专利名称：电动浓缩设备及其使用方法
技术领域：
本发明提供在浓縮(concentration)溶液中感兴趣带电粒种的过 程中的设备及其使用方法。本发明提供基于对感兴趣带电粒种的电动 截留(electrokinetic trapping)的浓縮设备，所述感兴趣带电粒种能够被 进一步地析出(isolate)和分析。
背景技术：
蛋白质组学的主要挑战之一是诸如血清或细胞提取物的生物分 子样本过于复杂。典型的血液样本可能含有多于10,000种的不同蛋 白质种类，其浓度在9个数量级上变化。在蛋白质组学中，蛋白质的 这种多样性以及其巨大的浓度范围，对于样本制备提出了严峻挑战。
由于有限的分离峰值容量(可达 3000)和动态检测范围( 104)，基于多维分离步骤和质谱法(MS)的传统蛋白质分析技术具有缺 陷。微流体生物分子分析系统(所谓的WAS)允许进行自动生物分 子处理。将各种生物分子的分离和提纯步骤以及化学反应和扩增小型 化到微芯片上，展示了快几个数量级地进行样本分离和处理。另外， 将两个不同分离步骤微流体集成到一个多维分离设备中已经被展示。 然而，大多数的微流体分离和样本处理设备都遭受样本容积不匹配的 关键问题。微流体设备在处置和处理lpL lnL的样本流体时非常有 效，但是大多数的生物分子样本在容积大于lpL的液体中才可得到或 者被处置。因此，基于微芯片的分离技术常常仅仅分析可得到样本中 的一小部分，这大大限制了整体的检测灵敏度。在蛋白质组学中，由 于信息丰富的信号分子(如，细胞因子和生物标志物)仅仅存在于痕 量浓度(nM pM范围内)中，并且对于蛋白质和肽而言没有诸如聚 合酶链式反应(PCR)的信号扩增技术的这一事实使该问题更加严重。需要一种有效的样本浓縮器，其能够得到典型的微升或以上的典 型样本容积并且将分子浓縮到更小容积中，以便其能够被更灵敏地分
离出和检测到。当前可用于提供液体中的样本预浓縮的几种策略包括
场放大样本堆积(FAS)、等速电泳(ITP)、电动截留、胶束电动推扫 (micellar electrokinetic swe印ing)、色谱分析预浓縮以及膜预浓 縮。这些技术中的许多最初是为毛细管电泳而开发的，并且需要特定 的缓冲液布置(buffer arrangements)和/或反应物。色谱分析和基于过 滤的预浓縮技术的效率取决于目标分子的疏水性和大小。电动截留能 够用于任何带电的生物分子粒种，但是为了操作通常需要纳米多孔的 电荷选择性膜。总体上，所展示的用于现有预浓縮方案的浓縮因子被 限制在 1000，并且由于诸如反应物和材料需求的各种操作限制，很 难将它们应用到集成的微系统中。
发明内容
在一个实施例中，本发明掛共了一种亂缩设备，其包括微通道；
纳米通道；
用于感应所述纳米通道中电场的单元；
用于感应所述微通道中电动或压力驱动流动的单元；以及 导管，包含感兴趣粒种的液体能够通过所述导管； 其中，将所述微通道连接到所述纳米通道，并且将所述导管连接 到所述微通道。
在一个实施例中，在所述设备中导入(introduction)包含感兴趣粒种 的液体以及独立感应所述纳米通道和所述微通道中的所述电场，在所 述微通道内浓缩所述感兴趣粒种。
在另一个实施例中，用于感应在所述纳米通道、或者所述微通道 或者其结合中的电场的装置是电压源。在一个实施例中，所施加的电压 在50mV到500V之间。在一个实施例中，电压源将相等的电压施加于 所述微通道的阳极和阴极侧；或者在另一个实施例中，电压源将较大 的电压施加于所述微通道中与阴极侧相对照的阳极侧。在一个 例中，微通道的宽度在l-100pm之间，并且在另一个 实施例中，微通道的深度在0.5-50^m之间。在另一个实施例中，纳 米通道的宽度在l^m-50nm之间，并且在另一个实施例中，所述纳米 通道的深度在20-100纳米之间。
在一个实施例中，将微通道的表面功能化，以降低或增强所述感兴 趣粒种关于所述表面的吸附。在另一个实施例中，将纳米通道和/或 微通道的表面功能化，以增强或降低设备的操作效率。在另一个实施 例中，将外部的门电势施加于所述设备的衬底，以增强或降低设备的 操作效率。在另一个实施例中，设备主要由透明材料组成。在另一个 实施例中，透明材料为Pyrex、 二氧化硅、氮化硅、石英或者SU-8。
在另一个实施例中，将设备耦合到分离系统；或者在另一个实施 例中，耦合到检测系统；或者在另一个实施例中，耦合到分析系统； 或者在另一个实施例中，耦合到其结合。在另一个实施例中，将设备 耦合到照明源。
在另一个实施例中，设备包括多个微通道、纳米通道或者其结合。 在一个实施例中，将多个微通道、多个纳米通道或者其结合安排成特 定的几何形状(geometry)，其在一个实施例中，包括微通道关于所述 纳米通道的垂直定向。
在一个实施例中，本发明提供一种MI液体中感兴趣粒种的方法，其 包，,本发明的设备。
在一个实施例中，本发明提供一种包括本发明的设备的微流体泵，其 在一个实施例中具有在10pm/sec到10mm/sec之间的液体流动速度。
在一个实施例中，本发明提供一种浓縮液体中感兴趣粒种的方法， 该方法包括下列步骤
将液体从源导入浓縮设备，其中所述液体包含感兴趣粒种，并且 其中所述设备包括连接到纳米通道的微通道；
感应所述纳米通道中的电场，借此离子消耗发生于其中将所述微 通道连接到所述纳米通道的区域，并且在所述微通道内形成空间电荷 层，其给所述感兴趣粒种提供能障；以及
感应所述微通道中的液体流动。
13在一个 例中，流动是电渗的，并且在另一个实施例中，凭借对 微通道中电场的感应，在微通道中感应电渗流动。在另一个实施例中， 流动是压力驱动的。
在一个实施例中，将相等的电压施加于微通道的阳极和阴极侧；或 者在另一个实施例中，将较大的电压施加于微通道中与阴极侧对照的 阳极侧。在另一个实施例中，在将较大的电压施加于所述微通道的阳 极侧之前，在微通道中产生空间电荷层。
在一个实施例中，液体是溶液。在另一个实施例中，液体是悬浮 液，其在另一个实施例中是器官匀桨、细胞提取物或者血液样本。在 一个实施例中，感兴趣粒种包括蛋白质、多肽、核酸、病毒颗粒或者 其结合。
在一个实施例中，该方法还包括使感兴趣粒种经历毛细管电泳的 步骤。在一个实施例中，该方法还包括从设备中释放所述感兴趣粒种 的步骤。在另一个实施例中，当所述粒种以低于检测限值的浓度存在 于所述液体中时，该方法用于检测所述感兴趣的粒种。
在另一个实施例中，本发明提供一种用于控制系统中液体流动的 方法，该方法包括
将所述液体从源施加于所述系统中的泵送设备，其中所述设备包 括连接到纳米通道的微通道，并且所述液体包含带电粒种或两性粒种
(amphoteric species);
感应所述纳米通道中的电场，借此离子消耗发生于其中将所述微 通道连接到所述纳米通道的区域，并且在所述微通道内形成空间电荷 层，其给所述感兴趣粒种提供能障；以及
感应所述微通道中的电场，借此在所述微通道中感应电渗流动， 所述流动将所述液体进一步导入所述设备，并且所述流动由所述电场 的强度控制。
图1示意性地描绘了一种蛋白质MI设备的实施例，(A)该设备的布局 的实施例；(B)显示(A)中虚线滩区域的放大示意图，示出纳 31(1-10)关于M道(l-20)的定向；施加相应的电压使得形成截留区(MO)和消耗区 (1-50)，如图中戶标，最,于来自ldm(l-30)的流体的电渗流动(EOF)。 g指定穿过离子消耗区所施加的电场，而￡ 指定穿逸内滤職nanofflter)的
电场；
图2示意性地描绘了蛋白M^S设备的实施例；纳米流体Mit(2-10)， 连接两个微流体3Iit(2-20);如所示，借助于电极(2-30)，将电场施加于该设 备；如所描述的，将好MJW池(240)中錢至隨设备中；与M道(2-50) 相接的、具有缓冲、液的其4也容器如所指示的；
图3示意性地描绘了该设备中带电粒种的、鹏机制的实施例;(A)当穿 遗内滤鹏加小电场(《)时，没有观察到浓度极化效应；(B)随着E"的增
加，离子的瓶^i^有限扩散(diffiision-limited)的并且产生离子消耗带；然 而，该区域仍维持电中性；(C) 一旦施加强场(A)，纳^i6Iit将出现感应空
间电荷层，在这里不再维持电中性；(D)通过在阳极侧、髓微流体通道(从 ^到^ )施加附加场(A)，感应到非线性电动流动(称为第二种类型的电
渗)，这导致在感应空间电荷层前面生物^f的快速聚集；
图4魏道中聚焦蛋白(GFP)的荧光图像；(A)在纳滤膜附近发生GFP 1，在50射中样本采集后，从最初的33pMGFP溶液的装载中获得该图 像；M道(20pm宽，lpm深)由灰线显示，而纳滤膜(40nm深)由实 心方t央織!j; (B)在最初的浓度G3pM GFP溶液)处的鹏荧光信号分 布，其低于噪声基底(noise floor); (C)在0.33pM GFP浓度处Mif荧光 信号分布，其仅能由CCD检测装备(setup)检测到；(D)通道中所浓縮的 GFP的荧光信号分布(图2(A));区间(plug)的浓度比(C)中的浓度要対寻 多；
