一种裂解肽的c端肽键的方法和确定肽的c端氨基酸序列的方法

专利名称：一种裂解肽的c端肽键的方法和确定肽的c端氨基酸序列的方法
技术领域：
本发明涉及裂解肽的c端的肽键的方法和确定肽的c端氨基酸序列的 方法。
相关技术
关于获自天然来源的肽或蛋白(在下文笼统地称为肽)的氨基酸序列 的信息对于研究生物学特征和功能是不可缺少的。目前，基于相应的基因
信息，即编码这些肽的基因组基因或由mRNA制备的cDNA的碱基序列， 将肽和蛋白的氨基酸序列确定为推导的氨基酸序列。或者，通过直接分析 肽的序列的方式确定蛋白质的这些氨基酸序列。在这些情形中，仍旧需要 肽的部分氨基酸序列的信息来鉴定编码肽的基因组基因或由mRNA制备 的cDNA。
通常，认为对于对肽的部分氨基酸序列的了解，肽的N端氨基酸序列 和C端氨基酸序列是有用的。例如，在从由大量mRNA制备的cDNA文 库中选择要获得的编码肽的cDNA的过程中，如果其N端氨基酸序列和C 端氨基酸序列已经确定，那么基于在两端的氨基酸序列制备核酸探针，和 使用所述探针选择要获得的cDNA是可能的。此外，通过使用基于两端的 氨基酸序列制备的寡核苷酸引物进行的PCR方法选择性地扩增要获得的 cDNA是可能的。
作为分析肽的N端氨基酸序列的方法，使用了确定通过Edman降解法 顺序降解N端氨基酸而获得的氨基酸衍生物的方法。
在另一个方面，作为分析肽的C端氨基酸序列的方法，提议了鉴定C 端氨基酸的方法，其中通过化学反应将C端氨基酸顺序降解，并且基于在 起始肽和截短的肽之间的分子量的差异确定被降解的C端氨基酸(非专利 相关文献l-3)。
非专利相关文献1公开了通过化学反应顺序降解C端氨基酸的方法。 所述方法是增加肽的C端氨基酸的选择性水解的方法，其中将干燥的肽加
热到卯。C ，并且使其与产自高浓度的五氟丙酸(CF3CF2COOH)水溶液或高 浓度的七氟丁酸(CF3CF2CF2COOH)水溶液的蒸汽反应。
非专利相关文献2和3公开了使用五氟丙酸酐((CF3CF2CO)20)的乙腈 溶液或七氟丁酸酐((CF3CF2CF2CO)20)的乙腈溶液取代高浓度的全氟链 垸酸水溶液来选择性降解C端氨基酸的方法。所述文献指出将干燥的肽与 产生自上述溶液的蒸汽在-18'C下反应，并且使所述系统避开进入由所述溶 液蒸发产生的水分子，由此防止了副反应的发生。
己经报道了这些降解C端氨基酸的常规方法，其通过在下述反应式(I) 中指出的脱水反应和在下述反应式(II)指出的反应进行。S卩，根据反应式(I) ，曾经形成具有噁唑酮环的结构，作为来自C端氨基酸的反应中间体。接 下来，通过使全氟链烷酸与所述噁唑酮环作用来获得C端氨基酸的选择性 降解反应。
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(II)
根据在所述非专利相关文献中公开的方法，除了选择性降解目标C端 氨基酸序列之外，还发生了在N端的肽的丝氨酸残基 (-NH-CH(CH20H)-CO-)的裂解，在N端的苏氨酸残基的裂解和在C端的天 冬氨酸残基的裂解。因此，存在仅选择性降解C端氨基酸序列的问题。此 外，由于N，O-酰基转移反应，其是非意欲的裂解的引发物，在丝氨酸残基 ot位置的氨基酸和(M立置的羟基之间，在苏氨酸残基a位置的氨基酸和(3羟基 (卩-OH基团)之间，C端氨基酸序列的顺序降解反应可能在所述转移反应位 点被抑制。
考虑到这些情况，专利文献l公开了在温和条件下，使用链烷酸酐如 乙酸酐和甲酰胺顺序降解肽的方法。然而，在该反应下，存在低灵敏性的 问题。
专利文献1
WO 2005/07844非专利相关文献1Tsugita，A.等，Eur. J.Biochem(欧洲生物化学杂 志).,第206巻，第691 696页，199非专利相关文献2Tsugita,A.等，Chem.Lett.(化学通讯)，第235-238 页，199非专利相关文献3Takamoto,K.等，Eur. J. Biochem.(欧洲生物化学 杂志)，第228巻，第362-372页，1995
发明公开内容 本发明待解决的问题
考虑到这些问题实施了本发明。即，证实了通过常规顺序降解方法， 新的裂解反应在确定C端氨基酸序列中提供了低灵敏性，并且本发明基于 这样的知识和性质。本发明在没有减少灵敏性，并且防止副反应的情况下，提供了裂解肽的C端的肽键的方法和确定肽的C端氨基酸序列的方法。
解决问题的方式
根据本发明裂解肽的C端的肽键的方法的特征如下
裂解肽的C端的肽键的方法，其包括下列步骤 使肽与包含醇的全卤化羧酸溶液反应，以酯化所述肽的谷氨酸残基；
和
使所述肽与链烷酸酐反应，以获得缺失了C端的肽，其中所述肽在C
端的氨基酸残基被顺序删除。
根据本发明确定肽的C端氨基酸序列的方法，其特征如下 确定肽的C端氨基酸序列的方法，其包括下列步骤 使肽与包含醇的全卤化羧酸溶液反应，以酯化所述肽的谷氨酸残基； 使所述肽与链垸酸酐反应，以获得缺失了C端的肽，其中所述肽在C
端的氨基酸残基被顺序删除；
测量所述缺失了C端的肽的分子量；和 基于所述分子量确定所述肽。
此外，根据本发明确定肽的C端氨基酸序列的方法，其特征如下 确定肽的C端氨基酸序列的方法，其包括下列步骤 使肽与包含醇的全卤化羧酸溶液反应，以酯化所述肽的谷氨酸残基； 使所述肽与链垸酸酐反应，以获得缺失了C端的肽，其中所述肽在C
端的氨基酸残基被顺序删除；
使所述肽与位点特异性的裂解剂反应，以获得来自所述缺失了C端的
肽的删除C端的肽来源的肽片段；
测量所述缺失了C端的肽来源的肽片段的分子量；和 基于所述分子量确定所述肽.
