专利名称：单胺氧化酶诊断试剂盒及单胺氧化酶活性浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种单胺氧化酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定 单胺氧化酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
单胺氧化酶(MAO)测定可分为化学分光光度法、荧光法、免疫抑 制法及现在申请专利的酶法。 一般多用化学分光光度法，单胺氧化酶 反应底物以苄胺(Benzylamirie)和对苯甲胺-P -偶氮萘酚，也可应用 单胺氧化酶催化胺类释放出的HA氧化发色剂，如10-N-甲基氨基甲酰 基-3， 7-二甲氨基-10-氢-吩噻嗪(MCDP)。除此之外，单胺氧化酶反 应底物还有丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine)、 P-苯乙基 胺(b-phenylethylamine )、酪胺(tyramine : 3-对羟基苯乙胺 3-paxahdroxypheiiylethylamine)、 5-羟色胺(5-hydroxytryptamine) 等，丁基胺、戊基胺、苯乙基胺约为3-对羟基苯乙胺活性的30%， 通常应用苯甲胺作为底物比其他底物的单胺氧化酶活性要高。目前单 胺氧化酶测定多用苄胺和对苯甲胺-e -偶氮萘酚为底物，但对苯甲胺-e-偶氮蔡酚苄胺法需要用环乙烷提取，限制了该方法的实用性，且不 能应用全自动生化仪分析；苄胺法的原理是苄胺在单胺氧化酶的作用 下生成节醛，然后在强碱性氢氧化钠的条件下与二硝基苯肼反应，生 成醛苯騌，在生化仪上测定也较困难。 荧光法检测单胺氧化酶是以P -苯乙胺作为底物，其在10 100mg 时Km最大，高于苄胺和5-羟色胺的Km值。
免疫学方法是利用单胺氧化酶抗体与单胺氧化酶发生反应，作用 后进行单胺氧化酶同工酶测定。目前应用较多的单克隆抗体是 MAO-A3C9、 MAO-A4F10、 MAO-A7B10、 MAO-A7E10和MAO-B1C2等。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶循环扩增法
(Enzymatic Recycling Method)、 酶比色》去(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原型 烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定 单胺氧化酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法 的单胺氧化酶诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在紫外/可见光分析 仪或半、全自动生化分析仪上进行单胺氧化酶活性浓度测定，而且测 定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明单胺氧化酶活性浓度测定方法原理如下
胺类化合物+水+氧单胺氧化酶相应醛类产物+氨离子
+过氧化氢
氨离子+丙酮酸+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶 L-丙氨酸
+水+辅酶
丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨离子+丙酮酸+
过氧化氢
单胺氧化酶(monoamine oxidase ; EC 1.4.3.4 ; EC 1.4.3.6)作为作
用酶，功能为将胺类化合物酶解产生氨离子。甘氨酸氧化酶(glycine oxidase ; EC 1.4.3.19)作为循环酶甘氨酸氧化酶的酶促作用使丙氨 酸再次变回氨离子和丙酮酸，使氨离子不断地被重复循环利用。丙氨 酸脱氢酶(alanine dehydrogenase ; EC 1.4.1.1)作为显色酶，在不断
地被重复循环利用的氨离子和丙酮酸的一起作用下，使还原型辅酶(在 340nm处有吸收峰)不断地被氧化成为氧化型辅酶(在340mn处没有 吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度， 通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算肌酐的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明单胺氧化酶 诊断试剂盒较为理想-
缓冲液lOOmmol/L
稳定剂50 mmol/L
还原型辅酶0.25 mmol/L
胺类化合物16 mmol/L
丙酮酸16 mmol/L
丙氨酸脱氢酶10000U/L
甘氨酸氧化酶腸O U/L
本发明的单胺氧化酶诊断试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、胺类化合物、丙酮酸、丙氨酸 脱氢酶、甘氨酸氧化酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成
液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、胺类化合物、丙酮酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶。 还原型辅酶、胺类化合物、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶
在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使 用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。 试剂2
缓冲液、稳定剂、胺类化合物、丙酮酸。 试剂3
缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶。 还原型辅酶、胺类化合物、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶 在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状 态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定单胺氧化酶活性浓度的方 法，其还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施例方式
50 mmol/L 0.25 mmol/L 16 mmol/L 16 mmol/L
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的单胺氧化酶诊断试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 还原型辅酶 胺类化合物 丙酮酸
丙氨酸脱氢酶 10000 U/L
甘氨酸氧化酶 8000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂； 使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测单胺 氧化酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)， 延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值一4180。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出单胺氧 化酶的活性浓度大小。 实施例二
本实施例的单胺氧化酶诊断试剂为双试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
还原型辅酶
胺类化合物
丙酮酸
50 mmol/L
0.25 mmol/L
12 mmol/L
20 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
丙氨酸脱氢f
甘氨酸氧化
50 mmol/L
16000U/L
12000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7,测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测单胺 氧化酶样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应 (下降反应)，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右，理论 K值一2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出单胺氧 化酶的活性浓度大小。 实施例三
本实施例的单胺氧化酶诊断试剂为三试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂 还原型辅l
50 mmol/L 0.25 mmol/L
试剂2
(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液
稳定剂
胺类化合物
丙酮酸
100 mmol/L 50 mmol/L 12 mmol/L 12 mmol/L
试剂
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100 mmol/L
稳定剂
50 mmol/L
16000U/L
甘氨酸氧化酶 6000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定单胺氧化酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度 37°C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm， 测试副波长405nm，被测单胺氧化酶样品与试剂1 、试剂2、试剂3的 体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约 l分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值一2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出单胺氧 化酶的活性浓度大小。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分 析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应 用。
权利要求
1.一种酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的单胺氧化酶活性浓度测定方法，其方法原理如下胺类化合物+水+氧 单胺氧化酶 相应醛类产物+氨离子+过氧化氢氨离子+丙酮酸+还原型辅酶 丙氨酸脱氢酶 L-丙氨酸 +水+辅酶丙氨酸+水+氧 甘氨酸氧化酶 氨离子+丙酮酸+ 过氧化氢将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出单胺氧化酶的活性浓度大小测定结果。
2. —种单胺氧化酶诊断试剂盒，主要成分包括: 缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 胺类化合物 丙酮酸20-500 mmol/L50 mmol/L0.1--0.35 mmol/L30 mmol/L2-woo-so mmol/L20000 U/L甘氨酸氧化酶2000-12000U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用: 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述单胺氧化酶诊断试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、胺类化合物、丙酮酸、丙氨酸脱 氢酶、甘氨酸氧化酶组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述单胺氧化酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、胺类化合物、丙酮酸、丙氨酸脱 氢酶、甘氨酸氧化酶组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、 还原型辅酶、胺类化合物、丙酮酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定 剂、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶组成。还原型辅酶、胺类化合物、 丙酮酸、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶在试剂1或试剂2中的位置 可以不限。
5. 根据权利要求2所述单胺氧化酶诊断试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、胺类化合物、丙酮酸、丙氨酸脱 氢酶、甘氨酸氧化酶组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、 还原型辅酶、组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、胺类化合物、丙 酮酸组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧 化酶组成。还原型辅酶、胺类化合物、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶、甘 氨酸氧化酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述单胺氧化酶诊断试剂盒，其特征在于还包 括稳定剂1~~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为 硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的单胺氧化酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定单胺氧化酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、胺类化合物、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出单胺氧化酶的活性浓度大小。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。
文档编号G01N21/78GK101173899SQ20061009732
公开日2008年5月7日 申请日期2006年10月30日 优先权日2006年10月30日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司