图5展示了该设备的一个实施例的稳定性和效率。(A)在将33pM GFP
样本装载入所实施设备的顶部微流体通道后直接得到的荧光图像。(B) 在施加^ =10V， FD=5V以及^=^2 =OV持续25併中后所得到的图像。
(C)在池中1顿相同电雖擀卖ioo併中后所得至啲图像。p)从具有三种
不同浓度的糖GFP溶液开始，所采集的GFP区间的局部浓度的描点。(E) 用于(D)中33M GFP实验的全貌图。这显示出在40仝H中内达到了至少107倍
的浓度。
15图6展示了所采集生物^ 的释放。(A)显示在,和释放(毛细管电 泳)步骤期间施加于池的电压的示意图。(B)从0到250秒，将废、Mil接 地，并且横过滤鹏加电压，来触发截留5嫁。结果，安扫陆下游的检测 器从CCD阵列中仅仅读出暗噪声。显示从0到30秒的信号来自在检测器 和纳滤膜(约10mm)之间存在的33pM GFP溶液。为了更详细地显示 每一步骤，不使用中性密度滤光器。因此，pM水平的GFP样本在可 检测范围内。在250秒后，将废液通道浮起以释放顶部通道中所采集 的分子。(C)荧光标记的肽样本的采集和释放。(用500秒中的1000 倍以上的预浓縮)形成非常清晰的样本区间，其使所使用的CCD阵 列饱和。(D)共同采集持续5分钟并且释放(发射)的两种不同蛋白 质的毛细管电泳分离。
具体实施例方式
在一个实施例中，本发明提供一种在浓縮感兴趣粒种过程中的浓 縮设备及其使用方法。
在一个实施例中，本发明提供一种浓縮设备，其包括
微通道；
纳米通道；
用于感应所述纳米通道中的电场的单元； 用于感应所述微通道中的电动或压力驱动流动的单元；以及 导管，包括感兴趣粒种的液体能够通过所述导管； 其中，将所述微通道连接到所述纳米通道，并且将所述导管连接 到所述微通道。
在另一个实施例中，该浓縮设备简称为"浓縮器"，包括至少一 个微通道和至少一个纳米通道。在一个实施例中，为了各自通道的形 成，利用微细加工和纳米加工技术形成浓縮器。
在一个实施例中，微细加工技术、或者微技术或者MEMS，将 半导体制造工具和工艺应用到例如物理结构的形成上。在一个实施例 中，微细加工技术允许在在其他实施例中由硅、玻璃或者塑料制成的 芯片上精确地设计尺寸在〈lmm到几厘米范围内的特征(如，阱、通
16道)。在一个实施例中，这种技术可以用来构造浓縮器的微通道。
在另一个实施例中，NEMS或者纳米技术用来构造浓縮器的纳米 通道。在一个实施例中，如在以全文引用的方式并入本文中作为参考 的Z. N, Yu、 P, Deshpande、 W. Wu、 J. Wang和S. Y. Chou， Appl. Phys. Lett. 77 (7), 927 (2000) ; S.Y.Chou、 P. R. Krauss、和P. J. Renstrom， Appl. Phys. Lett. 67 (21)， 3114 (1995); Stephen Y, Chou、 Peter R. Krauss 和Preston J. Renstrom, Science 272， 85 (1996)以及美国专利No. 5,772,905所描述的，纳米通道能够用纳米压印光刻技术(NIL)制造而 成。在一个实施例中，纳米通道和/或微通道能够用纳米压印光刻、 干涉光刻、自组装共聚物图形转移、旋涂、电子束光刻、聚焦离子束 铣削、光刻法、反应离子蚀刻、湿式蚀刻、等离子体增强化学气相沉 积、电子束蒸发、喷溅沉积及其结合形成。可选地，其他传统的方法 也能用于形成纳米通道和/或微通道。
在一个实施例中，如在下文例1中所举例说明的，并且如在以全 文引用的方式并入本文中作为参考的J.Han、 H. G. Craighead、 J. Vac. Sci. Technol., A 17, 2142-2147 (1999)和J. Han、 H. G. Craighead, Science 288， 1026-1029 (2000)所描述的，形成纳米通道和微通道。
在一个实施例中，进行一系列的反应离子蚀刻，在这之后用标准 光刻工具使纳米通道图案化。在一个实施例中，蚀刻采用特定的几何 形状进行，该几何形状在另一个实施例中决定了多个微通道之间和/ 或多个纳米通道之间的接口。在一个实施例中，用于生成微通道的蚀 刻在平行于其中生成用于纳米通道的蚀刻的平面进行。在另一个实施 例中，使用诸如例如在一个实施例中的KOH蚀刻的附加蚀刻，以产 生浓缩器中的附加结构，诸如例如用于生成装载孔。
在另一个实施例中，进行浓縮器的电气绝缘。在一个实施例中， 通过浓缩器的氮化物脱氧(nitride stripping)和热氧化实现这种绝缘。在 另一个实施例中，可以将浓縮器的表面附着在衬底上，诸如例如在一 个实施例中的Pyrex晶圆上，该表面在另一个实施例中是底部表面。 在一个实施例中，可以利用阳极键合技术附着晶圆。
在一个实施例中，可以用本领域技术人员所公知的方法或者对这些方法的修改，诸如例如在以全文引用的方式并入本文中作为参考的
美国专利No. 6,753,200中所描述的那些，实现浓缩器的构造。
在一个实施例中，制造可以使用夹在永久基底(permanent floor) 和顶层(cdling layers)中间的成形的牺牲层，牺牲层的形状限定了工作 间隙。当移除牺牲层时，工作间隙成为具有想要的构形的流体通道。 在一个实施例中，该方法允许在射流设备的结构中精确定义内部工作 空间或者流体通道的高度、宽度和形状。
牺牲层形成于衬底上，例如，用合适的光刻工艺成形，并且用顶 层覆盖。其后，可以用湿式化学蚀刻移除牺牲层，在基底和顶层之间 留出空的空间，其形成可用作浓縮器的流动通道和室的工作间隙。在 这种设备中，按照牺牲层薄膜的厚度判定工作间隙的垂直尺寸或高 度，所述牺牲层薄膜用精确的化学气相沉积(CVD)技术得到，并且因 此，其尺寸非常小。
为了提供蚀刻溶液向包含在该结构中的牺牲层的通路，可以穿过 顶层切割一个或多个入孔(access holes),经过这些孔用湿式蚀刻来移 除牺牲层，所述蚀刻溶液用于移除牺牲层。在牺牲层和电介质层之间 可能需要具有极高的蚀刻选择性，以便在不消耗构成最终设备的基底 和顶层的条件下，在侧向距离入孔有明显距离的牺牲层中，允许进行 蚀刻。可以用于这种工艺的材料的一种组合是分别用于牺牲层和用于 基底和顶层的多晶硅和氮化硅。在一些实施例中，用诸如氢氧化钾 (KOH)、氢氧化钠(NaOH);或者在另一个实施例中，用氢氧化四甲铵 (TMAH)的碱性溶液能够获得极高的蚀刻选择性。
在另一个实施例中，可以将在顶部层(t叩layer)切割的多个入孔 覆盖。为此，可以在顶层上沉积二氧化硅的密封层，以填充所述多个 入孔，并且该附加薄膜层提供良好的密封，以防止工作间隙中的流体 的泄漏或蒸发。表示其它实施例的Si02CVD技术产生诸如极低温氧 化物(YLTO)沉积的低程度膜共形性(fllm conformality)，由于在入孔附 近的堵塞，因此在没有过度损失设备面积的情况下，该技术形成可靠 密封。如果需要，代替顶层中的多个孔或者除顶层中的多个孔之外， 入孔可以钻通底部层(bottom layer)，并且稍后通过沉积二氧化硅层重
18新密封这些入孔。
例如，在一些实施例中，化学气相沉积(CVD)可用于沉积设备材 料，其包括通常是诸如氮化硅或二氧化硅的电介质材料的永久性壁材 料(permanent wall materials),以及诸如非晶硅或多晶硅的非永久性牺 牲层材料。
在一个实施例中，微通道和纳米通道关于彼此垂直地定向。在一 个实施例中，术语"垂直的"或"垂直地"指一个通道关于另一个通 道的纵轴以90。角+/-5°地定向；或者在另一个实施例中，以90° 角+/-10°地定向；或者在另一个实施例中，以90°角+/-20°地定 向。
在一个实施例中，构造连接本发明的浓縮器的微通道和纳米通道 的接口区。在一个实施例中，衍射梯度光刻(DGL)用于形成本发明的 多个微通道和多个纳米通道之间的梯度接口。在一个实施例中，梯度 接口区可以调节经过浓縮器的流动；或者在另一个实施例中，调节微 通道中形成的空间电荷层，这在另一个实施例中可以在电场强度中被 反映；或者在另一个实施例中，被产生微通道中的空间电荷层所需要 的电压反映。
在一个实施例中，由横向空间梯度结构(lateral spatial gradient structures)形成梯度接口区，用于使横截面的值从微米縮小到纳米长 度等级。在另一个实施例中，由垂直倾斜梯度结构(vertical sl叩ed gradient structure)形成梯度接口区。在另一个实施例中，梯度结构能 够提供横向和垂直梯度。