根据本发明确定由基底支持的肽的C端氨基酸序列的方法，其特征如
下
确定由基底支持的肽的C端氨基酸序列的方法，其包括下列步骤 使由基底支持的肽与包含醇的全卤化羧酸溶液反应，以酯化所述肽的 谷氨酸残基；
使所述肽与链烷酸酐反应，以获得缺失了C端的肽，其中所述肽在C 端的氨基酸残基被顺序删除；
将所述基底浸入包含位点特异性裂解剂的溶液中，以获得来自所述缺
失了C端的肽的缺失了C端的肽来源的肽片段；
测量所述缺失了C端的肽来源的肽片段的分子量；和 基于所述分子量确定所述肽。
发明效果
根据本发明，通过顺序降解在C端的肽键而裂解在N端的肽的谷氨酸残 基被谷氨酸残基的特异性酯化所抑制，由此特异性和有效地降解C端氨基 酸残基。此外，容易地确定在顺序降解中获得的缺失了C端的肽的排布和 来自所述缺失了C端的肽的肽的排布。
附图简述
图l是显示大豆胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列和用胰蛋白酶消化的消
化片段的推导的序列的图。
图2是胰蛋白酶抑制剂的48-63残基的肽片段的质量分析光谱。 图3是胰蛋白酶抑制剂的112-119残基的肽片段的质量分析光谱。 图4是胰蛋白酶抑制剂的66 -76残基的肽片段的质量分析光谱。 图5是胰蛋白酶抑制剂的31-38残基的肽片段的质量分析光谱。 图6是显示酯化反应对根据本发明的分析方法的影响的质量分析光谱
，其中(A)对应于没有进行酯化反应的结果和(B)对应于进行酯化反应的结果。
图7是显示酯化反应对根据本发明的分析方法的影响的质量分析光谱。
图8是胰蛋白酶抑制剂的在49-63残基的肽片段的质量分析光谱。
实施本发明的最佳方式
<介绍-新的裂解反应和顺序降解模式> 关于本发明，本发明人发现在温和条件下使用链烷酸酐如乙酸酐和甲
酰胺进行肽的顺序裂解反应过程中，在N端的谷氨酸残基发生未知的但特 异性的裂解反应。此外，本发明人发现这种裂解模式绝对是新的。将在下 面指出这些知识。
图6 (a)是洗脱混合物的MALDI-TOF-MS光谱，其中将进行SDS-PAGE 后包含大豆胰蛋白酶抑制剂的凝胶在6(TC浸入包含乙酸酐和甲酰胺的溶 液中达1小时，并且用胰蛋白酶消化所述凝胶，以从凝胶中获得洗脱的混 合物。如在图6(a沖所显示，在胰蛋白酶消化胰蛋白酶抑制剂的情况中， 除了对应于在第48位残基包含天冬氨酸残基的48-63残基的序列的峰，所 述序列在理论上被认为是在顺序裂解处理后，由胰蛋白酶消化裂解的，另 一个峰在约1673.69发现。基于其分子量推测该峰是对应于在胰蛋白酶抑 制剂的第49位残基包含谷氨酸残基的肽片段的峰，即在49-63残基的肽片 段(序列号26)。然而，即使将该峰与对应于48-63残基的肽片段的峰相比 较，发现对于鉴定在1673.69的峰中包含谷氨酸残基，该峰的分子量少约 18。因此，将用于确定该峰起源的该片段的MS/MS分析的结果显示在图 8中。如在图8中所清楚地显示，在N端包含氨基酸残基的片段中在比理 论分子量少18的质量位置发现峰，而在C端(y3-yll)包含精氨酸(用一个 字母R表示)的片段的组中发现理论质量的峰。
如通过这些结果所总结，发现下列
(1) 在使用链烷酸酑和甲酰胺进行的肽的常规顺序裂解中发生在谷氨 酸残基的N端的特异性裂解反应；和
(2) 在该裂解反应中获得的片段是具有比预期的氨基酸残基的分子量 少18的分子量的片段。
这些结果强烈地指出，在上述顺序裂解中获得的肽片段中，在N端包 含谷氨酸残基的肽片段被脱水。此外，强烈暗示所述谷氨酸残基被转变为 焦谷氨酸残基，其是由谷氨酸残基脱水产生的分子家族。该裂解反应和裂 解模式绝对是新的，在常规的顺序裂解反应中没有被发现。基于上述知识， 本发明在没有减少灵敏性并且有效地防止了副反应的条件下，提供裂解在 肽的C端的肽键的方法和确定肽的C端氨基酸序列的方法。
应该注意的是，在由顺序裂解反应产生的肽片段中，其中水合了包含 谷氨酸残基的肽片段的肽片段被称为水合体，并且肽片段的水合体在附图 中以具有缩写"pyr"开头的名称表示。
<根据本发明裂解在肽的c端的肽键方法的一个方面>
根据本发明裂解在肽的C端的肽键的方法，其特征在于 裂解肽的C端肽键的方法，其包括下列步骤
使肽与包含醇的全卤化羧酸溶液反应，以酯化所述肽的谷氨酸残基;
和
使所述肽与链烷酸酐反应，以获得缺失了C端的肽，其中所述肽在C 端的氨基酸残基被顺序删除。其后，将所述步骤分别称为酯化步骤和裂解 步骤。
(酯化步骤)
酯化步骤可以在溶液或基底中进行。当在支持肽的基底中进行酯化步 骤时，所述基底不受限制，只要其是可以保留(hold)肽的组合物。例如， 所述基底包括聚丙烯酰胺凝胶。所述基底当然可以是用于常规SDS-PAGE 以在第一维的方向进行电泳，和用于二维电泳的任何基底。
醇不受限制，只要其是具有能够与氨基酸残基进行酯化反应的醇式羟 基的化合物。例如，所述醇可以是具有l-5个碳原子的醇。醇的实例包括 低级醇如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇。尤其更优选甲醇。此外，醇的 除了羟基之外的其它原子不受限制，是具有各种质量的任何原子，只要其 它的原子不抑制氨基酸残基与醇的酯化反应。
任何肽可以用作本发明中的肽。所述肽可以包含分子内/分子间结合如 S_S结合，具有任何配位金属，根据氧化还原状况改变侧链，并且可以是 用磷酸酯，糖链和其它进行翻译后修饰的肽。此外，当在基底中进行所述 步骤时，所述肽不受限制，只要其可以保留在基底中。
所述全卤化羧酸可以是任何包含卤素原子如氟、氯和溴的羧酸。所述 全卤化羧酸可以具有低级碳链。全卣化羧酸的实例包括三氯乙酸、三氟乙 酸、五氟丙酸和七氟丁酸。尤其地，根据向基底的渗透性，优选三氟乙酸。
