专利名称：：检测堆肥中毒莠定的免疫传感器及其制作和使用方法
技术领域：
：本发明涉及一种免疫传感器及其制备方法，还涉及免疫电泳法在有机污染物的检测分析中的应用。
背景技术：
：持久性有机污染物(POPs)是一类具有环境持久性、生物累积性、长距离迁移能力和高生物毒性的特殊污染物，它们对全球的生态环境和人类健康危害巨大，正在隐性侵蚀人类，它们具有致癌性、致突变性、致畸性、神经毒性、生殖毒性、内分泌干扰特性，致免疫功能减退特性等。2001年，在瑞典首都斯德哥尔摩签署的《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》中，首批被列入公约控制的12类有机污染物均属于有机氯化合物。有机氯化合物这类被广泛使用的有机物，能在环境中长时间存在并且具有广谱毒性。毒莠定，是一种有机氯化合物除草剂，因其功能上可以模仿植物生长素或吲哚酸激素的作用而抑制植物蛋白的合成，被广泛用于控制农田、牧场、果园及道路旁的杂草。达到一定浓度的毒莠定，可影响人类的中枢神经，损害生殖系统，并引起其他健康问题，很多国家已经限制毒莠定的使用。毒莠定在我国的使用比较广泛，而城市生活垃圾堆肥系统的处理源也很广泛，因此会涉及含有毒莠定的垃圾的处理。为了完善堆肥化的控制，有必要对堆肥过程中的毒莠定进行实时监测和分析。目前，对于毒莠定含量的测定采用较多的有液相色谱法、气相色谱法等方法，这些方法一般要求检测对象纯度很高，且检测前需要对样品进行分离，分离过程通常需要预处理，比较繁琐和耗时；此外检测仪器比较昂贵，且不便携带，不能进行实时检测。现在也有用放射性免疫分析法(RIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定毒莠定含量，但是由于RIA需要放射性元素的标记，容易对环境产生污染，并对操作人员的身体产生危害；而ELISA需要多次洗涤及试剂转移过程，分析步骤多、误差大，不便于分析系统集成化、微型化及信号适时的输出。免疫分析技术是将抗原抗体高度特异性反应与示踪物高灵敏性和精确性有机结合的一种分析技术。根据示踪物的性质不同，可采用不同的检测手段进行分析测定。酶联免疫传感器是应用免疫分析技术进行分析检测的一种很好的手段和工具，具有灵敏高效的特点，常用于标记识别的酶有辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶等。而漆酶(laccase，EC1.10.3.2)，因为可以催化空气中的氧气直接氧化分解酚类以及它们的衍生物，无须加入其它的辅助剂激活酶联免疫分析体系，因此如何结合漆酶与酶联免疫传感器各自的优势，建立一种更加方便、快速的检测方法，以实现对目标物质(例如堆肥过程中的毒莠定)的快速测定，便成为本领域改进检测分析手段的一个新的进路。
发明内容本发明旨在克服现有技术手段的不足，提供一种能有效检测堆肥中毒莠定的免疫传感器及其制备方法，还提供一种快速、简便、灵敏度高、选择性好、成本低的利用该免疫传感器对堆肥中毒莠定含量进行检测的方法。为解决上述技术问题，本发明通过将毒莠定抗体与磁性纳米颗粒交联，并运用电化学原理，提供了一种检测堆肥中毒莠定的免疫传感器，其包括碳糊电极和涂覆在碳糊电极表面的敏感物质，其特征在于所述碳糊电极包括碳棒和PVC管，碳棒内置于PVC管中，碳棒一端通过电线引出PVC管，碳棒另一端与磁体相接触，磁体与PVC管管口间填充有碳糊，涂覆在碳糊电极表面的敏感物质为毒莠定抗体-Fe304磁性纳米颗粒交联体。