在一个实施例中，用衍射梯度光刻，通过在衬底上形成一个纳米 通道或多个纳米通道，在衬底上形成一个微通道或多个微通道以及在 它们之间形成梯度接口区，可以制造浓縮设备。在一个实施例中，通 过在光刻期间利用安置在光掩模和/或光致抗蚀剂上的屏蔽掩模，能 够形成梯度接口区。屏蔽掩模的边缘提供用于在光致抗蚀剂上投射梯 度光强度的衍射。
在一个实施例中，浓縮器可以包括多个通道，其包括多个微通道、 或者多个纳米通道或者其结合。在一个实施例中，短语"多个通道"指两个以上的通道；或者，在另一个实施例中，指5个以上通道；或 者，在其它实施例中，指10、 96、 100、 384、 l，OOO、 1,536、 10， 000、 100, 000或者1， 000， 000个以上的通道。
在一个实施例中，微通道的宽度在l-100pjn之间；或在另一个实 施例中，在l到15iain之间；或在另一个实施例中，在20到50(om之 间；或在另一个实施例中，在25到75nm之间；或在另一个实施例中， 在50到lOOpm之间。在一个实施例中，所述微通道的深度在0. 5-50nm 之间；或在另一个实施例中，在0.5到5jom之间；或在另一个实施例 中，在5到15pm之间；或在另一个实施例中，在10到25!iin之间； 或在另一个实施例中，在15到50^m之间。
在另一个实施例中，纳米通道的宽度在lMiii-50Hm之间；或在另 一个实施例中，在1到15Min之间；或在另一个实施例中，在10到 25(om之间；或在另一个实施例中，在15到40nm之间；或在另一个 实施例中，在25到50nm之间。在另一个实施例中，所述纳米通道的 深度在20-100纳米之间；或在另一个实施例中，在20到50纳米之 间；或在另一个实施例中，在20到75纳米之间；或在另一个实施例 中，在30到75纳米之间；或在另一个实施例中，在50至U00纳米 之间。
在一个实施例中，如图1中所图示的那样构造浓縮器。将5-50pra 宽和40nm深的纳米通道(I-IO)关于微通道(1-10)垂直地定向，在此 微通道是10-20一之间宽和1. 51im深。
在本发明的另一方面，浓縮器进一步包括至少一个与一个微通道 或多个微通道流体连通的贮样池。在图1所描绘的实施例中，贮样池 (l-30)接近微通道。在另一个实施例中，贮样池可以释放包含感兴趣 粒种的流体或液体。在一个实施例中，借助于导管将贮样池连接到微 通道，所述导管可以具有微通道的尺寸，或者如所描述的，可以包括 梯度接口区。
在一个实施例中，将包含感兴趣粒种的液体导入设备中并且独立 感应纳米通道和微通道中的电场，使感兴趣粒种在微通道内浓縮。 在一个实施例中，浓縮器利用充满缓冲溶液的平板式纳米流体过滤器作为离子选择性膜，以便产生用于电动截留的离子消耗区，如下 文将要举例说明的。
在一个实施例中，因为微通道中产生的非线性电渗流(远强于正 常的电渗流)，其以高流动速度将流体从贮样池抽进多个微通道中， 并且因为在与纳米通道并置的区域处，由微通道中的感应空间电荷层 产生用于阴离子分子的能障，所以设备有效地采集带电分子。
在一个实施例中，将两个分离的电场施加于浓縮器并且进行独立
地控制，如图1B所示。纳米流体通道(&)中的场产生离子消耗区和截 留阴离子分子的扩展空间电荷层。阳极侦啲微流体通道中的切向场(&)， 产生电渗流动，期各^ 从池中抽进截留区(1"40)。
在一个实施例中，例如如图7所描绘的，并且如下雄一步描述的， ffi31^纵本发明的设备中的缓冲^^(buffer condition),进一步稳定空间电荷 区域，如图7所描绘的，并且如下鄉一步描述。在一个实施例中，该设 备包括两个或一系列的两个串联的微通道，每个都由纳米S3t连接。根据 这个实施例，经过一段时间，顶部微通道中的电离子消耗消耗导致底部微 通道中的离子富對enrichment)，因而底部微流体通道中的缓冲液浓度随着 分离工231程的传导延长传导而增加。^^低W3I中，在一个实施例中， M在指定的时间周期处，劍共较低浓度的缓冲液；或者在另一个实施例 中，J彰封舰过电渗；或在另一个实施例中，通过压力驱动流动，根据这 个实施例，这种效应得到缓和。
在本发明的另一个实施例中，通过在微通道的两侧并且与微通道 流体连通地安置多个纳米流体通道，例如，如图8所示，可以增强物 质的预浓縮。通过在微通道的每一侧安置多个纳米通道，开始于微通 道和纳米通道之间接口处的离子消耗得到增强，并且在一些实施例 中，产生更稳定的空间电荷区域。
在一个实施例中，流动可以是压力驱动的，并且可以用本领域技 术人员所公知的任何手段来实现。在另一个实施例中，流动可以是压 力驱动和电动流动的混合。
在一个实施例中，短语"压力驱动流动"指由在通道段(channel segment)外部的压力源驱动的流动，通过所述通道段这种流动被驱动，如与通过穿过该通道段施加电场、穿过所讨论通道段而产生的流动， 其在一个实施例中被称为"电动驱动流动"相比较的。
压力源的例子包括负和正压力源或在所讨论通道段外部的泵，其 包括电动压力泵，例如，在与所讨论通道段分离的泵送通道中由电动 驱动流动产生压力的泵，假定这种泵在所讨论通道段外部(参见美国
专利No. 6,012,902和6,171,067，两个美国专利中的每个出于各种目的 以全文引用的方式并入本文)。
在一个实施例中，术语"电动流动"指在所施加电场下流体或者 液载物质(fluidbomematerial)的运动。电动流动通常包括电泳以及电渗 中的一个或两个，电泳如带电粒种经过介质或者其沉积在其中的流体 的运动，电渗如包括其所有组分的大量流体(bulkfluid)的电驱动运动。 因此，当提及依据电动流动时，应理解的是，所想象的是电动流动从 粒种的主要或基本完全电泳运动，到如在不带电物质情况下物质的主 要电渗驱动运动的全部谱，以及落在这些极值范围内的两种电动运动 的全部范围和比例。
在一个实施例中，提及的术语"液体流动"可以包括流体或其它 物质穿过管道、导管、通道或越过表面的流动特性中的任何一种或全 部。这种特性包括但不限于流速、流量、流动流体或其它物质的构造 和伴随的色散分布(dispersionprofile)、以及其它更广义的流动特性，如，
层流、蠕动流、湍流等。
在一个实施例中，混合流动可以包括将液体样本基于压力地传递 (rday)到通道网络中，接着是物质的电动运动；或者在另一个实施例 中，液体的电动运动接着是压力驱动流动。
在一个实施例中，在各自的通道中通过将来自电压源的电压施加 于设备可以感应电场。在一个实施例中，通过放置至少一对能在至少 一个方向跨过至少一些通道施加电场的电极来施加电压。利用标准集 成电路制造技术能够集成多个电极金属接点，以与至少一个微通道， 或者在另一个实施例中，与至少一个纳米通道，或者在另一个实施例 中，与其结合，相接触，并且同样地定向，以建立方向电场。能够施 加交流电(AC)、直流电(DC)或两种类型的场。电极能够由几乎任何金
22属制成，并且在一个实施例中，包括在所限定的线路径上沉积的薄
Al/Au金属层。在一个实施例中， 一个电极的至少一端与池中的缓冲 溶液接触。
在另一个实施例中，浓縮器可以包含至少两对电极，每对在不同 方向提供电场。在一个实施例中，场接点(fieldcontacts)可用于独忠也调 节电场的方向和幅度，以，在一个实施例中，定向空间电荷层；或者在另 一个实施例中，以想要的鹏或方向移动高好；或者在另一个实施例中， 进行两者的结合。
在一个实施例中，所施加电压在50mV和500V之间。在一个实 施例中，电压源将相等的电压施加于微通道的阳极和阴极侧，或者在 另一个实施例中，电压源将较大的电压施加于所述微通道中与阴极侧 相对照的阳极侧。
在一个实施例中，电压源可以是任何可以用于提供想要的电压的 电源。电源可以是任何能够产生想要电压的电源。例如，电源可以是 压电(pizoelectrical)源、电池或者由家用电流提供电力的设备。在一个 实施例中，可以使用来自煤气点燃器(gas igniter)的压电放电。
在一个实施例中，设备中的电动截留和样本采集能够发生在数分 钟的期间内；或者在另一个实施例中，能够维持若干小时。在一个实 施例中， 一段时间内的浓缩导致高达106-108的浓缩因数，并且在另 一个实施例中，在浓縮期间所使用的条件诸如通过修改微通道和纳米 通道间的接口、所施加电压、液体的含盐浓度、液体的pH值或其结 合得到优化时，可达到甚至可以更高。
在另一个实施例中，浓縮器进一步包括至少一个与浓縮器的一个 微通道、多个微通道、 一个纳米通道或多个纳米通道流体连通的废液 池。在一个实施例中，废液池能够容纳流体。