在本发明中，包含所述醇的全卤化羧酸的溶液可以包含能够将所述醇 和全卤化羧酸保持在液体状态的溶剂。例如，用于全卤化羧酸溶液的溶剂 包括水和醇。g卩，包含所述醇的全卤化羧酸的溶液可以是水溶液和醇溶液。
可以适当地调节进行酯化步骤的温度，时间，浓度和pH。
反应温度不受限制，只要所述肽没有从基底洗脱，并且可以将液相保
持在液体状态。例如，所述温度优选地在4-4(TC范围内，更优选地在20-30 。C范围内，并且尤其优选地在室温-25。C的范围内。在低于0。C的情形中， 酯化的速度会变慢，而在超过4(TC的情形中，将发生副反应如肽与全卤化 羧酸的裂解反应。
反应时间可以根据反应温度适当地改变。所述时间根据温度可以是约 6小时。在少于120分钟的情形中，谷氨酸残基与全卣化羧酸的酯化反应 将进行得不充分。在超过2天的情形中，因为样品的氧化和洗脱，背景会 变高，由此降低信号的质量。
用于酯化步骤的包含醇的全卤化羧酸的溶液的每种组成的浓度不受 限制。溶液中醇浓度优选地在5-30 ^ ％范围内，全卤化羧酸在溶液中的 浓度优选地在10-40 v/v。/。范围内。在醇浓度少于1 v/v。/。的情形中，提供给 谷氨酸的醇通过与酸的反应被消耗，由此使醇不足，而在超过60v/v。/。的 情形中，凝胶脱水并且收縮，由此阻止反应的进展。在全卤化羧酸浓度少 于lv/v。/4青形中，酸通过与醇的酯化反应被消耗，由此使催化不足，并且 超过60 v/V/。的情形中，因为发生了不必要的脱水而导致不利的作用。当 使用甲醇作为醇，三氟乙酸作为全卤化羧酸时，在包含醇的全卤化羧酸的 溶液中水、甲醇与三氟乙酸的比率优选在100 600: 150 350:300 700范围 内，更优选地在100:50:100 500:250:500范围内。
当将被保留在基底中的肽酯化时，通过在随后将基底有意用醇脱水和 收缩来以增加反应的产率后，将凝胶浸入全卤化羧酸的醇溶液中以通过使 用由全卤化羧酸与醇的反应产生的水来溶胀基底，从而提高所述试剂向肽 的递送是可能的。例如，当将甲醇用作醇，而将TFA用作全卤化羧酸时， 用甲醇进行脱水和收縮的基底可以被用在以250:500的甲醇和TFA比率包 含甲醇和TFA的溶液中，由此在室温在温和条件下数小时获得溶胀的凝 胶，并进行谷氨酸的特异性酯化反应。
在酯化步骤中，由基底支持的肽的谷氨酸残基的羧基将主要被转变成 对应于用在上述反应中的醇的酯化的衍生物(例如在甲醇的情形中，甲基 羧基)。
(裂解步骤)
在裂解步骤中，使用链烷酸酑顺序地裂解肽的肽键。通过使所述待裂 解的肽与链烷酸酐反应来将C端的肽的肽键顺序地裂解，以获得缺失了 C 端的肽，其中在C端的氨基酸残基被顺序删除。用在裂解步骤中的链烷酸 酐包括取代的或未取代的链垸酸酐，但是不包括全氟链烷酸和其酐。同时， 当使用取代的链垸酸酐时，优选使用被除了卤素之外的任何原子取代的链
烷酸酐。可以将具有约2-6个碳原子的链烷酸的对称酸酑用作链烷酸酐来 进行肽的c端羧基的活化。通过选择所述方面，可以在增加到反应温度的 情况中，确保适合的反应性。此外，可以优选地使用具有约2-4个碳原子 的链烷酸的对称酸酐。通过选择所述方面，可以减少空间位阻。此外，可 以将具有约2-6个碳原子的直链链烷酸的对称酸酐用作酸酐。此外，可以 优选使用具有约2-4个碳原子的直链链垸酸的对称酸酐。通过选择所述方 面，可以减少空间位阻。具体而言，可以使用具有2个原子的直链链烷酸 的对称酸酐，即乙酸酐。
此外，为了尝试活化在C端的羧基并且适当地排列以形成5-噁唑酮 环，优选可以将较少发生空间位阻的化合物用作链垸酸酐。在该方面，优 选使用乙酸酐。
应该注意，因为链烷酸酐将随着反应的进程而被消耗，因此需要将超 过量的链烷酸酐首先溶解在用于溶胀基底的非酸碱偶极溶剂中以抑制浓 度的减少。链烷酸酐在反应溶液中的浓度可以在1体积％到30体积°/。的范 围内，优选在10体积％到20体积％范围内。此外，反应温度可以大于或 等于5(TC，或优选大于或等于6(TC。通过选择所述方面，可以有效地进 行顺序裂解。此外，反应温度可以少于或等于IO(TC，或优选地少于或等 于8(TC。通过选择所述方面，顺序裂解可以稳定进行。此外，其可以在使 用乙酸酐的情形中反应约4-110小时。在所述情形中，可以将反应条件设 定在50。C进行110小时，在6(TC进行50-60小时，在8(TC进行24小时或 在10(TC进行4小时。可以将反应条件设定为温和条件，以及降低反应温 度，由此进一步减少副反应的发生。
另一方面，在裂解步骤中，可以将链烷酸酐溶解在非酸碱偶极溶剂如 甲酰胺中。作为非酸碱偶极溶剂，使用这样的溶剂，当温度在约50-90'C 时其能够渗透到基底中并且能够将基底保持在溶胀状态。此外，使用这样
的有机溶剂，其具有相对较小的分子大小并且优于与基底物质的亲合性。 此外，非酸碱偶极溶剂可以是这样的溶剂，其在如上提及的式(I)中所指出 的相容性异构化过程中显示能够维持烯醇体比率的高偶极性，并且优于反 应副产物的链垸酸酐溶质和链烷酸。此外,非酸碱偶极溶剂优选地在反应温 度较少挥发和蒸发。
裂解步骤可以在去除了氧的干燥气氛中进行。用于产生这样的气氛的 方法包括，例如这样的方法，其中将进行反应的系统保持在气密状态，阻 止水分和氧气从系统外部进入，在惰性气氛如干燥氮气和氩气下进行用于 反应的任何液体的引入和排出。此外，可以使用具有抗氧化作用的还原的
sulfanil基团(-SH)的化合物如DTT避免氧合作用。通过去除氧，防止甲硫 氨酸残基的硫的氧化，由此提高在测量步骤中测定分子量的精确度。