本发明还提供一种上述免疫传感器的制备方法，包括以下步骤(1)制作碳糊电极在PVC管中放入碳棒，紧邻碳棒一端且距PVC管管口8mm处置入磁体，形成磁性区域，再用碳糊将管口封闭，碳棒另一端通过电线引出PVC管，得到带磁性的碳糊电极；(2)碳糊电极的表面处理将上述碳糊电极表面抛光，然后用水冲洗电极表面，再依次用硝酸、丙酮、水进行超声清洗，最后再用缓冲液冲洗，自然晾干；(3)毒莠定抗体-磁性纳米颗粒交联体的制备氮气保护下，制备Fe304胶状沉淀，然后加入聚乙二醇、正硅烷乙酯、甲醇、氨丙基三甲氧基硅烷、戊二醛完成硅垸化和功能化，再将毒莠定抗体交联到Fe304磁性纳米颗粒表面制得毒莠定抗体-Fe304磁性纳米颗粒交联体；(4)毒莠定抗体-磁性纳米颗粒交联体的涂覆将上述毒莠定抗体-Fe304磁性纳米颗粒交联体滴涂在电极表面，利用顺磁性将毒莠定抗体-Fe304磁性纳米颗粒吸附在碳糊电极表面上，这样便于分离和再生，而且操作简单；滴涂后置于空气中干燥，再用缓冲液冲洗，低温贮存备用。上述步骤(3)中用到的毒莠定抗体通过以下方法制备得到将毒莠定与牛血清蛋白交联，合成人工抗原，注射入兔子体内，经2个月的培养，获得高效价的毒莠定抗血清，经提纯后得到毒莠定抗体。将毒莠定抗体与磁性纳米粒子交联固定在电极表面制得上述的免疫传感器，再利用抗原抗体之间的特异反应，在电极表面上吸引毒莠定，然后利用免疫反应标记上漆酶-毒莠定抗体(即酶标抗体)，便可进行信号识别和定量分析(见图2)。因为酶标抗体上标记的漆酶可以催化空气中的氧气直接氧化分解对苯二酚，当在电解池中加入对苯二酚后，漆酶使对苯二酚上的一个羟基失去H+，变成双键的羰基，再由电极表面提供电子使其还原，这一过程会产生可检测的响应信号达到识别目的，并根据所产生的信号的强弱对应毒莠定的含量，从而实现对毒莠定的快速测定。根据该工作原理，本发明还提供了一种利用上述免疫传感器对堆肥中的毒莠定进行检测的方法，其特征在于首先将免疫传感器用封闭液封闭30分钟;接着在37'C下将免疫传感器的感应部浸入含有毒莠定的堆肥浸出液中，使其反应30分钟；然后在室温下与漆酶-毒莠定抗体(毒莠定抗体与漆酶交联后制得)反应60分钟；最后以对苯二酚为底物，在接有三电极系统的电解池中进行检测，所述免疫传感器作为三电极系统的工作电极，利用检测到的电流变化值和线性回归方程计算毒莠定的含量；所述线性回归方程为y=(1.571±0.1048)x+(12.2283±0.1139)其中，^为电流变化值，单位是pA;x为毒莠定浓度值，单位是吗'mL";毒莠定浓度值的线性范围为0.0110Hg'm1/1，检测下限为lX10g'mL—1。本发明还考察了毒莠定的测定反应条件，发现在还原电位-0.139V下，在溶液pH值范围为4.05.0,毒莠定浓度为1Xl(T82(Vg'mU1时，电流对毒莠定的响应比较显著。最佳条件是在pH为4.6的磷酸盐缓冲溶液中，通过电流变化测定毒莠定的含量。上述线性回归方程即是在最佳测定反应条件下建立的，具体来说是用计时电流法测定出不同堆肥浸出液样品中的电流变化(如图3)，再根据电流变化曲线和各浸出液样品中毒莠定浓度的实验值，建立电流变化值与毒莠定浓度值之间的线性关系(如图4)，该线性回归方程便可作为以后毒莠定浓度计算的依据。上述三电极系统是以修饰了毒莠定抗体-Fe304磁性纳米颗粒交联体的碳糊电极(即免疫传感器，直径8mm)作为工作电极(见图1)，以饱和甘汞电极作为参比电极，以铂片电极作为对电极，所有检测工作均在室温(25°C)下完成。与现有技术相比，本发明的优点在于将毒莠定抗体与Fe304磁性纳米颗粒交联，运用电化学原理，提供了一种测定毒莠定含量的电流型免疫传感器，该免疫传感器利用了抗原抗体高度特异性反应的特点，具有高效的抗干扰能力和精确的目标物识别能力，是一种快速、简便、有效的分析手段和工具。利用本发明的免疫传感器和本发明的检测方法对毒莠定、二氯喹啉酸、吡啶、二氯吡啶酸、绿草定等进行了检测，发现对毒莠定的特异反应良好，能够有效、简便、快速地检测堆肥中毒莠定含量，检测下限达到lX10—^^mL—1，预，值与实验值的拟合度R2达到0.9782。