在一个实施例中，可以将微通道的表面功能化，以减少或增强感 兴趣粒种关于浓縮器表面的吸附。在另一个实施例中，将纳米通道和 /或微通道的表面功能化，以增强或降低设备的操作效率。在另一个 实施例中，将外部的门电势(gate potential)施加到设备的衬底上， 以增强或降低设备的操作效率。在另一个实施例中，设备由透明材料
23组成。在另一个实施例中，透明材料为Pyrex、 二氧化硅、氮化硅、 石英或SU-8。
在另一个实施例中，浓縮器适合于，在一个实施例中，在浓縮器 中；或在另一个实施例中，在浓縮器的下游(downstream)，对于感兴 趣粒种进行分析。在一个实施例中，浓缩器的下游分析涉及从设备中 移除浓縮后的粒种，以及放置在用于分析的适当装备(setting)中；或 者在另一个实施例中，构建来自浓縮器的导管，其将浓縮后的物质传 递到用于分析的适当装备中。在一个实施例中，这种分析可以包括信 号采集，并且在另一个实施例中，包括数据处理器。在一个实施例中， 信号能够是光子、电流/阻抗测量值或者测量值的改变。应理解的是， 本发明的浓縮设备由于其简单性、性能、鲁棒性以及对于其它分离和 检测系统的集成性，在包括生物分析微系统的各种分析系统中非常有 用，并且任何将该设备集成到这种系统中的集成都将被认为是本发明 的一部分。
在另一个实施例中，浓縮器；或在另一个实施例中， 一个微通道 或多个微通道能被用二维检测器成像。通过将浓縮器或其部件呈现给 用于采集发射信号的适当仪器，诸如，在一些实施例中，用于采集来 自微通道的光的光学元件，可以实现对于浓縮器或其部件的成像。
在另一个实施例中，将设备耦合到分离系统中；或者在另一个实 施例中，耦合到检测系统；或者在另一个实施例中，耦合到分析系统; 或者在另一个实施例中，耦合到其结合。在另一个实施例中，将设备 耦合到照明源。
在一个实施例中，浓縮器可以是一次性的，并且在另一个实施例 中，可以是单独封装的，并且在另一个实施例中，具有l-50，000个单 独流体样本的样本装载容量。在一个实施例中，浓缩器能够被装入诸 如塑料的适当外壳中，以提供方便的和可以商用的滤盒(cartridge)或 过滤片(cassette)。在一个实施例中，浓縮器将在用于插入、导引以及 对准设备的外壳上或中具有适当的特征，以便，例如，将样本装载室 对准另一个设备中的池，其耦合到该浓縮器。例如，浓縮器可以配备 插入槽、轨道、或者其结合、或者用于经由本发明的设备自动控制浓縮工艺的其它变形。
在一个实施例中，可以使浓縮器适合于许多样本的高通过量筛 选，诸如将在蛋白质组学应用中有用的，将被本领域技术人员理解的。
在一个实施例中，将浓縮器连接到电极，电极连接到可以在另一 个实施例中与金属接点连接的电势发生器。在另一个实施例中，适当 的金属接点可以是能够连接到外部扫描/成像/电场调谐器的外部接点
片(contact patches)。
在本发明的一个实施例中，浓縮器是较大系统中的一部分，所述 较大系统包括用以激励通道内分子并且检测和采集所得到信号的仪 器。在一个实施例中，激光束可以聚焦到样本区间(sample plug)上， 在另一个实施例中，利用聚焦透镜。从多个微通道内的多个分子产生 的光信号可以通过聚焦/采集透镜来采集，并且，在另一个实施例中， 被分色镜/带通滤波器反射进光路中，在另一个实施例中，所述信号 可以被馈送入CCD (电荷耦合器件)照相机。
在另一个实施例中，激励光源能够从浓缩器的顶部通过分色镜/ 带通滤波器盒以及聚焦/采集方案。各种光学组件和设备也能够用于 该系统中，以检测诸如数字照相机、PMTs (光电倍增管)以及APDs (雪崩光电二极管)的光学信号。
在另一个实施例中，该系统还包括数据处理器d在一个实施例中， 数据处理器能够用来对来自CCD的信号进行处理，以在显示器上显 示浓縮后粒种的数字图像。在一个实施例中，数据处理器还能够分析 数字图像，以提供诸如大小统计(sizestatistics)、直方图、染色体组型、 映射、诊断学信息的特性信息，并且为了数据读出以适当形式显示该 信息。
在一个实施例中，将设备进一步修改，以包括微通道中的活性剂。 例如，并且在一个实施例中，对微通道在根据本发明的方法将截留浓 縮后分子的区域处涂上酶。根据这个方面，诸如蛋白酶的酶可以与浓 縮后的蛋白质相接触，并且消化它们。根据这个方面，本发明提供一 种用于蛋白质组分析的方法，其中，例如，将包含许多细胞多肽的样 本在微通道中浓縮，以获得许多充分提纯的多肽。在足以充分消化多肽的情况下，将多肽暴露于固定在微通道内的蛋白酶，从而生产消化 产物或肽。在另一个实施例中，然后可以将消化产物转运到下游分离 模块，在此将它们分离，并且在另一个实施例中，从这里，可以将分 离出的消化产物运送到肽分析模块。消化产物中的氨基酸序列可以被 确定并且被聚集以产生多肽的序列。在输送到肽分析模块之前，可以 将肽运送到接口连接模块，这依次可以执行一个或多个关于分离、浓 缩和/或聚焦的附加步骤。
在其它实施例中，蛋白酶包括但不限于诸如氨基肽酶、羧肽酶 和肽链内切酶(如，胰蛋白酶、糜蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、肽链内切
酶LysC、肽链内切酶GluC、肽链内切酶ArgC、肽链内切酶AspN) 的肽酶。氨基肽酶和羧肽酶在表征转译后的修改和处理事件方面是有 用的。也可以用蛋白酶的组合。在一个实施例中，利用吸附或者共价 键方法，能够将蛋白酶和/或其它酶固定在微通道表面上。在一些实 施例中，共价键固定的例子包括用诸如戊二醛、异硫氰酸盐以及溴化 氢的配位体将蛋白酶直接共价键附着(attachment)到表面上。在其它实 施例中，利用与蛋白酶特定地反应或者与本身耦合到蛋白酶的分子结 合或者反应(如，共价键地)的结合伴侣(bindingpartner)可以附着蛋 白酶。结合对可以包括以下物质细胞抑制素(Cytostatin)/木瓜蛋白酶、 valphosphanate/羧肽酶A、生物素/抗生蛋白链菌素、核黄素/核黄素结 合蛋白、抗原/抗体结合对或者其结合。
在一个实施例中，提供了从其中获得多肽的细胞的蛋白质组图 谱，对于给定样本，能够并行地和/或反复地执行浓縮从给定细胞获 得的多肽、生产消化产物以及分析消化产物以判定蛋白质序列的步 骤。能够比较来自许多不同细胞的蛋白质组图谱，以识别在这些细胞 中差异表达的多肽，并且在其它实施例中，细胞可以经受各种处置、 条件，或者被从各种源中提取出，凭借蛋白质组图谱，因而作为细胞 状态的结果细胞被产生以反映蛋白质的差异表达。
在本发明的某些实施例中，浓縮器可以包括用于将浓縮物从微通 道转运到废液池的仪器。
在一个实施例中，本发明提供规模至少达10000个浓縮器、适合
26实际屏幕的阵列结构。
在一个实施例中，可以通过利用标记蛋白或者多肽，将其以己知 的比率导入到浓縮器中并且检测浓縮的标记蛋白或者多肽来判定浓 縮效率，如下文举例说明的。在背景噪声上，信号强度能够被判定作 为时间的函数。
在一个实施例中，本发明的浓縮器可以在物理化学参数受控的条
件下，物理化学参数可以包括温度、pH值、盐浓度或者其结合。
在一个实施例中，纳米通道可以被带电凝胶或者随机纳米多孔材 料替换，其中带电的群组(group)嵌入在纳米多孔材料中。根据本发明 的这个方面，在一个实施例中，带电凝胶或者随机纳米多孔材料可以 具有相似的微孔大小。根据本发明的这个方面，空间电荷层可以产生 于带电凝胶或者随机纳米多孔材料中，如在此所描述和举例说明的， 类似于在纳米通道中所形成的，其中在纳米多孔带电凝胶或者带电材 料中感应到电场，类似于在纳米通道中所感应的。
在一个实施例中，本发明提供一种浓縮液体中感兴趣粒种的方 法，其包括利用本发明的设备。
在一个实施例中，本发明提供一种包括本发明的设备的微流体 泵，其在一个实施例中具有在10pm/sec到10mm/sec之间的液体流速。
在一个实施例中，本发明提供一种浓縮液体中感兴趣粒种的方 法，该方法包括下列步骤
将液体从源导入浓縮设备，其中所述液体包含感兴趣粒种，并且 其中所述设备包括连接到纳米通道的微通道； 感应所述纳米通道中的电场，借此离子消耗发生于所述微通道连 接到所述纳米通道的区域，并且在所述微通道内形成空间电荷 层，其给所述感兴趣粒种提供能障；以及 感应在所述微通道中的液体流动。
在一个实施例中，流动是电渗的，并且在另一个实施例中，通过 对微通道中电场的感应，在该微通道中感应电渗流动。在另一个实施 例中，流动是压力驱动的。
在一个实施例中，在薄纳米流体通道内，与通过纳米通道的全部
