2nm作为检测波长。
实施例2苯丙醇在不同反相填料品牌柱中的保留行为。
以甲醇-水(60∶40)为流动相，流速为1.0ml·min-1，进样量为20μl，在257nm处记录色谱图，考察在苯丙醇在不同反相C18填料柱中的色谱行为，见表1表1.苯丙醇在不同ODS色谱柱中的保留行为色谱柱填料及规格 柱压/MPa TR/min 拖尾因子Betasil ODS(200×4.6mm，5μm) 13.9 8.68 1.31Diamonsil ODS(200×4.6mm，5μm) 6.6 8.12 1.16CenturySIL BDS(200×4.6mm，5μm)11.2 7.32 1.32CenturySIL MOS(200×4.6mm，5μm)12.0 8.36 1.26Spherisorb(200×4.6mm，5μm)12.6 8.43 1.41
YWG(250×4.6mm，10μm)13.8 13.12 1.38BOND(200×4.6mm，5μm)11.2 8.86 1.33HYPERSIL(200×4.6mm，5μm)13.2 9.06 1.26ZOBAX(200×4.6mm，5μm) 12.6 8.38 1.35Kromasil(150×4.6mm，5μm)10.6 9.11 1.32由表1可知，现有的C18品牌均可以用于苯丙醇的测定。选择Diamonsil ODS为色谱柱，分别考察了柱温20、30、40、50℃，结果表明均能将苯丙醇、苯丙酮分开，主峰的保留时间随柱温的升高而缩短，分离度合格。实际应用中，可在20～50℃范围内或低于或高于此范围的某一合适的柱温。
实施例3苯丙醇在C8柱中的保留行为以甲醇-水(55∶45)为流动相，流速为1.0m1·min-1，进样量为20μl时在215mm处记录色谱图，结果见表2。
表2、苯丙醇在不同C8柱中的保留行为色谱柱填料及规格柱压/MPa TR/min拖尾因子苯丙醇 苯丙酮CenturySIL C8 BDS(200×4.6mm，5μm) 16.415.3518.88 0.90CenturySIL C8(250×4.6mm，5μm) 18.512.3516.97 1.24Kromasil C8(150×4.6mm，5μm) 11.210.6 13.21 1.16Spherisorb C8(200×4.6mm，5μm) 19.116.5526.34 0.83实施例4考察苯丙醇在色谱柱CenturySIL C8BDS柱，不同流动相中的各参数，见表3。
表3苯丙醇在不同流动相中的保留行为流动相组成柱压/MPa TR/min 拖尾因子苯丙醇 苯丙酮甲醇∶水＝55∶4516.1 5.77 6.501.17甲醇∶水＝40∶6016.4 10.9713.69 0.97甲醇∶水＝35∶6516.4 14.3518.88 0.90实施例5在CN基柱、NH2基柱中，不同“乙腈-水”、“甲醇-水”或“甲醇-乙腈-水”配比的流动相对样品苯丙醇与杂质苯丙酮峰的分离效果。结果见表4。
表4苯丙醇、苯丙酮的保留行为流动相组成 柱压/MPa TR/min 拖尾因子苯丙醇 苯丙酮CN基柱乙腈∶水＝5∶95 13.8 9.2611.58 1.26NH2基柱乙腈∶水＝5∶95 11.2 3.115.161.38
CN基柱甲醇∶水＝1 5∶85 15.211.9716.800.98NH2基柱甲醇∶水＝2∶98 13.63.68 6.12 1.16CN基柱甲醇∶乙腈∶水＝5∶5∶90 12.68.12 11.261.12NH2基柱甲醇∶乙腈∶水＝2∶3∶95 18.13.16 5.66 1.61实施例6考察在DIKMA Diamonsil C18柱中，不同乙腈-水配比的流动相对样品苯丙醇与杂质苯丙酮峰的分离效果。结果见表5。
表5苯丙醇在各种比例的乙腈-水中的保留行为流动相组成柱压/Mpa TR/min 拖尾因子苯丙醇 苯丙酮乙腈∶水＝60∶403.8 4.54 6.74 1.37乙腈∶水＝50∶504.2 6.04 10.16 1.44乙腈∶水＝35∶653.9 13.97不出峰0.98乙腈∶水＝30∶704.9 19.16不出峰1.06实施例7考察在DIKMA Diamonsil C18柱中，不同乙腈-甲醇-水配比的流动相对样品苯丙醇与杂质苯丙酮峰的分离效果。结果见表6。
表6苯丙醇在各种比例的乙腈-甲醇-水中的保留行为流动相组成 柱压/MPa TR/min 拖尾因子苯丙醇 苯丙酮乙腈∶甲醇∶水＝10∶50∶40 6.38.82 11.221.22乙腈∶甲醇∶水＝20∶30∶50 5.610.6317.131.25乙腈∶甲醇∶水＝35∶20∶45 6.29.16 20.160.96乙腈∶甲醇∶水＝30∶15∶55 7.513.6223.681.11实施例8考察在DIKMA Diamonsil C18柱中，不同甲醇-水配比的流动相对样品苯丙醇与杂质苯丙酮峰的分离效果。结果见表7。
表7苯丙醇在各种比例的甲醇-水中的保留行为.