可以将反应促进剂用在裂解步骤中。促进剂包括包含氮原子的碱性芳 香环化合物，并且可以是吡啶碱或其衍生物。吡啶碱作用为质子受体。因 此，其可以快速去除将被去除的质子，伴随氨基的酰化作用。具体而言， 吡啶碱包括，例如吡啶，甲基吡啶(甲基吡啶)，卢锡啶(二甲基吡啶)，可力 丁(三甲基吡啶)，乙基甲基吡啶和二乙基吡啶(四甲基吡啶)。包含氮原子的 碱性芳香环化合物包括縮合的环氮杂芳烃。包含氮原子的双环碱性芳香环 化合物如喹啉，异喹啉和吲哚或可以将所述化合物的衍生物用作包含氮原 子的碱性芳香环化合物。此外，作为包含氮原子的碱性芳香环化合物，包 含氮原子的三环碱性芳香环化合物或所述化合物的衍生物如氮杂蒽和菲 啶，包括苯并喹啉，苯并异喹啉和aciydine。
在使用吡啶作为反应促进剂的情况中，所述浓度在1 v/v%-40 v/V/。范 围内，优选地在10 v/v%-30 v/v。/。范围内，由此确保增加在C端的顺序裂 解的速度。此外，当将基底浸入该溶液中时，可以在室温将基底浸入20 分钟，进行三次。接着，可以通过使用非酸碱极性溶剂从基底去除过量的 催化剂和水分，来达到用酸酐进行顺序裂解反应。
应该注意在裂解步骤中的反应可以通过用如水，非酸碱偶极溶剂和非 酸碱极性溶剂稀释并且去除渗透在基底中的反应剂链烷酸酐，并且降低反 应系统的温度，来终止裂解步骤中的反应。在所述情形中，可以使用不溶 解基底物质并且对链垸酸酐和非酸碱偶极溶剂具有亲和性的非酸碱极性
溶剂。在使用聚丙烯酰胺凝胶的情形中，非酸碱极性溶剂包括具有少于或 等于4个碳原子的腈如乙腈，和具有少于或等于4个碳原子的酮如丙酮。 接着，如上提及，将通过使肽与链烷酸酐反应形成的5-噁唑酮环水解， 以形成具有羧基端的化合物。该水解反应不受限制，只要其是任何公知的 方法，并且包含氮原子的碱性芳香环化合物或叔胺可以被用作催化剂。可 以将显示对非酸碱极性溶剂的高溶解性的包含氮原子的单环芳香环化合 物用作包含氮原子的碱性芳香环化合物。具体而言，优选吡啶或吡啶碱和 其他。此外，作为叔胺，使用显示与吡啶碱的碱性一样相对较弱碱性的化
合物。具体而言，优选DMAE(二甲基胺乙醇((CH3)2N-CH2CH20H)作为 叔胺。在将吡啶用作包含氮原子的碱性芳香环化合物的情况中，含量可以 在水溶液的总体积的5体积％到15体积％范围内，具体地10体积％。此 外，在使用DMAE的情形中，含量可以在水溶液总体积的1体积％到20 体积％范围内，具体地10体积％。此外，水解反应可以在超过或等于50 。C进行。在气密反应容器中进行反应的情形中，所述温度可以少于或等于 100。C。
此外，水解反应可以与用链烷酸酐形成5-噁唑酮环的反应一起进行。 在所述情形中，加入包含有机碱的水溶液，同时减少在C端的肽键的顺序 裂解反应的反应温度以终止反应。通过选择所述方面，将发生链烷酸酐的 失活和从基底中的洗脱。随后，在C端的肽键的顺序裂解反应被终止，并 且反应试剂将被失活和去除。接着，进行反应产物的水解处理，并且最终， 再次用非酸碱极性溶剂进行脱水处理。通过选择所述方面，将发生对应于 链烷酸酐的链烷酸和非酸碱偶极溶剂以及包含有机碱的水溶液的去除，并 且发生再次脱水。随后，可以容易地进行这样的处理，其与在处理中间包 括用非酸碱极性溶剂进行的洗涤和去除步骤的处理并无实质上的不同。
通过根据本发明裂解在肽的C端的肽键的方法，在酯化步骤中进行特 异性的酯化反应，以获得对应于在酯化步骤中的醇(例如甲醇)的酯化衍生 物(例如，包含甲基的化合物)。接下来，在裂解步骤中顺序裂解在C端的 肽的肽键。因为谷氨酸残基被酯化，在C端的顺序裂解反应特异性地进行， 而没有裂解在谷氨酸残基的N端的键。因此，本发明可以用于各种应用， 包括质量分析以保持反应产物的定量能力，而没有降低灵敏性，这是因为
顺序裂解反应在这样的状态中进行，即所述肽被支持在基底中，而没有将 待裂解的肽从基底中洗脱出。
4艮据本发明确定肽的C端氨基酸序列的方法的一个方面> 根据本发明确定肽的C端氨基酸序列的方法，其特征如下
确定肽的C端氨基酸序列的方法，其包括下列步骤 使肽与包含醇的全卤化羧酸溶液反应，以酯化所述肽的谷氨酸残基； 使所述肽与链烷酸酐反应，以获得缺失了C端的肽，其中所述肽在C 端的氨基酸残基被顺序删除；
测量所述缺失了C端的肽的分子量；和
基于所述分子量确定(grasp)所述肽。所述方面还包括测量缺失了 C 端的肽的分子量和基于分子量以及上述酯化步骤和裂解步骤而确定所述 肽的步骤。将这些步骤分别称为测量步骤和确定步骤。在该方面，可以以 如上提及的方式，以及如下提及的方式进行酯化步骤和裂解步骤。该方面 可以应用于具有不同分子量的任何肽，只要所述肽被支持在基底中。该方 面可以优选地用在确定具有相对低分子量的肽如待确定的C端氨基酸序 列的情形中。肽可以具有少于5000的分子量。此外，在该方面中，如下提 及的使用位点特异性裂解剂的消化步骤可以在裂解步骤和测量步骤之间 进行。
(测量步骤)
测量步骤是测量肽如缺失了 C端的肽的分子量的步骤。可以将各种测 量分子量的工具用在进行该步骤中。所述工具包括质量分析装置。例如， 可以将离子阱质谱仪，四极质谱仪，扇形磁场型质谱仪，飞行时间质谱仪 和傅里叶变换质谱计用作质量分析装置。此外，电离方法包括电雾化电离 法(ESI法)，基质辅助的激光解吸附/电离(MALDI)方法和快原子轰击电离 (FAB條。
其中，例如优选使用MALDI-TOF-MS。通过使用MALDI-TOF-MS， 可以在电离过程中减少组成肽片段的氨基酸残基的原子团(atomic family)
的部分的缺乏。此外，可以优选地进行测量相对高分子量的肽片段。此外，
甚至在将待测量的肽在基底中进行电泳，在所述基底中进行上述处理，和 接着收集并提供进行测量的情形中，可以测量相应的阴离子和阳离子二
者。因此，可以用MALDI-TOF-MS进一步满足分析的高可再现性。
在将MALDI-TOF-MS用于测量步骤的情形中，可以在 MALDI-TOF-MS的电离中分别测量将质子(H+)加到肽片段上的阳离子类 别和将质子从肽片段上去除的阴离子类别。