27离子电流相比，不能忽略由Debye层内的带相反电荷的离子 (counterion)引起的离子电流的选择性渗透部分，因此，当施加电场时 有比共离子(co-ion)更多的(来自Debye层的)带相反电荷的离子跨 越纳米通道迁移，其导致电荷(带相反电荷的离子)从阳极侧到阴极 侧的净转移(图2)。根据本发明的这个方面，靠近纳米流体通道的 离子消耗使Debye层变厚，引起其在纳米流体通道中的重叠更加明 显，加速浓度极化效应，并且如下，一步描述的，超过某一阈值A导 致具有二级动力学的电渗。
根据本发明的这个方面，来自纳米流体通道的带相反电荷的离子 消耗，和在微通道内部的大量溶液中的扩展空间电荷层的生成，阻止 了在这一区域中的共离子的迁移。在一个实施例中，控制电场(&和 4)，以平衡两种力(来自空间电荷层的阴离子排斥力对来自池的非 线性电渗流动)，用于稳定接口，其根据本发明的这个方面，在接口 截留和采集感兴趣阴离子粒种。
在一个实施例中，将相等的电压施加于微通道的阳极和阴极侧， 或者在另一个实施例中，将较大的电压施加于微通道中与阴极侧相对 照的阳极侧。在另一个实施例中，在将较大的电压施加于所述微通道 的阳极侧之前，在微通道中产生空间电荷层。
在一个实施例中，液体是溶液。在另一个实施例中，液体是悬浮 液，其在另一个实施例中是器官匀浆、细胞提取物或者血液样本。在 一个实施例中，感兴趣粒种包括蛋白质、多肽、核酸、病毒颗粒或者 其结合。在一个实施例中，感兴趣粒种是蛋白质、核酸、从细胞中分 泌或者在细胞中发现的病毒或者病毒颗粒，并且在另一个实施例中， 所述感兴趣粒种被发现为非常小的量，以致它代表低于从细胞的蛋白 质提取物中提取的蛋白质的10%。
在一个实施例中，本发明的方法和本发明的设备允许从相对大的 ( lfiL或者更大)样本容积中采集分子，并且将它们浓缩为小 OpL lnL)容积。然后，在其它实施例中，在没有牺牲由微流体生 物分子分选(sorting)/检测系统的小样本容积容量引起的整体检测灵 敏度的情况下，这种浓縮的样本能够由各种微流体系统来有效地分类、分离或者检测。
在一个实施例中，本发明的方法和浓縮设备考虑到分子的显著增 加的信号强度，以及随后正确的检测，其在另一个实施例中，考虑到，
在没有牺牲诸如较少蛋白质或者肽的微量浓縮(minute concentration) 中的分子的可检测性的情况下，更积极的分子分选和/或诸如蛋白质 的高丰度分子从样本中的移除(removal)。
在另一个实施例中，本发明的浓縮方法和用于浓縮的设备允许使 用几种非标记检测技术(例如，UV吸收)，其由于常规微流体通道 的短路径长度和小内部容积是不可能的。因此，在另一个实施例中， 结合浓縮和分子分选的本发明的浓縮方法和用于浓縮的设备，可以提 供一种用于集成微系统进行生物标志物检测、环境分析以及化学-生 物试剂检测的理想平台。
在一个实施例中，该方法还包括从设备中释放所述感兴趣粒种的 步骤。在一个实施例中，该方法还包括使感兴趣粒种经历毛细管电泳 的步骤。
毛细管电泳是一种利用分子的电泳性质和/或小毛细管中样本的 电渗流动来分离样本组分的技术。典型地，使内直径为100pm或者 更小的熔融石英毛细管充满含有电解质的缓冲溶液。将毛细管的每个 末端放置在含有电解质缓冲液的分离流体池中。将电势电压放置在多 个缓冲池中的一个中并且将第二电势电压放置在其它的缓冲池中。正 和负带电粒种在由施加到缓冲池的两个电势电压建立的电场的影响 下，将以相反的方向通过毛细管迁移。流体中每个组分的电渗流动和 电泳迁移率将决定每个流体组分的整体迁移。由于沿着分离通道壁的 壁剪应力(frictional drag)的降低，由电渗流动产生的流体流动图是平 坦的。观察到的迁移率是电渗和电泳迁移率的总和，并且观察到的速 率是电渗和电泳速率的总和。
在本发明的一个实施例中，将毛细管电泳系统微加工到设备上， 其是在此所描述的浓缩设备的一部分或者与在此所描述的浓縮设备 分离。将毛细管电泳系统微加工到设备上的方法是本领域所公知的， 并且在例如美国专利No. 6，274，089;美国专利No. 6，271，021;
29Effenhauser等，1993， Anal. Chem. 65: 2637-2642; Harrison等，1993， Science 261: 895-897; Jacobson等，1994， Anal. Chem. 66:1107-1113; andJacobson等，1994, Anal. Chem. 66: 1114-1118.中被描述。
在一个实施例中，毛细管电泳分离提供样本，其然后可以用于基 于MALDI-MS和/或基于ESI-MS/MS的蛋白质分析(参见，如，Feng 等，2000, Journal of the American Society For Mass Spectrometry 11: 94-99; Koziel， New Orleans, La. 2000; Khandurina等，1999， Analytical Chemistry 71: 1815-1819.)。
在其它实施例中，可以与本发明的浓缩器相连接的下游分离设备 包括但不限于微高效液相色谱柱，例如，反相(reverse-phase)、离子 交换以及亲和层析柱。
应理解的是，耦合到浓縮设备的下游的任何系统、设备等的精确 构造(exact configuration)应被认为是本发明的一部分，并且可以改变 该构造，以适合想要的应用。在一个实施例中，用于分离浓縮的肽、 安置在浓縮设备的下游的模块，包括分离介质和在其末端之间施加电 场的毛细管。在泵和阀门的帮助下，或者在另一个实施例中，通过施 加到毛细管的各个点的电场，能够实现分离介质在毛细管系统中的转 运并且要将被测试的样本(如，包含肽和/或部分消化的多肽的样本 带)注射入分离介质。
在另一个实施例中，当所述粒种以低于检测限值的浓度存在于所 述液体中时，该方法用于检测所述感兴趣粒种。
如下文所举例说明的(图3)，当由荧光显微镜监视时，装载进 设备的33pM绿色荧光蛋白(GFP)的溶液低于检测的限值。当监视超 过3小时时，因素(factor)的浓度达到106 108，如所描述的溶液浓度 允许检测33pM GFP，并且检测甚至更稀释的33fM GFP蛋白质溶液。
在一个实施例中，浓縮速度是快速的。如下文所举例说明的，在 一个小时内达到107倍浓度的GFP溶液。因为浓缩区间的近似容积为 大约0.5pL ( 1.5,X20pmX20pm)，那么浓縮设备通过通道泵送等 于lpL的样本液体容积并且在该容积内截留GFP。假定这次实验的 浓縮时间为 10、ec，那么平均样本流速可高达lmm/sec。
30在另一个实施例中，本发明提供一种用于控制系统中液体流动的 方法，该方法包括
将所述液体从源施加到所述系统中的泵送设备，其中，所述设备 包括连接到纳米通道的微通道，并且所述液体包含带电粒种或两性粒
禾中(amphoteric species);
感应所述纳米通道中的电场，借此，离子消耗发生于所述微通道 连接到所述纳米通道的区域，并且在所述微通道内形成空间电荷层， 其提供能障给所述感兴趣粒种；以及
感应所述微通道中的电场，借此，在所述微通道中感应电渗流动， 所述流动将所述液体进一步导入所述设备并且所述流动由所述电场 的强度控制。
控制液体流动具有在广泛领域内的大量应用，如将被本领域技术 人员所理解的。在一个实施例中，控制液体流动的方法，和/或浓縮 感兴趣粒种的方法可以在生物传感器设备中使用。在一个实施例中， 控制液体流动在生物传感器中是必要的，其中需要在微流体系统中的 到多个池以及来自多个池的样本和各种反应物的流动和混合。在另一 个实施例中，用于检测的微量感兴趣粒种的浓度是生物传感器设备的 关键要素。在一个实施例中，这些方法在检测潜伏或孢子状态的有机 体方面有特殊作用，其中有机体的检测很困难。
在其它的实施例中，在不偏离本发明的情况下，本发明的方法的 各种应用是可能的。例如，对于控制流体流动的方法，可以沉积许多 微通道以致流体流动直接导向中心池，附加的微通道可以连接到所述 中心池。根据这个方面，曾经在该池内的流体然后可以进行混合，并 且反过来，为了进一步的操作，通过第二套微通道泵送该流体到与其 连接的另一个池。能够理解的是，本发明的泵送方法对包括水和生物 流体的各种类型的流体起作用。
通过举例，本发明的浓縮和泵送方法考虑到与本发明的设备直接 相互连接的并且用于浓縮感兴趣粒种和/或泵送液体的高通过量自动 操作化验系统。发明的主题的权利要求的范围内。
实例 材料和方法
设备的制造