本发明提高了毒莠定测定的灵敏性和抗干扰能力，—J以更好地应用到城市生活垃圾堆肥处理中，为城市生活垃圾堆肥控制系统中快速、低成本的毒莠定含量在线检测提供了技术支持，解决了堆肥过程控制系统中的实时在线监测问题。图1为本发明免疫传感器的结构示意图；图2为毒莠定免疫检测的机理流程图3为用计时电流法检测不同浓度的毒莠定得到的电流变化曲线图4为毒莠定含量与电流变化的线性回归图。图例说明1、电线2、PVC管3、碳棒4、磁体5、碳糊6、毒莠定抗体-Fe304磁性纳米颗粒层具体实施例方式实施例利用本发明的免疫传感器和检测方法对3组含毒莠定的堆肥浸出液待测样品进行测定，其检测步骤及检测结果如下1、免疫传感器的制备如图1所示，首先制作碳糊电极，在PVC管2中放入碳棒3，紧邻碳棒3—端且距PVC管2管口8mm处放入磁体4，形成磁性区域，再用碳糊5将管口封闭，碳棒3另一端通过电线1引出PVC管2，得到带磁性的碳糊电极；将电极表面抛光，然后用水冲洗电极表面，再依次用HN03(质量分数为50%)、丙酮、水进行超声清洗，最后再用磷酸盐缓冲液冲洗，自然晾干；然后在氮气保护下，制备Fe304胶状沉淀，加入聚乙二醇、正硅垸乙酯、甲醇、氨丙基三甲氧基硅垸、戊二醛完成硅垸化和功能化，再将毒莠定抗体交联到Fe304磁性纳米颗粒表面制得毒莠定抗体-Fe304磁性纳米颗粒交联体；最后将毒莠定抗体-Fe304磁性纳米颗粒交联体滴涂在电极表面，形成毒莠定抗体-Fe304磁性纳米颗粒层6(即感应部)，空气中干燥l小时，用磷酸盐缓冲液冲洗，去掉未固定的毒莠定抗体-Fe304磁性纳米颗粒，置于4'C贮存备用。2、堆肥条件堆料中含以下组分取样于岳麓山东侧表层以下lm处的土壤218g、稻草2600g、食堂残余物988g以及麸皮52g，堆料的碳氮比为30/1，含水率65%。对堆料混合后进行好氧堆肥40天。3、堆肥浸出液制备取上述堆肥样10g置于锥形瓶中，加入200mL蒸馏水，在37'C下振荡120min，速度200r/min，过滤后将滤液离心5min，10000r/min，上清液过滤即得到堆肥浸出液。取180ml的堆肥浸出液将其等分为三组，往每组堆肥浸出液中加入毒莠定，配制成浓度分别为0.032吗'1111;1、0.29吗'ml/1、1.22吗'mL"的三组待测样品。4、免疫反应将上述免疫传感器用含1%牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液(pH7.4)封闭30分钟；然后在37'C下将免疫传感器的感应部依次分别浸入含有毒莠定的上述三组待测样品中，每组样品反应时间为30分钟；然后在室温下将每组样品与漆酶-毒莠定抗体(毒莠定抗体与漆酶交联后制得)反应60分钟。5、毒莠定的标定在pH值为4.6的磷酸盐缓冲溶液中，并在还原电位为-0.139V的条件下，对毒莠定的标准曲线进行标定。标定过程是指将免疫传感器感应部依次分别置于含有不同浓度毒莠定的实验样品溶液中，使其进行免疫反应(反应过程与步骤4相同)。经过酶标抗体标记后加入一定浓度的对苯二酚，根据响应电流变化分别绘出每一组实验样品的电流-时间变化曲线(见图3)，并根据所有的电流-时间变化曲线和不同实验样品的毒莠定浓度，得到电流变化-毒莠定浓度关系曲线(即回归方程，见图4)。6、堆肥浸出液中毒莠定的测定经过酶标抗体标记后，往每组待测样品中加入一定量(50pM)的对苯二酚。以对苯二酚为底物，以免疫传感器(即修饰了毒莠定抗体-Fe304磁性纳米颗粒交联体的碳糊电极)为基底电极，用磷酸盐缓冲溶液调节含毒莠定的堆肥浸出液样品的pH值至4.6，釆用计时电流的方法，根据免疫传感器在还原电位-0.139V下的响应电流变化和步骤5中建立的回归方程，测定堆肥浸出液待测样品中毒莠定含量。所述的电化学测定是采用上海辰华仪器公司生产的CHI660B电化学系统与50ml电解池中的三电极系统相连接，进行控制与监测。