应该注意在测量步骤中被提供进行质量分析的肽片段的长度可以最 多在30-50氨基酸残基范围内，和20-30个氨基酸残基。随后，可以确实 地将肽片段进行电离，并且可以以高精确度进行测量。肽的分子量可以在 不超过4000的范围内，优选地在不超过3000的范围内。随后，在基于分 子量的不同鉴定相应的氨基酸如天冬酰胺残基(Asn)和天冬氨酸残基 (Asp)，以及谷氨酰胺残基(Gln)和谷氨酸残基(Glu)时，可以以高精确度区 分化学式重量具有1的差异的氨基酸残基。
(确定步骤)
所述确定步骤是基于分子量确定肽如在测量步骤中获得的缺失了 C 端的肽和原始肽的步骤。该步骤可以这样进行，比较在获自如上提及的顺 序裂解的具有不同长度的缺失了 C端的肽的分子量和原始肽的分子量之 间的差异，从而确定原始肽的C端氨基酸序列。
在根据本发明确定肽的C端氨基酸序列的方法中，将在C端氨基酸序 列中特异性进行顺序裂解，因为在N端的谷氨酸残基的裂解反应受到抑 制。获得的缺失了 C端的肽是这样的肽，其通过顺序裂解逐步在C端删除 氨基酸残基，而没有非特异性地裂解在C端之外的组成肽的氨基酸残基。 因此，C端氨基酸序列可以基于在缺失了 C端的肽和原始肽之间的分子量 差异而确定，而不用考虑其他的可能性。
<根据本发明确定肽的C端氨基酸序列的方法的其他方面> 根据本发明确定肽的C端氨基酸序列的方法的其他方面，其特征如下: 确定被基底支持的肽的C端氨基酸序列的方法，其包括下列步骤 使被基底支持的肽与包含醇的全卤化羧酸溶液反应，以酯化所述肽的
谷氨酸残基；
使所述肽与链垸酸酐反应以获得缺失了 c端的肽，其中所述肽在c
端的氨基酸残基被顺序删除；
将所述基底浸入包含位点特异性裂解剂的溶液中，以获得来自所述缺 失了 C端的肽的缺失了 C端的肽来源的肽片段；
测量所述缺失了C端的肽来源的肽片段的分子量；和
基于所述分子量确定所述肽。该方面还包括在裂解步骤和测量步骤之 间的消化步骤，以及上述的酯化步骤，裂解步骤，测量步骤和确定步骤。 该方面优选地用在确定具有相对较高分子量的肽的C端氨基酸序列的情 形中。所述分子量可以是例如在5 kDa-300 kDa的范围内。可以以如上提 及的方式，和在下面提及的方式进行在这个方面中的酯化步骤，裂解步骤， 测量步骤和鉴定步骤。
(酯化步骤)
被支持在基底的肽的酯化步骤是与如上提及的包含醇的全卤化羧酸 反应的方法。此外，可以将获得基底溶胀和试剂渗透的方法用作酯化步骤， 其中所述方法包括使全卤化羧酸的醇溶液与用醇脱水和收縮的基底反应， 从而利用由全卤化羧酸与醇的反应产生的水的步骤。通过所述方法，获得 更快速的酯化反应是可能的。
(消化步骤)
消化步骤是将支持肽的基底浸入包含位点特异性裂解剂如蛋白水解 酶的溶液中的步骤。所述步骤提供各种肽片段。其关于包含一系列反应产 物的混合物选择性地在预定氨基酸残基的结合位点裂解(perform)肽链， 在所包含一系列述反应产物的混合物中在进行了上述裂解在肽的C端的 肽键的方法后，预定数量的氨基酸残基被从原始肽的C端删去。在该情形 中，可以使用位点特异性的蛋白酶如胰蛋白酶进行相对高分子量肽链的酶 促消化。用在消化步骤中的位点特异性的裂解剂可以除了胰蛋白酶之外， 可以是具有位点特异性的其他蛋白酶，如在C端裂解谷氨酸残基的V8蛋 白酶。此外，可以使用特异性裂解C端的甲硫氨酸的酰胺键合的任何化学 试剂，如CNBr。
消化步骤在肽被支持在基底中的状态中进行。当肽或肽片段成为不能
被支持在基底的较短长度时，所述肽和/或肽片段被洗脱到用在消化步骤中 的液相。在消化步骤中获得的肽片段的混合物至少包含来自原始肽的在C 端的肽片段和来自一系列反应产物的在C端的肽片段，在所述反应产物中 预定量的在C端的氨基酸残基被删除。
(测量步骤:i
在该方面获得的肽除了原始肽和缺失了 C端的肽之外，还包含来自原
始肽的肽片段，来自缺失了 C端的肽的肽片段和在N端侧的肽片段。因
此，通过选择能够精确确定在来自原始肽的峰和来自一系列反应产物的在
c端的肽片段的峰中观察到的每个分子量的方法，在以高精确度区别来自
原始肽的在C端的肽片段和一系列反应产物的峰与来自在N端的多个肽 片段的其他峰之后，通用性可以得到进一步的提高。
在本文，如果在消化步骤中使用胰蛋白酶，组成在C端的肽片段的氨 基酸残基不包含精氨酸残基，因为该步骤在消化步骤之后进行。在另一方 面，在消化步骤中获得的其他肽片段将包含具有胍基的精氨酸残基，所述 胍基具有丰富的质子可接受性。随后，稳定来自这些成分的阳离子。像这 样，在测量步骤中，可以根据用在消化步骤中使用的位点特异性裂解剂裂 解肽的方式适当地选择测量条件。
随后，在质量分析中，与来自阳离子类别和阴离子类别的结果比较时， 在C端的肽片段和其他肽片段之间的相对强度不同于彼此。通过利用该现 象，来自在C端的肽片段的系列的峰可以在一些峰的类型中进行区分和鉴 定，如通过MALDI-TOF-MS装置测量。
来自在C端包含精氨酸残基的肽片段的峰强度在阳离子类别的质量 分析光谱中相对较高。在另一方面，不包含精氨酸残基的在C端的肽片段 包含羧基，所述羧基具有在C端给质子的能力。随后，来自在C端的肽片
段的峰强度在阴离子类别的质量分析光谱中相对较高，如通过 MALDI-TOF-MS装置所测量。像这样，可以通过利用比较MALDI-TOF-MS
中的阳离子类别的质量分析光谱和阴离子类别的质量分析光谱时出现的 相对强度的不同，来区分来自通常在C端侧包含精氨酸残基的肽片段的 峰。此外，可以容易鉴定原始肽链的峰和来自通过在C端氨基酸残基的顺 序裂解反应中获得的C端肽片段的系列的峰。
<其他的步骤>
用于裂解在肽的c端的肽键的上述方法和根据本发明确定肽的c端氨