制造技术如所描述的(J. Han, H. G， Craighead, J. Vac. Sci Technol, A17, 2142-2147 (1999); J. Han, H. G. Craighead, Science 288， 1026-1029(2000))。使用两种反应离子蚀刻。在用标准光刻工具图案 化5-20pm宽的纳米通道后，进行第一反应离子蚀刻(RIE)蚀刻大约 lOsec，以蚀刻出40nm的纳米通道，同时第二蚀刻产生跨过纳滤膜的 两个平行的1.5拜微流体通道。制造出深度在30到70nm之间的纳 滤膜，以展示缓冲液浓度和通道深度的效应。在完成RIE蚀刻后，使 用KOH蚀刻来通过装载孔进行蚀刻。在氮化物脱模(nitride stripping) 之后进行热氧化，所述氮化物脱模提供了适当的电气绝缘。然后，利 用标准阳极结合技术，将设备的底部与Pyrex晶圆结合。
生物分子和反应物的制备
主要使用10mM pH值9.1的磷酸缓冲液(磷酸氢二钠)，补充 lOpM EDTA以防止细菌生长。成功的预浓縮被证明最好是在pH值 4.6的lOmM磷酸缓冲液的条件下。在10mM pH值3.5的醋酸缓冲 液和IXTBE缓冲液(~80mM)的条件下没有显著的预浓縮效果。
在lOmM磷酸缓冲液的条件下，在深度大于50nm的通道中没有 观察到极化效应，这主要是由于低pH值(其抑制表面离子化)或者 过高的缓冲液离子强度(在此纳滤膜由于较小的Debye长度而变为较 小选择性渗透的)。
所使用的分子和染料包括rGFP(BD bioscience, PaloAlto， CA)、 FITC-BSA(Sigma-Aldrich， St. Louis, MO)、FITC卵白蛋白(Molecular Probes ， Eugene ， OR) 、 FITC-B SA ( Sigma-Aldrich ， St. Louis ， MO)、 FITC染料(Sigma画Aldrich， St. Louis， MO)、 Mito Orange (Molecular Probes, Eugene, OR)以及lambda-DNA (500 ng/ml)。按照制造商的指令将DNA分子用YOYO-I插入染料(Molecular Probes, Eugene, OR)标记。
而且，在麻省理工学院的生物高分子实验室合成 M/2-GC￡i///-oxw(SEQ ID NO: l)(pl 4.08)肽分子并且按照下列程序 用硫醇结合(thiol conjugation)染料进行标记首先将HPLC提纯的肽 样本重构成lOmM肽浓縮溶液(O.lMpH值7.4的磷酸缓冲液)作为 原液(stock solution),然后稀释到lmM。将稀释后的原液与lOmM TCEP (Molecular Probes, Eugene, OR)和5-TMRIA染料(Molecular Probes， Eugene, OR)以1比1的比例混合。反应要求在4。C下持续 进行24小时，免受光照，在这之后，通过添加lOOmM 2-巯基乙醇 (Sigma-Aldrich， St.Louis， MO)来终止未反应的染料，并且利用具 有1 kDa截止值(cut-off)的微型透析试剂盒(Mini Dialysis Kit)，将其 透析出来。
光学检测装备
在具有附着的荧光激励光源的倒置显微镜(IX-71)上进行全部的 实验。热电冷却(thermoelectrically cooled)CCD照相机(Cooke Co.， Auburn Hill， MI)用于荧光成像。由IPLab 3.6(Scanalytics， Fairfax,
VA)来分析图像序列。自制的分压器用于给多个池分配不同的电势。 内置的100W汞灯用作光源，并且中性密度滤光片用于降低光强度并 且增加检测的动态范围。
分子浓度的量化
在图X中描绘出通道中分子浓度的量化。因为设备能够产生使 用于检测的CCD阵列饱和的样本区间，所以允许至少12%透射 (Olympus (32ND12))的中性密度滤光片被使用，具有70% NA孔径(这 是正确的吗？是)(50%透射)，以减少激励光强度。通过将光强度减 少到0.6%，监测器的动态范围得到增加，同时光致褪色速率得到降 低。
将多个通道充满3.3一和0.33一的GFP溶液，并且测量来自通道中溶液的荧光信号。仅仅在周期性曝光( lsec)期间打开照相机光 阀，以最小化所采集分子的光致褪色。
由于荧光蛋白质到壁的非特异性结合，为了防止多个蛋白质的非 特异性结合，在每次实验之前和之后，除了使用刚刚制造和充满的设 备以外，将多个芯片暴露于激光下持续足以完全熄灭(quench)剩余荧 光的时间段，以消灭后续效应(carryover effects)。
在涂覆通道中的预浓缩
为了防止在未处理硅表面上的样本吸附，应用标准polyaciyamide 涂层(S.Hjerten， J. Chromatogr. 347， 191-198(1985))。将设备涂上3-三甲氧基硅丙酯作为粘附促进剂。然后，将5%聚丙烯酰胺溶液与 0."/。VA-086光引发剂(WAKO， Richmond, VA)混合，并且从5分钟 开始暴露在UV灯下，以促使聚合。在涂覆后，设备没有显著水平的 吸附。即使聚丙烯酰胺涂覆工艺期望减少表面电势和表面电荷密度， 但是通过施加较高的操作电势能够观察到相似的电荷极化和样本截 留图案(尽管具有较低效率)。通过采用甚至更低的缓冲液离子强度 来克服较低的效率。
具有不同缓冲条件的预浓縮
为了展示设备对于不同缓冲条件的适应性，评价在不同pH值
(5-9)、不同缓冲溶液和不同名离子强度下的缓冲液浓度。如在典型 的蛋白质组学研究环境中一样，在利用直接来自设备中凝胶电泳的生 物样本执行还原、垸基化、胰蛋白酶化以及肽分离后，还利用直接来 自聚丙烯酰胺凝胶片段的提取溶液测试设备的操作。不含蛋白质但有 少量盐和小分子的提取溶液可以存在于来自样本或者电泳缓冲液
(Tris、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、甘油、二硫苏糖醇、可能的角蛋 白污染物)，来自染色法(staining)(考马斯亮蓝染色法)，和/或来自还 原和烷基化步骤(Tris(2-carboxy-ethyl)-phosphine hydrochloride、碘乙 酰胺、碳酸氢铵)的凝胶。在用20^20%甲酸进行酶钝化之后，对 胰蛋白酶化溶液(60jiL;在碳酸氢铵缓冲液中，lOngVL胰蛋白酶和/或胰蛋白酶肽(trypsin peptide))执行超声波降解提取(extraction by sonication)。在离心浓縮仪(speedvac)中采集和浓縮这种提取溶液。随 后利用200pL的lOOmM的碳酸氢铵、0.1。/。水中的三氟乙酸(TFA in water)、水和乙腈50: 50比例的两倍0.1%TFA执行超声波降解提取。 每次用来自前述步骤的提取溶液来采集和集中提取液，并且在离心浓 縮仪中将其浓縮至大约10pL。为了预浓縮步骤，用10mM磷酸缓冲 液(1: 9的比例)稀释此模拟样本溶液并且将其装载入通道中。
例1
通过电渗和电动截留的带电粒种浓縮 生物分子在设备中被有效地浓縮，该设备提供在设备通道中产生 的非线性电渗流动(比正常(normal)电渗流动更强)，其以高流速将生 物分子运送到与由设备中感应的空间电荷层产生的、该分子的能障相 结合的"截留区"。这两种现象的结合导致在设备的微流体通道内， 例如蛋白质和肽的带电生物分子的快速浓縮，在没有任何物理屏障和 反应物的情况下，浓度可以高达106 108倍。
在图1A和1B中示意性地描绘了设备的一个实施例。厚度典型 地小于50nm的一个或许多个薄纳米流体通道(1-10)连接至少两个微 流体通道(1-20)。将两个分离的电场施加到该设备，并且独立地控制， 如图1B所示。纳米流体通道中的场(A)用于产生离子消耗区和截留 阴离子生物分子的扩展空间电荷层。微流体通道中感应的切向场 (&)，在阳离子侧，其产生将来自池(1-30)的分子运送到被截留区(1-40) 的电渗流动。
在图2中示意性地描绘了设备的另一个实施例。纳米流体通道 (2-10)，连接两个微流体通道(2-20)。如所示，借助于多个电极(2-30)， 将多个电场施加到设备。纳米流体通道中的场(A)用于产生离子消耗 区和截留阴离子生物分子的扩展空间电荷层。微流体通道中感应的切 向场(尽)，在阳离子侧，其产生将来自贮样池(2-40)的分子运送到微 通道中的截留区的电渗流动。贮样池含有在流体中悬浮或溶解的样 本。图中描绘了与多个微通道连接的具有缓冲液的其它容器(2-50)，