流动相组成柱压/Mpa TR/min 拖尾因子苯丙醇 苯丙酮甲醇∶水＝60∶406.6 8.1210.281.31甲醇∶水＝55∶457.1 11.34 14.871.07甲醇∶水＝50∶507.6 17.35 不出峰 0.84实施例9进一步以甲醇-水(55∶45)为流动相，考察苯丙醇在Diamonsil C18柱中与各杂质的分离情况，结果见表8和附图。
表8苯丙醇与相关化合物的保留行为化合物 苯甲醇苯乙醇苯乙酮苯丙醇 苯丙酮TR(min)3.56 7.00 9.05 11.34 14.87
实施例10苯丙醇含量测定的方法学考察标准曲线以乙醇为溶媒，准确配制浓度为10mg×mL-1的苯丙醇对照品贮备液，置4℃冰箱中保存。分别精密吸取苯丙醇对照品贮备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，置10mL量瓶中，以流动相定容至刻度，摇匀，得浓度为200、400、600、800、1000μg·mL-1的系列溶液，分别进样20μL，以浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，回归得方程C＝31.38A(10-4)+0.3678，r＝0.9997，线性范围200～1000μg·mL-1。
最低检出量取苯丙醇对照品贮备液适量，用流动相稀释成不同浓度，取20μL，注入色谱仪，使峰高为仪器基线噪音的三倍，此时溶液浓度为3μg·mL-1，最低检出量为60ng。定量限取苯丙醇对照品贮备液适量，用流动相稀释成不同浓度，取17μL，注入色谱仪，使信噪比为10∶1，此时溶液浓度为10μg·mL-1，定量限为170ng。精密度取上述溶液200、600、1000μgmL-1(低、中、高)3个浓度，于不同时间进样，计算日内精密度和日间精密度日内RSD分别为1.89％，1.65％和1.64％；日间RSD分别为1.38％，1.66％和1.87％。
苯丙醇含量测定回收率按处方比例的±20％加入苯丙醇，以乙醇溶解，并用流动相定容，摇匀，制备样品溶液。分别进样20μL，测定峰面积，代人标准曲线换算成实际测定浓度，计算回收率，结果回收率为99％～101％。
实施例11苯丙醇含量测定色谱条件色谱柱DIKMA Diamonsil C18(4.6mm×200mm，5μm迪玛公司)；流动相甲醇-水(55∶45)；柱温室温；紫外检测波长258nm。进样量20μL，理论板数按苯丙醇峰计算不低于1000。样品制备市售软胶囊、自制苯丙醇β-环糊精包合物、自制苯丙醇β-环糊精硬胶囊剂，以乙醇配制成约为0.5mg/ml的溶液，以外标法测定各样品的含量，结果表9苯丙醇与相关化合物的保留行为市售软胶囊 自制苯丙醇β-环糊精硬胶囊剂 苯丙醇β-环糊精包合物相对标示含量96.8(％) 100.1含量(mg/g包合物) 8.96实施例12测定苯丙醇原料的纯度及其光照稳定性将苯丙醇原料、苯丙醇β-环糊精包合物同置于4500LX光照度的环境中，进行光照5天试验，用“实施例10”色谱条件对样品进行含量测定及杂质检察，结果表明，苯丙醇原料的含量有较大的下降，为0时间的94.6％，杂质苯丙酮含量增加，由0时间的0.38％增加到5.12％；而苯丙醇β-环糊精包合物的含量基本不变，为0时间的99.7％，杂质苯丙酮含量未增加，说明将苯丙醇制成β-环糊精包合物后，药物的稳定性大大提高。见附图6。
权利要求
1.一种高效液相色谱分析苯丙醇原料及其制剂的方法，采用的色谱柱包括反相柱、CN基柱、NH2基柱，其特征在于采用高；柱温室温～50℃；流动相甲醇-水、乙醇-水、乙腈-水，或甲醇、乙醇、乙腈与水的三元或四元混合组成；流速1ml/min；洗脱方式可以是等度也可以是梯度；检测波长为苯丙醇的最大吸收波长。
2.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱分析苯丙醇原料及其制剂的方法，其特征在于所说的反相柱为C18、C8柱。
3.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱分析苯丙醇原料及其制剂的方法，所说的在反相柱上的流动相甲醇-水的比例为30∶70～90∶10、乙醇-水的比例为30∶70～90∶10、乙腈-水的比例为30∶70～90∶10。在CN基柱、NH2基柱上的流动相甲醇-水的比例为1∶99～20∶80；乙醇-水的比例为1∶99～20∶80；、乙腈-水的比例为1∶99～20∶80。
4.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱分析苯丙醇原料及其制剂的方法，其特征在于所说的三元或四元混合流动相为甲醇-乙腈-水；乙醇-乙腈-水；甲醇-乙醇-水；甲醇-乙醇-乙腈-水。
5.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱分析苯丙醇原料及其制剂的方法，其特征在于所说的最大吸收波长215±2nm、258±2nm、252±2nm、264±2nm。
全文摘要
本发明公开了一种高效液相色谱(HPLC)分析苯丙醇原料及其制剂的方法，采用此方法可以很好地分离苯丙醇、苯丙酮、苯甲醇、苯乙醇与苯乙酮等物质，控制苯丙醇质量，准确测定苯丙醇原料及其制剂的含量，指示苯丙醇原料及其制剂的稳定性。所采用的色谱柱包括反相柱、CN基柱、NH
文档编号G01N30/60GK1588043SQ20041005027
公开日2005年3月2日 申请日期2004年8月19日 优先权日2004年8月19日
发明者邓意辉, 吴红兵, 雷杰杰 申请人:沈阳药科大学