基酸序列的方法除了上述步骤之外，还可以包括各种预处理和后处理。 (基底的脱水)
基底可以用非酸碱极性溶剂脱水，所述非酸碱极性溶剂不溶解任何组 成基底的成分如凝胶样物质，并具有与水的亲合性。通过使用该方法，即 使在脱水处理结束后，可以将待分析的肽作为分离的斑点或条带保持在基 底中。在聚丙烯酰胺作为基底时，可以将具有少于或等于4个碳原子的腈
如与水具有较大亲合性的乙腈(CH3CN)，具有少于或等于4个碳原子的酮
如丙酮用作进行脱水的非酸碱极性溶剂。此外，这些非酸碱极性溶剂比水 更容易蒸发。当所述非酸碱极性溶剂蒸发并且基底被干燥时，基底的大部 分体积减少并且基底将收縮。基底的浸入重复进行数次。例如，可以在室
温将基底块浸入三次，20分钟。
(肽的交联)
可以在进行酯化步骤前将被支持在基底的肽进行彼此交联。交联剂不 受限制，只要其在其末端具有键合基团。所述交联剂可以具有醛基，如甲 醛和戊二醛。随后，将肽交联在支持肽的基底中以形成网状结构，由此使 基底和肽缠结并且抑制肽的洗脱。在使用戊二醛作为交联剂的情况中，可
以通过将基底浸入具有1 pmol尔L到1000 nmol/pL的浓度的戊二醛水溶液 达30分钟到2小时来进行肽的交联。
(对于分子间/分子内结合和翻译后修饰的处理)
在本发明中，可以将目标肽的分子间/分子内结合和翻译后修饰的分子 家族进行处理，如降解和用适合的处理试剂进行裂解。例如，在分子间或 分子内具有目标S-S键合的肽的情形中，可以通过用还原剂还原它来裂解 S-S键合。此外，可以将通过还原S-S键合获得的SH基团用烷化剂进行进 一步处理以阻止S-S键合的再形成。
(N或O原子的保护)
在本发明中，可以保护J3-羟基(P-OH基)如丝氨酸残基和苏氨酸残基和 或s-氨基ONH2基)如赖氨酸残基，以防止在上述裂解步骤和裂解反应， 随后进行的转移反应中的肽的顺序裂解过程中的可能的N，O-酰基转移反 应。此外，可以保护e-NH2基团从而将赖氨酸残基对胰蛋白酶的敏感性一 致化，因为赖氨酸残基的天然来源的二甲基和乙酰基衍生物不受胰蛋白 酶， 一种蛋白酶的裂解。在该情形中，将赖氨酸残基转变为被保护的取代 的基团如在s-NH2基用天然来源的二甲基和乙酰基衍生物保护，由此很难 通过胰蛋白酶在N端侧发生赖氨酸残基的裂解。这些保护不受限制，只要 使用对于羟基和氨基熟知的保护基。例如，保护可以用O-乙酰化和N-乙 酰化进行保护。例如，可以这样进行上述酰化作用，从而使基底在加入小 量的链垸酸的链烷酸酐的混合物中进行搅拌。在该情形中，链烷酸酐对应 于亲电子酰化剂。此外，由于质子供体能力，链烷酸增加链烷酸酐与氨基 和羟基的反应性，由此发生N-酰化和O-酰化。所述酰化作用可以根据在 裂解步骤中进行的反应的中断而被终止。
(后处理)
可以在裂解步骤后进行去溶剂化。去溶剂化处理不受限制，并且可以 根据如上提及的基底的脱水进行。
在测量步骤前，可以将包含待测量的肽和/或肽片段的混合物进行去除 矿物质。随后，待收集和干燥的肽片段没有形成其盐，并且形成一级肽。
此外，肽链在C端的氨基酸残基的选择性裂解反应与酰化作用同时进 行，所述酰化作用通过在加热的温度下，使被保持在再溶胀的基底中的C 端的肽链与乙酸酐反应进行。具体而言，建议在肽的C端，通过以如式(I) 和(II)提及的反应途径形成5-噁唑酮环来进行肽链的C端氨基酸的顺序裂 解反应。
在进行c端氨基酸的顺序裂解反应的情况中，将包含被逐渐缺失了 c
端氨基酸的一系列反应产物的混合物和通过酰化作用保护的原始肽保持 在基底中。
将本发明的每个方面如上提及进行详细解释。将这些方面用实例进行 解释。本领域技术人员可以理解所述方面的一些修饰和修饰的方面落在本
发明的范围内。实施方案
(处理实施例1)
将具有如在

图1的上部所显示的氨基酸序列的冻干的大豆胰蛋白酶抑
制剂(序列号l)与甲醇以10mg:l mL的比率进行混合，并在5"冷却。将 6N的盐酸在5。C，在搅拌下逐滴加入混合物，以将浓度调节为0.01 N。 在16小时后，再将6N盐酸逐滴加入以调节浓度为0.01N。再过24小时 后，再将6N盐酸逐滴加入以将浓度调节为0.01N，并再搅袢3天。将等 分部分用移液管分批移出并且在真空下干燥以除去溶剂，由此获得干燥物 质1。应该注意，图1的下部显示用胰蛋白酶消化的胰蛋白酶抑制剂的推 导肽片段的N端的残基的数量及其理论分子量。
(参考例1)
将在处理实施例1中制备的干燥物质1溶解在用于聚丙烯酰胺凝胶电 泳(SDS-PAGE)的缓冲液中(50 mM的Tris-KCl (pH 6.8), 1%的2-巯基乙醇 和1% SDS)，并进行SDS-PAGE。将获得的条带切成1 mmxl mm的大小， 并且在37'C浸入1.25 ng/jiL的胰蛋白酶溶液达16小时以进行胰蛋白酶凝 胶中消化。随后，用MALDI-TOF-MS分析从凝胶中洗脱进入液相的每个 肽片段。用阳离子模式和反射极模式进行测量。将获得的结果显示在图 2-5。图2-5显示通过用胰蛋白酶消化胰蛋白酶抑制剂获得的肽片段的质量 分析光谱，其中分别地，图2对应于肽片段的48 - 63残基(序列号21)， 图3对应于肽片段的112 - 119残基(序列号22),图4对应于肽片段的66-76 残基(序列号24)和肽片段的167 - 175残基(序列号23)和图5对应于肽片 段的31 - 38残基(序列号25)。应该注意水平轴显示质量数，垂直轴显示 相对强度(图2-图7相同显示)。
如在图2-5中清楚显示，对应于甲基衍生物的峰仅在每个肽片段中具 有谷氨酸残基的肽片段中观察到(序列号21， 23和25)，所述肽片段通过在 处理实施例1中进行的胰蛋白酶消化胰蛋白酶抑制剂获得(在图2中， 1777.0432;在图4中,1225,7784;和在图5中，829.4880)。随后，发现这些