35在此如废液池、采集装置(collection means)等的某些功能如在此所描 述的。如所描述的，利用标准光刻和反应离子蚀刻技术可以制造该设 备。通过扫描式电子显微照片来检査纳米流体通道结构的厚度和均匀 性，并且所使用的制造技术生产薄如20nm的纳米流体通道，该通道 无明显变形或者折叠(数据未显示)。纳米流体通道(~50nm的厚度)能够支持类似于发生在离子交换 膜中的选择渗透性离子电流。在这种薄纳米流体通道内，与通过纳米 通道的全部离子电流相比，不能忽视由Debye层内的带相反电荷的离 子引起的离子电流的选择渗透性部分。因此，当施加电场时，有比共 离子更多的带相反电荷的离子(来自Debye层)将跨越纳米通道迁移 (图3A)。这导致电荷(带相反电荷的离子)从阳极侧到阴极侧的净 转移(图3A)，并且由于浓度极化效应，总离子浓度将在阴极侧降低。纳米流体通道附近的离子消耗(由浓度极化引起的)将使Debye 层更厚，并且在纳米流体通道中重叠更加明显，这将加速浓度极化。 超过某一阈值A ，跨^M的离子lf3im新的、非线性状寂regime)(第 二类电动)，其先ltt离子交糊莫中已经有手隨。在该状态中(图3C)，带 相反电荷的离子/A^内米流体通道中消耗，并且在这种情况下的微流体 通道中，将在大量溶液(bulksolution)附近形成扩展空间电荷层(感应 的双电层(electrical double layer))。在这种感应的双电层内，电中性被 局部地破坏(这些电荷筛选纳米通道内固定的表面电荷)，并且正如 在Debye层中的一样，因为该区域的负电势，此区域禁止共离子(生 物分子)。当施加电场(^0的切向分量时，这种感应的移动离子层(mobile ionlayer)可能产生强的电渗流动。通过小心地控制电场(￡ 和^0， 能够平衡用于稳定接口的两种力(来自空间电荷层的阴离子排斥力对 来自池的非线性电渗流动)。该接口位于截留和采集阴离子生物分子 的地方。非线性电渗流动具有是电场的非线性函数(在这种情况下 A《)的流动速度。与正常电渗流流动(由表面Debye层电荷引36起)相比，能够产生更强的电渗流动速度(典型地要快10 100倍)。 利用了带电膜小珠(charged membrane bead)的其它展示了第二类电渗 的产生，然而这种流动在膜附近产生强烈但不可控的流动涡流(flow vertices),其用于快速混合。扩展空间电荷层处于不稳定、不均衡状 态，其在此类系统中提供混乱的或者摆动的离子转运行为。
与先前的报道相反，由于固态纳米流体电荷选择性接口产生的稳 定性，这里的电渗得到良好的控制，这也有助于浓縮的效率。
例2
通过电渗和电动截留的蛋白质浓縮 图4展示了一种用作量化通道中分子浓度的程序。所实施设备能 够产生使用于检测的CCD阵列饱和的样本区间，并且因而可以使用 中性密度滤光片。通过测量来自通道内分子的荧光信号，估计所采集 的GFP蛋白质区间的浓度。考虑到0.33(iMGFP溶液的小量检测，将 通道充满3.3|iM和0.33|iM的GFP溶液(图4C)。在分子的预浓縮 后将两种强度等级与局部强度等级比较(图4D)。
图5展示了所实施设备的稳定性和性能。在图5(A-C)中，将33pM
的GFP (绿色荧光蛋白)溶液装载到贮样池中，并且通过荧光显微镜 监视得到的被截留蛋白质峰值。蛋白质浓度稳定地维持一段扩展的时 间(数小时)，其考虑到百万以上的因子浓度。图5D和5E展示了在 大约3小时期间监视的稀释的33nM、 33pM和33fM的GFP蛋白质 溶液的浓縮。实现按照106 108因子的所实施设备中的蛋白质浓縮。 当区间浓度很高(-lpM)时采集速度降低，主要是由于在通道表面 上过量的蛋白质非特异性结合。
所实施设备中的浓缩速度很高。在一小时内实现107倍的浓度。 由于被浓縮区间的大致容积约为0.5 pL( l,5MiiiX20拜X20nm)，这意
味着所实施设备通过通道泵送大约lML的样本液体容积，并且在该容 积内截留GFP。假定本实验中的浓縮时间为 I()4秒，那么平均样本 流动速度应该高达lmm/sec，该值用正常电渗流动(第一级)不可获 得，其用本实验中所使用的场( 10V/cm)仅仅产生高达10~100—sec。通过用二级动力学的电渗的发生仅仅能够解释快速采集(和快速样本 流体泵送)。通过场(A)在微通道内产生感应的空间电荷，并且切向
场(^0使这些感应的空间电荷朝阴极池移动。因此，在该文中的预浓 縮不仅截留了分子，而且非常有效地泵送了样本液体。除了样品浓縮 之外，所实施设备可以作为微流体泵送设备，其具有比电渗(电动)
泵送更高的效率，并且与AC电动泵送相比更易于实现。
利用所实施设备评价生物分子浓縮的其它条件包括改变所使用 的缓冲液的离子强度。当缓冲液的离子强度降低时预浓缩效率得到改 善，甚至能够在10mM磷酸缓冲条件下操作。
也对改变纳米流体通道厚度，和/或缓冲液离子强度或者合成物 进行评价(数据未显示)。通常，增加纳米流体通道厚度，与为了操 作所实施设备所需要的缓冲液离子强度成反比。
此外，由于系统中的不同电场分布，改变给定设备中的纳滤膜的 大小和数量影响该设备的浓縮效率。
测试所实施设备浓縮溶液中蛋白质(图4)、合成肽(图5)、荧 光染料以及荧光微球(数据未显示)的能力。此外，当设备表面涂覆 聚丙烯酰胺高分子以防止生物分子的非特异性结合时，测试设备的操 作。在所有情况下，用作为所应用的不同条件的函数而改变的浓縮速 度，实现分子截留。
这清楚地展示了设备面向进一步集成的灵活性和适应性。只要在 用10mM的磷酸缓冲液稀释之后，甚至能够使用直接来自凝胶电泳 中胶内分解的合成溶液(其具有高离子强度并含有一些有机溶剂)。 这开辟了利用直接来自凝胶电泳的样本或者在预浓縮设备中的其它 常规提纯技术(利用离子强度缓冲液)的可能性。
例3
分析通过电渗和电动截留浓縮的蛋白质 通过移除E 育嫩关闭所实施设备中的分子截留。期望缓冲溶液會嫩 一关闭场就重建离子平衡。当关闭场时，采集到的峰值立刻分散为大约两 倍的最初峰值宽度，但是并没有观察至U进一步的分散。因此，能够由电场(电泳)魅压力驱动流动来很容易i鹏纵由所实施设备产生的好区间。 图6展示了由所实施设备采集的两种蛋白质粒种的毛细管电泳。结果f^R 所实施设备和下游分析工具的有效耦合，在这种情况下，免除了溶液毛细 管电泳。
例4
操纵缓冲条件增加空间电荷区域的稳定性 通过操纵本发明的设备中的缓冲条件可以进一步稳定空间电荷 区域(图7)。在一个实施例中，设备包括两个或者一连串的两个微 通道，其中每个由纳米通道连接。根据这个实施例，经过一段时间， 在顶部微通道(7-10)中的离子消耗导致在底部微通道(7-20)中的离子 富集，因而在底部微流体通道中的缓冲液浓度随着分离过程的延长而 增加。在一个实施例中，最接近纳米通道(7-30)的部分尤其受到影响。 随着时间，纳米流体通道的离子选择性可以变弱，并且在顶部通道中 可以产生不稳定消耗。然而，在一个实施例中，以规定的时间周期， 或者在另一个实施例中，连续地通过电渗，或者在另一个实施例中， 通过压力驱动流动，提供较低浓度的缓冲液的源是可能的。
例5
通道的特定定向能够增加空间电荷区域的稳定性 在本发明的另一个实施例中，通过在微通道(8-20)的两侧上并且 与微通道流体相通地安置纳米流体通道(8-10)，可以增强物质的预浓 縮(图8)。因为离子消耗在微通道和纳米通道之间的接口处开始， 所以当只有一个纳米通道存在于毗邻微通道的地方时，在分离能够发 生前，离子消耗必须延伸到微流体通道的整个长度。如图8所示，纳 米通道在微通道每一侧上的安置，考虑到更快速和更完全的离子消耗 (8-30)，并且在一些实施例中，考虑到更稳定的空间电荷区域。
39
权利要求
1、一种浓缩设备，其包括至少一个微通道；至少一个纳米通道；用于感应所述纳米通道中的电场的单元；用于感应所述微通道中电动或压力驱动流动的单元；以及导管，包含感兴趣粒种的液体能够通过所述导管；其中，将所述微通道连接到所述纳米通道，并且将所述导管连接到所述微通道。
2、 根据权利要求1所述的设备，借此，在将包含感兴趣粒种的 液体导入所述设备中，并且独立感应所述纳米通道和所述微通道中的 所述电场时，在所述微通道内浓縮所述感兴趣粒种。
3、 根据权利要求1所述的设备，其中，用于感应所述纳米通道 中、或者所述微通道中、或者其结合中的电场的所述装置是电压源。
4、 根据权利要求3所述的设备，其中，所述电压源施加的所述 电压在50mV到500V之间。
5、 根据权利要求3所述的设备，其中，所述电压源将相等的电 压施加于所述微通道的阳极和阴极侧。
6、 根据权利要求3所述的设备，其中，所述电压源将较大的电 压施加于所述微通道中与所述阴极侧相对照的所述阳极侧。
7、 根据权利要求1所述的设备，其中，所述微通道的宽度在 l-100^m之间。
8、 根据权利要求1所述的设备，其中，所述微通道的深度在 0,5-50拜之间。
9、 根据权利要求1所述的设备，其中，所述纳米通道的宽度在 l|im-50|jm之间。
10、 根据权利要求1所述的设备，其中，所述纳米通道的深度在 20-100纳米之间。