上述3组含毒莠定的堆肥浸出液样品在用生物传感器测定后，其检测结果见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>从上述测定结果可以清楚地看出，本方法操作快速、简便，灵敏度高，选择性好，为城市生活垃圾堆肥控制系统中快速、低成本的毒莠定含量在线检测提供了技术支持。权利要求1、一种检测堆肥中毒莠定的免疫传感器，包括碳糊电极和涂覆在碳糊电极表面的敏感物质，其特征在于所述碳糊电极包括碳棒和PVC管，碳棒内置于PVC管中，碳棒一端通过电线引出PVC管，碳棒另一端与磁体相接触，磁体与PVC管管口间填充有碳糊，涂覆在碳糊电极表面的敏感物质为毒莠定抗体-Fe3O4磁性纳米颗粒交联体。2、一种权利要求1所述免疫传感器的制备方法，其特征在于首先制作一碳糊电极，在碳糊电极内置的碳棒与碳糊电极表面间放有磁体，碳糊电极内用碳糊填充封闭；将碳糊电极抛光、清洗并晾干；在氮气保护下制备Fe304胶状沉淀，然后依次加入聚乙二醇、正硅烷乙酯、甲醇、氨丙基三甲氧基硅垸、戊二醛完成硅烷化和功能化，再将毒莠定抗体交联到Fe304磁性纳米颗粒表面制得毒莠定抗体-磁性纳米颗粒交联体；将制得的毒莠定抗体-磁性纳米颗粒交联体滴涂在电极表面，干燥后用缓冲液冲洗，制得免疫传感器，低温贮存备用。3、一种用权利要求l所述免疫传感器对堆肥中的毒莠定进行检测的方法，其特征在于首先将免疫传感器用封闭液封闭，时间不少于30分钟；接着在37t下将免疫传感器的感应部浸入含有毒莠定的堆肥浸出液中使其反应，反应时间不少于30分钟；然后再在室温下与漆酶-毒莠定抗体反应，反应时间不少于60分钟；最后以对苯二酚为底物，在接有三电极系统的电解池中进行检测，所述免疫传感器作为三电极系统的工作电极，利用检测到的电流变化值和线性回归方程计算毒莠定的含量；所述线性回归方程为y=(1.571±0.1048)x+(12.2283±0.1139)其中，^为电流变化值，单位是pA;x为毒莠定浓度值，单位是^^mL";毒莠定浓度值的线性范围为0.0110吗-mL"，检测下限为1X10g-mL-'。4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述三电极系统是以修饰了毒莠定抗体-Fe304磁性纳米颗粒交联体的碳糊电极作为工作电极，以饱和甘汞电极作为参比电极，以铂片电极作为对电极。5、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述电解池中进行检测的还原电位为-0.139V，电解池溶液为pH值4.0~5.0的磷酸盐缓冲溶液。6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述电解池溶液为pH值4.6的磷酸盐缓冲溶液。全文摘要本发明公开了一种检测堆肥中毒莠定的免疫传感器及其制作和使用方法，该免疫传感器包括碳糊电极和涂覆在碳糊电极表面的毒莠定抗体-Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>磁性纳米颗粒交联体，通过利用酶联免疫技术和电化学分析手段，首先建立了电流变化与毒莠定含量的线性回归方程，根据该回归方程可以对堆肥中的毒莠定含量进行快速、灵敏地测定。本发明的方法应用到堆肥中毒莠定含量的测定，具有操作快速简便、反应灵敏、选择性好等优点，是一种能够应用于城市生活垃圾堆肥控制系统的快速、低成本的毒莠定检测技术。文档编号G01N33/561GK101315380SQ20081003175公开日2008年12月3日申请日期2008年7月14日优先权日2008年7月14日发明者长张,曾光明,婕梁,琳汤,毅章,陈立娟,黄国和申请人:湖南大学