肽片段的谷氨酸残基通过处理实施例1的处理而被甲基化。(参考例2)
将对应于序列号26的肽片段，其是获自未进行处理实施例1中的处
理的一组肽片段，通过nano LC用反相柱进行分离，并且接着用MS/MS 分析获得的组分。结果显示在图8中。在N端包含谷氨酸残基的每个肽片 段的分子量和如在序列号26中所显示的肽片段的理论分子量(分别对应于 图8中的b3-bl4和序列号37-47)之间的差异是18。此外，关于整个部分 的分子量，观察到比理论值少18的峰。在综合如下提及的实施方案1的 结果后，发现在N端的谷氨酸残基被脱水形成焦谷氨酸残基。
(实施方案1)
将在处理实施例1中制备的干燥物质1溶解在用于聚丙烯酰胺凝胶电 泳(SDS-PAGE)的缓冲液中(50 mM的Tris-KCl (pH 6.8)， 1%的2-巯基乙醇 和1。/。SDS)，并进行SDS-PAGE。接着，将包含胰蛋白酶抑制剂的凝胶块 切成lmm大小的立方体，并且进行如下提及的裂解步骤处理。结果显示 在图6中。图6(a)显示未进行处理实施例1的肽片段的质量分析光谱，图 6(b)显示进行了处理实施例1的肽片段的质量分析光谱。
在图6(a)中，发现在1673.69和1805.79质量数的峰，并且所述峰分 别对应于具有如在序列号26中显示的氨基酸序列和在序列号27中显示的 氨基酸序列的水合衍生物。此外，在图6(b)中，发现质量数在1673.97和 1806.11的峰，并且分别对应于图6 (a)的氨基酸序列。如清楚地在图6中 所显示，在进行了处理实施例1中的处理的组中，如在序列号26中所显 示的氨基酸序列的脱水衍生物的峰强度显著减少。另一方面，在进行了处 理实施例1中处理的组中，如在序列号27中显示的氨基酸序列的峰强度 显著增加。在综合图2的结果后，发现在裂解步骤的处理中发生的在N端 的谷氨酸残基的裂解被谷氨酸残基的甲基化所特异性抑制。
(实施方案2)
将5吗的胰蛋白酶抑制剂(序列号l)用SDS-PAGE进行电泳并且用 CBB对条带进行染色。将染色的条带切成lmmxlmm大小的凝胶块，并
且将凝胶块浸入水甲醇TFA-500:250:500OL)的水，甲醇和TFA的溶
液中，并且在室温将其放置16小时。接着，如下提及，使凝胶块进行裂 解步骤的处理。结果显示在图7中。
如与图6(a)的结果比较所清楚显示，在裂解步骤中在N端发生的谷氨 酸残基的裂解反应被如在上述酯化步骤中所获得的谷氨酸残基的甲基化 所显著抑制。
<裂解步骤的处理>
将其用1.25pmol/jLiL的戊二醛溶液固定。接下来，将固定的凝胶块用 吡啶溶液处理，用乙腈脱水并且在6(TC浸入在甲酰胺溶液中的30%乙酸酐 溶液中达1小时。接着，在6(TC将凝胶块浸入在乙醇溶液中的10%二甲基 胺溶液达2小时以进行水解反应。随后，进行根据参考实施例l的以胰蛋 白酶消化进行的凝胶中消化，并且用MALDI-TOF-MS分析获得的胰蛋白 酶的片段。用阳离子模式和线性模式进行测量。
(关于如在每个序列号中所指出的序列)
将在说明书，权利要求和附图中公开的氨基酸序列以每个序列号列出 如下。
序列号1:大豆胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序歹U(Genbank No.lAVU，下
同)
序列号2:大豆胰蛋白酶抑制剂l-30残基的氨基酸序列。 序列号3:大豆胰蛋白酶抑制剂31-38残基的氨基酸序列 序列号4:大豆胰蛋白酶抑制剂39-47残基的氨基酸序列 序列号5:大豆胰蛋白酶抑制剂48-52残基的氨基酸序列 序列号6:大豆胰蛋白酶抑制剂53-63残基的氨基酸序列 序列号7:大豆胰蛋白酶抑制剂64-65残基的氨基酸序列 序列号8:大豆胰蛋白酶抑制剂66-76残基的氨基酸序列 序列号9:大豆胰蛋白酶抑制剂77-106残基的氨基酸序列 序列号10:大豆胰蛋白酶抑制剂107-111残基的氨基酸序列 序列号ll:大豆胰蛋白酶抑制剂112-119残基的氨基酸序列 序列号12:大豆胰蛋白酶抑制剂120-122残基的氨基酸序列 序列号13:大豆胰蛋白酶抑制剂123-132残基的氨基酸序列
序列号14:大豆胰蛋白酶抑制剂133-144残基的氨基酸序列 序列号15:大豆胰蛋白酶抑制剂145-159残基的氨基酸序列 序列号16:大豆胰蛋白酶抑制剂在160残基的氨基酸序列 序列号17:大豆胰蛋白酶抑制剂161-165残基的氨基酸序列 序列号18:大豆胰蛋白酶抑制剂166-175残基的氨基酸序列 序列号19:大豆胰蛋白酶抑制剂176-178残基的氨基酸序列 序列号20:大豆胰蛋白酶抑制剂179-181残基的氨基酸序列 序列号21:大豆胰蛋白酶抑制剂48-63残基的氨基酸序列 序列号22:大豆胰蛋白酶抑制剂112-119残基的氨基酸序列 序列号23:大豆胰蛋白酶抑制剂166-175残基的氨基酸序列 序列号24:大豆胰蛋白酶抑制剂66-76残基的氨基酸序列 序列号25:大豆胰蛋白酶抑制剂31-38残基的氨基酸序列 序列号26:大豆胰蛋白酶抑制剂49-63残基的氨基酸序列 序列号27:大豆胰蛋白酶抑制剂48-63残基的氨基酸序列 序列号28:大豆胰蛋白酶抑制剂61-63残基的氨基酸序列 序列号29:大豆胰蛋白酶抑制剂60-63残基的氨基酸序列 序列号30:大豆胰蛋白酶抑制剂59-63残基的氨基酸序列 序列号31:大豆胰蛋白酶抑制剂58-63残基的氨基酸序列 序列号32:大豆胰蛋白酶抑制剂57-63残基的氨基酸序列 序列号33:大豆胰蛋白酶抑制剂56-63残基的氨基酸序列 序列号34:大豆胰蛋白酶抑制剂55-63残基的氨基酸序列 序列号35:大豆胰蛋白酶抑制剂54-63残基的氨基酸序列 序列号36:大豆胰蛋白酶抑制剂53-63残基的氨基酸序列 序列号37:大豆胰蛋白酶抑制剂49-51残基的氨基酸序列 序列号38:大豆胰蛋白酶抑制剂49-52残基的氨基酸序列 序列号39:大豆胰蛋白酶抑制剂49-53残基的氨基酸序列 序列号40:大豆胰蛋白酶抑制剂49-54残基的氨基酸序列 序列号41:大豆胰蛋白酶抑制剂49-55残基的氨基酸序列 序列号42:大豆胰蛋白酶抑制剂49-56残基的氨基酸序列 序列号43:大豆胰蛋白酶抑制剂49-57残基的氨基酸序列