11、 根据权利要求1所述的设备，其中，将所述微通道的表面功 能化，以降低或增强所述感兴趣粒种关于所述表面的吸附。
12、 根据权利要求1所述的设备，其中，将所述纳米通道和/或 微通道的表面功能化，以增强或降低所述设备的操作效率。
13、 根据权利要求1所述的设备，其中，将外部的门电势施加于 所述设备的衬底，以增强或降低所述设备的操作效率。
14、 根据权利要求1所述的设备，其中，通过光刻和蚀刻工艺在 所述设备中形成所述微通道或者纳米通道或者其结合。
15、 根据权利要求1所述的设备，其中，所述设备主要由透明材 料组成。
16、 根据权利要求13所述的设备，其中，所述透明材料为Pyrex、 二氧化硅、氮化硅、石英或SU-8。
17、 根据权利要求1所述的设备，其中，将所述设备涂覆低自体 荧光材料。
18、 根据权利要求1所述的设备，其中，将所述设备耦合到分离 系统、检测系统、分析系统或者其结合。
19、 根据权利要求1所述的设备，其中，将所述设备耦合到照明源。
20、 根据权利要求1所述的设备，其中，所述设备包括多个微通 道、纳米通道或者其结合。
21、 根据权利要求20所述的设备，其中，将所述多个微通道、 纳米通道或者其结合以特定的几何结构排列。
22、 根据权利要求21所述的设备，其中，所述几何结构包括所 述微通道关于所述纳米通道的垂直定向。
23、 根据权利要求22所述的设备，其中，将每个微通道连接到 两个关于所述微通道垂直定向的纳米通道。
24、 根据权利要求20所述的设备，其中，所述设备包括每个都 连接到纳米通道的第一和第二微通道，其中在所述第一微通道中将样 本装载入缓冲悬浮液或溶液中，并且将较低浓度的所述缓冲悬浮液或 溶液装载入所述第二微通道。
25、 一种包括权利要求1所述设备的微流体泵。
26、 根据权利要求25所述的泵，其中，所述泵具有在10pm/sec 和10mm/sec之间的液体流动速度。
27、 一种包括在浓縮液体中感兴趣粒种的过程中权利要求1所述 的设备的使用的方法。
28、 一种浓縮液体中感兴趣粒种的方法，所述方法包括下列步骤 将液体从源导入浓縮设备，其中所述液体包含感兴趣粒种，并且其中所述设备包括连接到纳米通道的微通道；感应所述纳米通道中的电场，借此，离子消耗发生于其中将所述 微通道连接到所述纳米通道的区域，并且在所述微通道内形成空间电 荷层，其给所述感兴趣粒种提供能障；以及感应所述微通道中的液体流动。
29、 根据权利要求28所述的方法，其中，所述流动是电渗的。
30、 根据权利要求29所述的方法，其中，通过对所述微通道中 电场的感应，在所述微通道中感应所述电渗流动。
31、 根据权利要求28所述的方法，其中，所述流动是压力驱动的。
32、 根据权利要求28所述的方法，其中，循环地执行多个步骤。
33、 根据权利要求28所述的方法，其中，在所述纳米通道、所 述微通道或者其结合中感应电场。
34、 根据权利要求33所述的方法，其中，在所述纳米通道、或 者所述微通道或者其结合中感应的所述电场是通过将电压施加于所 述纳米通道、微通道或者其结合而实现的。
35、 根据权利要求28所述的方法，其中，将至少一个微通道连 接到至少一个纳米通道，并且关于所述纳米通道垂直定向所述至少一 个微通道。
36、 根据权利要求35所述的方法，其中，将每个微通道连接到 两个关于所述微通道垂直定向的纳米通道。
37、 根据权利要求28所述的方法，其中，第一和第二微通道中 的每个都连接到纳米通道，其中，在所述第一微通道中将样本装载入 缓冲悬浮液或溶液，并且将较低浓度的所述缓冲悬浮液或溶液装载入 所述第二微通道。
38、 根据权利要求28所述的方法，其中，所述电压在50mV到 500V之间。
39、 根据权利要求28所述的方法，其中，将相等的电压施加于 所述微通道的阳极和阴极侧。
40、 根据权利要求28所述的方法，其中，将较大的电压施加于 所述微通道中与所述阴极侧相对照的所述阳极侧。
41、 根据权利要求40所述的方法，其中，在将所述较大的电压 施加于所述微通道的所述阳极侧之前，在所述微通道中产生空间电荷 层。
42、 根据权利要求28所述的方法，其中，所述微通道的宽度在 l-100iim之间。
43、 根据权利要求28所述的方法，其中，所述微通道的深度在 0.5-50[im之间。
44、 根据权利要求28所述的方法，其中，所述纳米通道的宽度 在1(im國50(im之间。
45、 根据权利要求28所述的方法，其中，所述纳米通道的深度 在20-100纳米之间。
46、 根据权利要求28所述的方法，其中，将所述微通道的表面 功能化，以降低或增强所述感兴趣粒种关于所述表面的吸附。
47、 根据权利要求28所述的方法，其中，将所述纳米通道和/或 微通道的表面功能化，以增强或降低所述设备的操作效率。
48、 根据权利要求28所述的方法，其中，将外部的门电势施加 于所述设备的衬底，以增强或降低所述设备的操作效率。
49、 根据权利要求28所述的方法，其中，通过光刻和刻蚀工艺， 在所述设备中形成所述微通道或者纳米通道或者其结合。
50、 根据权利要求28所述的方法，其中，所述液体是悬浮液或 溶液。
51、 根据权利要求50所述的方法，其中，所述悬浮液是器官匀 浆、细胞提取物或者血液样本。
52、 根据权利要求28所述的方法，其中，所述感兴趣粒种包括 蛋白质、多肽、核酸、病毒颗粒或者其结合。
53、 根据权利要求28所述的方法，其中，所述设备主要由透明 材料组成。
54、 根据权利要求28所述的方法，其中，所述透明材料为Pyrex、 二氧化硅、氮化硅、石英或SU-8。
55、 根据权利要求28所述的方法，其中，将所述设备涂覆低自 体荧光材料。
56、 根据权利要求28所述的方法，其中，将所述设备耦合到分 离系统、检测系统、分析系统或者其结合。
57、 根据权利要求28所述的方法，其中，将所述设备耦合到照 明源。
58、 根据权利要求28所述的方法，还包括使所述感兴趣粒种经 历毛细管电泳的步骤。
59、 根据权利要求28所述的方法，还包括从所述设备中释放所 述感兴趣粒种的步骤。
60、 根据权利要求28所述的方法，其中，当所述粒种以低于检 测限值的浓度存在于所述液体中时，所述方法用于检测所述感兴趣粒 种。
61、 一种用于控制系统中液体流动的方法，所述方法包括 将所述液体从源施加于所述系统中的泵送设备，其中，所述设备包括连接到纳米通道的微通道，并且所述液体包含带电粒种或两性粒 种；感应所述纳米通道中的电场，借此，离子消耗发生于其中将所述 微通道连接到所述纳米通道的区域，并且在所述微通道内形成空间电 荷层，其给所述感兴趣粒种提供能障；以及感应所述微通道中的电场，借此，在所述微通道中感应电渗流动， 所述流动进一步将所述液体导入所述设备，并且所述流动由所述电场 的强度控制。
62、 根据权利要求61所述的方法，其中，在所述纳米通道、所 述微通道或者其结合中感应电场。
63、 根据权利要求62所述的方法，其中，在所述纳米通道、或 者所述微通道或者其结合中感应的所述电场是通过将电压施加于所 述纳米通道、微通道或者其结合而实现的。
64、 根据权利要求61所述的方法，其中，所述电压在50mV和 500V之间。
65、 根据权利要求61所述的方法，其中，将相等的电压施加于 所述微通道的阳极和阴极侧。
66、 根据权利要求61所述的方法，其中，将较大的电压施加于 所述微通道中与所述阴极侧相对照的所述阳极侧。
67、 根据权利要求66所述的方法，其中，在将所述较大的电压 施加于所述微通道的所述阳极侧之前，在所述微通道中产生空间电荷 层。
68、 根据权利要求61所述的方法，其中，所述微通道的宽度在 l-100^im之间。
69、 根据权利要求61所述的方法，其中，所述微通道的深度在 0.5-50^im之间。
70、 根据权利要求61所述的方法，其中，所述纳米通道的宽度 在lpm-50jim之间。
71、 根据权利要求61所述的方法，其中，所述纳米通道的深度在20至100纳米之间。
72、根据权利要求61所述的方法，其中，所述电渗流动具有在 500nm/sec到lmm/sec之间的速率。
全文摘要
本发明提供一种用于浓缩感兴趣粒种和/或控制设备中液体流动的设备及其使用方法。尤其，该方法利用包括连接到多个纳米通道的多个微通道的设备，通过感应纳米通道中的电场，导致在微通道和纳米通道之间的连接区域中的离子消耗，并且在微通道内形成空间电荷层，其提供对于所述感兴趣粒种的能障，这使其能够在微通道中的区域中浓缩。
文档编号G01N27/06GK101506647SQ200680009643
公开日2009年8月12日 申请日期2006年1月25日 优先权日2005年1月25日
发明者J·韩, Y-C·王 申请人:麻省理工学院