序列号44:大豆胰蛋白酶抑制剂49-58残基的氨基酸序列 序列号45:大豆胰蛋白酶抑制剂49-59残基的氨基酸序列 序列号46:大豆胰蛋白酶抑制剂49-60残基的氨基酸序列 序列号47:大豆胰蛋白酶抑制剂49-62残基的氨基酸序列
本发明用本发明的优选的实施方案进行解释。显而易见的是，尽管本 发明参考具体的实施方案进行了解释，可以在不背离本发明由权利要求所 限定的精神和范围的前提下进行对这些实施方案的各种修饰和改进。艮口， 本发明不应该被解释为受限于详细的具体实施方案和附图。
权利要求
1. 一种裂解肽的C端的肽键的方法，所述方法包括下列步骤:使肽与包含醇的全卤化羧酸溶液反应，以酯化所述肽的谷氨酸残基；和使所述肽与链烷酸酐反应，以获得缺失了C端的肽，其中所述肽在C端的氨基酸残基被顺序地删除。
2. 根据权利要求l所述的方法，其中使所述肽与包含醇的全卤化羧酸 溶液反应的所述步骤是操作(performing)被基底支持的所述肽的步骤。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述基底是聚丙烯酰胺凝胶。
4. 根据权利要求1到3任一项所述的方法，其中所述包含醇的全卤化羧 酸溶液是选自由水溶液和醇溶液组成的组的溶液。
5. 根据权利要求1到4任一项所述的方法，其中所述醇具有l-5个碳原子。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述醇是甲醇。
7. 根据权利要求1到6任一项所述的方法，其中所述全卤化羧酸选自由 三氯乙酸，三氟乙酸，五氟丙酸和七氟丁酸组成的组。
8. 根据权利要求7的方法，其中所述全卤化羧酸是三氟乙酸。
9. 根据权利要求1到8任一项所述的方法，其中所述全卤化羧酸溶液具 有100-600: 150-350: 300-700的体积比的水甲醇TFA。
10. —种确定肽的C端氨基酸序列的方法，其包括下列步骤 使肽与包含醇的全卤化羧酸溶液反应，以酯化所述肽的谷氨酸残基； 使所述肽与链垸酸酐反应，以获得缺失了C端的肽，其中所述肽在C端的氨基酸残基被顺序地删除；测量所述缺失了C端的肽的分子量;和 基于所述分子量确定所述肽。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述基于所述分子量确定所述 肽的所述步骤是基于所述肽的分子量和所述缺失了C端的肽的分子量之间 的差异确定所述肽的C端氨基酸序列的步骤。
12. —种确定肽的C端氨基酸序列的方法，其包括下列步骤 使肽与包含醇的全卤化羧酸溶液反应，以酯化所述肽的谷氨酸残基；使所述肽与链烷酸酐反应以获得缺失了c端的肽，其中所述肽在c端的氨基酸残基被顺序地删除；使所述肽与位点特异性的裂解剂反应，以获得来自所述缺失了C端的 肽的缺失了C端的肽来源的肽片段；测量所述缺失了C端的肽来源的肽片段的分子量；和基于所述分子量确定所述肽。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述位点特异性的裂解剂是选 自由胰蛋白酶，V8蛋白酶和CNBr组成的组的试剂。
14. 一种确定由基底支持的肽的C端氨基酸序列的方法，其包括下列 步骤使由基底支持的肽与包含醇的全卤化羧酸溶液反应，以酯化所述肽的 谷氨酸残基；使所述肽与链烷酸酐反应，以获得缺失了C端的肽，其中所述肽在C 端的氨基酸残基被顺序地删除；将所述基底浸入包含位点特异性裂解剂的溶液中，以获得来自所述缺 失了C端的肽的缺失了C端的肽来源的肽片段；测量所述缺失了C端的肽来源的肽片段的分子量；和基于所述分子量确定所述肽。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述基于所述分子量确定所述 肽的所述步骤是基于所述缺失了C端的肽来源的肽片段的分子量和对应于 来自于所述肽的所述肽片段的肽片段的分子量之间的差异来确定所述肽 的C端氨基酸序列的步骤。
16. 根据权利要求14或15所述的方法，其中所述包含醇的全卤化羧酸 的溶液具有150-350: 300-700的体积比的甲醇TFA。
17. 根据权利要求14到16任一项所述的方法，其中所述位点特异性裂 解剂是选自由胰蛋白酶，V8蛋白酶和CNBr组成的组的试剂。
18. 根据权利要求14到17任一项所述的方法，其中所述基底是聚丙烯 酰胺凝胶。
全文摘要
公开了下列裂解肽的C端的肽键的方法，其中所述方法在灵敏性降低上有所改善并且产生很少的副作用；和确定肽的C端氨基酸序列的方法。裂解肽的C端的肽键的方法包括下列步骤使肽与包含醇的全卤化羧酸溶液反应，以酯化肽中的谷氨酸残基；和使肽与无水链烷酸反应从而产生C端缺失的肽，其中在肽中的C端氨基酸残基被逐一删除。确定肽的C端氨基酸序列的方法包括下列步骤使肽与包含醇的全卤化羧酸溶液反应，以酯化肽中谷氨酸残基；使肽与无水链烷酸反应，从而产生C端缺失的肽，其中在肽中的C端氨基酸残基被逐一删除；确定C端缺失的肽的分子量；并且基于所述分子量确定肽。
文档编号G01N33/68GK101379402SQ20078000494
公开日2009年3月4日 申请日期2007年2月8日 优先权日2006年2月8日
发明者上条宪一, 宫崎贤司, 次田晧 申请人:日本电气株式会社